Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из важнейших задач современной медицинской биохимии является поиск новых и совершенствование уже имеющихся путей создания эффективных препаратов для терапии целого ряда патологий, представляющих серьезную угрозу жизни населения практически всех стран мира. Среди этих патологий, часто связанных с техногенными факторами и ухудшением экологической обстановки, - поражения печени различного генеза, целый ряд онкологических заболеваний, а также патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. В настоящее время первостепенное внимание научным и медицинским сообществом уделяется поиску средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом, позволяющим снизить риск возникновения и осуществить эффективную терапию патологий, связанных с неблагоприятными факторами окружающей среды. Особое значение при этом придается снижению токсичности препаратов, увеличению их биодоступности, отсутствию врожденной или приобретенной резистентности ткани-мишени к действию препарата. К наиболее перспективным препаратам, отвечающим требованиям современной медицины, относятся растительные флаволигнаны, входящие в состав силимарина, а также антиангиогенные белки ангиостатин и эндостатин.
Рядом исследований было продемонстрировано, что флаволигнаны силимарина являются сильными антиоксидантами и способны инактивировать как свободные радикалы, так и активные формы кислорода в клетке, что во многом обусловливает их высокую гепатопротекторную и терапевтическую эффективность при лечении таких заболеваний печени, как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др. Флаволигнаны обладают также высоким потенциалом в профилактике и лечении онкологических заболеваний. Применение препаратов из расторопши пятнистой практически никогда не вызывает побочных реакций и отличается значительной терапевтической эффективностью. Тем не менее эти препараты не лишены недостатков, главными из которых являются низкая растворимость и биодоступность. Создание растворимых форм препаратов с повышенной биодоступностью и терапевтической эффективностью является актуальной задачей, решение которой находится в сфере нанотехнологий, которые могут позволить получать инъекционные формы препаратов, содержащие гидрофильный биодеградабельный носитель и гидрофобное действующее вещество.
В исследовании молекулярных механизмов биологической активности флаволигнанов силимарина в последние годы достигнут значительный прорыв, позволяющий с оптимизмом рассматривать новые стратегии борьбы с онкологическими и другими заболеваниями. Изучение путей и возможностей терапии патологий печени и подавления опухолевого процесса с помощью флаволигнанов представляет актуальную научно-практическую задачу, решение которой может внести существенный вклад в современную молекулярную медицину и клиническую онкологию.
Помимо гепатозащитных и противоопухолевых свойств растительных флаволигнанов важной составляющей частью их биологической активности является недавно открытая способность к подавлению ангиогенеза. Высокой антиангиогенной активностью обладают также пептиды ангиостатин и эндостатин, которые, как и флаволигнаны, могут быть использованы для терапии широкого спектра патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза. Ангиогенез играет ключевую роль в эмбриогенезе и представляет собой физиологический процесс, заключающийся в образовании кровеносных капилляров из предсуществующих капиллярных отростков и организации капилляров в сосудистую сеть. Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза, и, в основном, поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер. Неадекватная или несбалансированная васкуляризация является причиной многочисленных патологических состояний, приводящих к таким заболеваниям как ишемическая болезнь сердца, ретинопатия, атеросклероз и др. Очевидно, что применение антиангиогенных агентов может стать эффективным инструментом в терапии таких патологий. Особенно важную роль ангиогенез играет в процессе развития злокачественных новообразований, условием прогрессии и метастатической активности которых является привлечение кровеносных капилляров, формирующихся из предсуществующих сосудов. Антиангиогенные агенты, вызывающие деструкцию опухолевой кровеносной сети и лишающие опухоль питания и оксигенации, могут быть использованы для проведения противоопухолевой терапии. Важным инструментом повышения эффективности противоопухолевой терапии является применение антиангиогенных агентов (флаволигнанов силимарина, ангиостатина и эндостатина) в составе липосомных или полимерных наночастиц, полученных с использованием методов современной биохимии и нанобиотехнологии.
В связи с этим разработка и изучение биологической и терапевтической активности наносомных форм антиангиогенных агентов является одной из актуальных задач современной медицины, имеющих важное теоретическое и прикладное значение. Применение нанопрепаратов нового поколения может позволить разработать новые эффективные терапевтические стратегии и увеличить арсенал средств лечения различных патологий печени, онкологических заболеваний и патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза.
Исходя из этого целью данного исследования являлась разработка наносомных препаратов с флаволигнанами силимарина и антиангиогенными белками ангиостатином и эндостатином, а также сравнительное изучение их терапевтической активности и биодоступности с помощью биохимических методов.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
создать липосомную форму флаволигнанов силимарина из расторопши
пятнистой, обладающую повышенной биодоступностью;
исследовать накопление и распределение липосомной формы силимарина в
органах и тканях-мишенях экспериментальных животных;
изучить антигепатотоксическую активность липосомной формы в сравнении со
свободным силимарином;
исследовать возможность использования липосомной формы силимарина в
клинике при терапии заболеваний печени;
изучить возможность применения липосомной формы силимарина в качестве
кормовой добавки в сельском хозяйстве;
исследовать противоопухолевую и антиангиогенную активность препаратов
силимарина на культурах опухолевых и эндотелиальных клеток и в модельных
экспериментах in vivo в схемах как индивидуальной терапии, так и в сочетании с
традиционными химиопрепаратами;
изучить возможность использования липосомной формы силимарина в
комбинированной терапии химиорезистентных опухолей;
создать полимерные мицеллы на основе модифицированного поли-N-
винилпирролидона, включающие флаволигнаны силимарина и антиангиогенные
белки ангиостатин и эндостатин, и исследовать их терапевтическую
противоопухолевую активность.
Основные положения, выносимые на защиту.
Гепатозащитная и противоопухолевая активность флаволигнанов силимарина может быть существенно увеличена за счет использования их в составе липосом и полимерных мицелл.
Липосомная форма силимарина при инъекционном введении может быть эффективно использована в терапии патологий печени и злокачественных новообразований.
Применение липосомной формы силимарина в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С с умеренной степенью тяжести приводит к улучшению биохимических показателей крови и нормализации белково-синтетической функции печени.
Введение липосомной формы силимарина в качестве кормовой добавки в рацион цыплят-бройлеров вызывает положительную динамику изменения основных биохимических, физиологических и зоотехнических показателей птицы.
Комбинированное применение липосомного силимарина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином для лечения злокачественных новообразований, в том числе и химиорезистентных, позволяет добиться значительно более высокого терапевтического эффекта in vivo, чем при применении индивидуальных препаратов в режиме монотерапии.
Полимерные мицеллы, созданные на основе модифицированного поли-N-винилпирролидона и включающие антиангиогенные белки (ангиостатин, эндостатин) или флаволигнаны силимарина, обладают противоопухолевой активностью, значительно превышающей активность входящих в их состав свободных веществ.
Научная новизна работы.
Разработаны оригинальные методики, позволяющие получать наносомные формы силимарина, обладающие повышенной биодоступностью. Впервые продемонстрирована возможность применения липосомных препаратов флаволигнанов в инъекционной форме при терапии патологий печени и злокачественных новообразований. Продемонстрировано, что введение силимарина в липосомной форме способствует преимущественному накоплению препарата в тканях-мишенях его
антигепатотоксического действия (печени и селезенке), а также в опухолевой ткани и органах, пораженных метастазами.
Впервые продемонстрирована возможность применения липосомной формы силимарина для профилактики и лечения острого токсического гепатита, а также снижения токсического влияния алкоголя на печень.
Впервые продемонстрирована противоопухолевая и антиангиогенная активность липосомного силимарина в отношении линий опухолевых (LNCaP, MCF-7, НТ1080) и эндотелиальных клеток (HUVEC, АВАЕ, SVEC4-10).
В экспериментах на животных с модельными опухолями меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы линии Са755 продемонстрировано значительное увеличение терапевтической противоопухолевой эффективности действия липосомных форм флаволигнанов по сравнению со свободными препаратами. В экспериментах in vivo продемонстрирована высокая противоопухолевая и антиметастатическая активность липосомных форм флаволигнанов по сравнению со свободными препаратами в отношении модели карциномы легкого Льюис (3LL).
В экспериментах in vitro и in vivo продемонстрировано, что комбинированное применение липосомного силимарина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином для лечения злокачественных новообразований позволяет добиться значительно более высокого терапевтического эффекта, чем при применении индивидуальных препаратов в режиме монотерапии. Показана высокая эффективность комбинированной терапии препаратами липосомного силимарина и доксорубицина химиорезистентных опухолей.
Разработаны методы получения полимерных мицелл на основе поли-N-винилпирролидона, включающих антиангиогенные белки (ангиостатин, эндостатин), а также флаволигнаны силимарина и силибинин. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что противоопухолевая активность полученных препаратов значительно превышает активность входящих в их состав свободных веществ.
Практическая значимость исследования.
Разработанная липосомная форма силимарина может эффективно применяться в клинике при комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С с умеренной степенью тяжести в качестве детоксицирующего, гепатопротекторного средства, улучшающего функциональное состояние печени и способствующего поддержанию ее функций.
Разработанные наносомные препараты на основе флаволигнанов силимарина и антиангиогенных белков могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.
Применение наносомных флаволигнанов и антиангиогенных белков в виде инъекционных форм позволяет использовать их в дозах существенно ниже традиционных, что при повышении эффективности значительно снижает стоимость курса терапии.
Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей с использованием липосомного силимарина и традиционных противоопухолевых антибиотиков представляет большой практический интерес при подборе наиболее эффективных схем противоопухолевой терапии. Применение липосомной формы силимарина в комбинации с доксорубицином может оказаться эффективным средством терапии химиорезистентных опухолей.
Липосомная форма силимарина при ее введении в рацион цыплят-бройлеров оказывает положительное влияние на основные биохимические, физиологические и зоотехнические показатели, что свидетельствует о перспективности ее практического применения в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.
Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получено 14 патентов РФ на изобретение.
Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях: II Международной конференции «Молекулярная Медицина и Биобезопасность», Москва, 2005; XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006; 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary, 2006; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009; IV Международном Форуме «Интегративная медицина», Москва, 2009; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009.
Публикации: основные материалы работы изложены в 13 статьях, материалах 8 конференций, 14 патентах РФ на изобретение, 4 монографиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (305 источников). Работа иллюстрирована 38 рисунками и 23 таблицами.
