Введение к работе
Актуальность работы. Патогенез практически любого заболевания или синдрома на молекулярном уровне обязательно связан с изменениями количества или свойств определенных белков. В условиях патологии -ни изменения носят запредельный характер, то есть выходят за рамки, характерные для нормального метаболизма. Так как все белки выполняют определенные функции (ферментативные, структурные, транспоршые, регуляторные, защитные или другие), все они обладают функциональной активностью. Как резкое уменьшение, так и резкое увеличение функциональной активности белков ведет к каскадному нарушению процессов обмена, что в конечном more и проявляется в виде характерных признаков заболевания на уровне отдельных органов пли всего организма. Изменения функциональной активности белков могут бып» детерминированы совершенно разными причинами как экзо- так н эндогенного характера. Рамки, в пределах которых функциональная активность белка обеспечивает нормальное протекание обменных процессов, в свою очередь также определяются многими внешними и внутренними факторами. Наиболее отчетливо изменения функциональной активности белков проявляются в случаях наследственной патологии. В последнее время детально изучены белковые дефициты (снижения функциональной активности) при некоторых наследственных заболеваниях, в частности моногенных, когда повреждение соответствующего гена прямо определяег недостаток фермента или белка с некаталитическон функцией. При этом наиболее наглядно прослеживаются взаимосвязи между активностью гена, появлением аномального белка с нарушенной функцией, возникновением блока метаболизма и развитием вторичных нарушений, определяющих общую картину патогенеза наследственного заболевания. К настоящему времени известно около 4000 наследственных заболеваний и синдромов [McKusick, 1992], из которых только для приблизительно 200 установлены первичные изменения на генном и соответственно белковом уровне.
При большинстве наследственных заболеваний первичным звеном в патогенезе на биохимическом уровне являются структурные нарушения, которые ведут к изменению активности, свойств или количества определенного белка, чаще всего фермента. Однако, как показали исследования последних лет, изменения со стороны определенного белка не всегда является первичным результатом мутации в гене, кодирующем данный белок. В ряде случаев эти изменения имеют опосредованный характер за счет нарушения функциональной активности других белков или ферментов, которые принимают участие, например, в синтезе или созревании белка, функциональный дефицит которого определяет симптоматику заболевания.
В предлагаемой работе рассматриваются изменения, связанные с уменьшением функциональной активности белков, то есть белковые дсфишиы в широком понимании этого термина. При этом иол
функциональным лефииптом мы понимаем любые изменения со сгороны белка, коюрыс приводят к сю неспособности и полном объеме выполнять спои ф>нкцн11. Функциональный дефицит может возникать лаже в том случае, коїла, несмотря на кажущуюся нормальность формирования зрелого белка (фермента), его активности оказывается недостаточно при определенных экстремальных воздействиях на организм. Такие сі носи к*льные функциональные дефициты, коюрыс в конечном счете также могу: Си.пь іенеіичсски. эанрограмироаанными, имеют место при самой разнообразной патологии, и их коррекция яплпеїся весьма важной для рациональной терапии множеава 'заболеваний. Эмпирически функциональные дефициты корретируются введением различных природных продукюв. в чаеіносіи белков или лекарственных вепіееїв, модулирующих своіїсіва них белков.
В цретдаїасмой рабоїе исследовалась молекулярные основы двух іаболевапий. которые обусловлены, во-первых, генетическими дефектами (об і заболевания являю і ся аутосомно-реиессниными), а, во-вторых, оба заболевания связаны с дефнциюм белков плазмы крови, которые относятся к так натыкаемым Сеткам острой фазы. Речь идет о болезни Вильсона (гсіілзоленпікуіярнон дегенерации) и о наслсдеївенном дефиците ctl-антиірипсина (ul-ЛТ), при которых в плазме крови резко снижены уровни соответственно медьсодержащего гликопротеина церулоп.тазмина (ЦП) и ингибитора протеаз al-ЛТ. С целью выяснения роли патогенетической роли дефшппон проводились исследования нснаследавенных функциональных дефицитов лих белков как у человека, так и в эксперименте на животных.
Полешь Вильсона, или гепато.тентикулярная дегенерация, представляет собою іяже.тое неврологическое заболевание с сопутствующим поражением печени, при котором нарушается обмен меди и постоянно обнаруживается низкая концентрация активного ЦП в плазме крови. Несмотря на существенный прогресс в выяснении первичных звеньев, измененных при болезни Вильсона и при другом наслсдеї венном нарушении обмена меди при боле ,пн Мснксса ( к настоящему времени идентифицированы и изучены гены, измененные при данных заболеваниях), до сих пор не имеется окончательных сведений о патогенезе этих болезней на белковом уровне и более того не известны детали обменных превращений мели в организме, которые вторично страдают при этих видах патологии. Не исключено, что и некоторые другие заболевания в большей или меньшей степени связаны с неявными нарушениями обмена меди или белков, участвующих в метаболизме этого жизненноважного микроэлемента. Поэтому детальные исследования белков, участвующих в обмене меди, и в частности ЦП. в состав которого входит около 9S% общего количества меди плазмы крови, помимо выяснения механизмов патогенеза болезни Вильсона, дают возможность установить общие закономерности обмена меди в организме и роль изменений этого обмена при других видах патологии. В то же время изучение метаболизма меди позволяет раскрыть основные пути всасывания, транспорта, распределения и дегокенкацпп поноп других тяжелых металлов,
которые в ряде случаев конкурируют с ионами меди за специфические сайты связывания на белковых переносчиках.
В связи с тем, что в последнее время появились сообщения О благоприятном лечебном эффекте препаратов ЦП, в часі носі и при терапии анемии, воспалительных заболеваний, лучевых повреждений и даже стенокардии, один из разделов работы посвящен разработке промышленного способа получения препарата ЦП для диагностических и лечебных целей. Учитывая известные физиологические функции ЦП и его феноменологическое депегг.'е, разработка лечебного препарата на основе этого медьсодержащего белла является весьма актуальной задачей.
Для выяснения общих закономерностей развития патологических процессов при белковых дефицитах часть работы проведена на примере недостатка аитинротеазы плазмы крови - al-AT. Наследственные дефициты otl-AT достаточно широко распространены в популяциях человека и проявляются в виде серьезных поражений легких и печени. Анализ наследственной и ненаследственной недостаточности пою белка позволяет оптимизировать пути диагностики и специфической терапии данных состояний. Исследование проводилось на контингенте больных с легочной патологией. Па основании анализа наследственного и пепаследстпенпого дефицитов ЦП и ul-AT высказана концепция о функциональных дефицитах белков и роли этих дефицитов в патогенезе любых заболеваний.
Исследование молекулярных основ болезни Вильсона и недостатка al-AT, проявляющихся на биохимическом уровне в виде резкого снижения концентрации соответствующих белков плазмы крови, позволяет выявить общие черты и особенности патогенеза наследственных и ненаследственных функциональных белковых дефицитов. Кроме того установление закономерностей развития заболеваний при функциональных дефицитах белков дает возможность изыскивать рациональные пути терапии этих состояний, в частности открывает возможности заместительного исправления нарушений обмена.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении общих закономерностей проявления дефицита белков при наследственных заболеваниях и при других видах патологии на примерах недостаточности ЦП и al-AT, в разработке способов диагностики и подходов к лечению состояний, обусловленных недостатком функциональной активности белков, а также в выяснении некоторых механизмов нарушения обмена меди и ЦП при болезни Вильсона
Непосредственными задачами работы являлись:
1) разработка способов выделения н очистки белков, в частности ЦП
человека и экспериментальных животных, а также al-AT человека;
2) разработка способов промышленного получения препарата ЦП
человека, анализ токсикологических и фармакологических свойств
препарата;
-
изучение физико-химических свойств и структурных особенностей 1 U1 человека и животных и ul-ЛТ человека;
-
еравшпе.тьный анализ ЦП здоровою донора и больных болезнью Вильсона, моделирование биохимических нарушений, имеющих место при "«олеїни Вильсона па экспериментальных животных;
-
изучение особенностей обмена меди в эмбриогенезе и у взрослых м.тскопныющих, ;і также выяснение роли ЦП в этом процессе;
6) изучение распространенности вариантов al-AT, выявление
постелен редких мутантных аллелей, анализ взаимосвязей между
Феношпом ul-ЛТ и характером патологии.
IIhv'iiioc шичсиис и ноппзші работы определяются следующими мі імамами:
-
Изучены физико-химические свойства и особенности структурной оріаніпапии ЦП человека и ЦП экспериментального животного крысы.
-
Изучены фармакологические свойства ЦП человека и показана ,'ффекцінності» іірепараіов ЦП при репарации лучевых поражений. Усыновлена безвредность препаратов ЦП.
-
Произведен сравнительный анализ структурной организации ЦП здорового человека н больных болезнью Вильсона, показано, что оксида юноложтсльнып ЦП при данной наследеї венной патологии прукпрпо не изменен.
4. 11 .учено влияние искусственного дефицита ЦП, вызванного
цветением солей серебра, на физиологические функции экспериментального
живо і лої о. Усыновлено выраженное эмбрпотокенческос действие солей
серебра и показана возможность коррекции этого действия препаратами
Щ\. Выявлено изменение биосинтеза ЦП под влиянием солей серебра и
впраиванне ионов этою металла в синтезируемый ЦП.
-
Ра іработаньї способы синтеза аффинных сорбентов для выделения и очистки ЦП.
-
Выделен и охарактеризован ul-ЛТ человека. Исследована частота встречаемости функциональных дефицитов этого белка и изучена распространенность отдельных фенотиппчеекпх вариантов белка среди больных с легочной патологией.
8. Сформулирована концепция о роли первичных п вторичных
функциональных дефициюв белков в патогенезе заболеваний
Практическая ценное іь. Разработаны промышленные способы получения высокоочнщенных препаратов ЦП человека для диагностических целей и для лечебного применения. Проведена большая часть доклинических испытании препарата. Показана безвредность препарата ЦП и его положительный эффект при лечении лучевых поражений. Показана диагностическая значимость определения функциональной активности ЦП и ul-ЛТ при различной патологии.
Публикации. Основные результаты представленных к за;ціпе исследований опубликованы в 29 печатных работах в отечественных и международных научных журналах.
Апробация. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались на 2-ом Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров (Москва, 1972); 4-ом Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972); 3-ем Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов и белков (Киев, 1974); 3-ем Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974); 3-ей Всесоюзной конференции "Конформационные изменения биополимеров в растворе" (Тбилиси, 1975); 1-ой Всесоюзной конференции по медицинской генетике (Москва, 1975); Советско-французском симпозиуме по физико-химии белков и пептидов (Пущнно, 1975); Советско-американском симпозиуме по химии и физике белка (Рига, 1976); 3-ем Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов"( Москва, 1976); 3-ем Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров (Ленинград, 1977); 14-ом Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); 4-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979); 3-ем Всесоюзном симпозиуме по медицинской этимологии (Астрахань, 1979;; 6-ой Конференции по биохимии Прибалтийских республик и Ленинграда (Юрмала, 1981); 4-ом Всесоюзном съезде общества генетиком и селекционеров им. Вавилова (Кишинев, 1982); 1-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Москва, 1983); 16-ой Конференции ФЕБО (Москва, 1983); Научной конференции Биохимия -Медицине" (Ленинград, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Проблемы изучения наследственности человека на уровне продуктов генной экспрессии" (Москва, 1989); 2-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990). Тезисы сообщений опубликованы в материалах съездов, конференций и симпозиумов.
На защиту выносятся следующие положения:
1) Доказано, что оксидазоположнтельные ЦП здорового человека и
больных болезнью Вильсона аруктурно идентичны. Дефицит ЦП при
болезни Вильсона носнт вторичный характер. По крайней мере одна из
функции ЦП заключается в межорганном транспорте ионов меди.
-
Разработаны способы получения препаратов ЦП в качестве лечебных средств, получены данные о фармакологических свойствах данного медьтранснортного гликопротеида. Показана перспективность применения препаратов ЦП при некоторых видах патологии.
-
Установлены некоторые узловые моменты транспорта меди в организме и гомеостази меди.
4) Высказано предположение о роли ЦП в механизмах дегоксикацни
ионов хяжелых мегалчов.
5) Показана диагностическая н прогностическая значимость
определения функциональной активности и фенотипическнх вариантов al-
Л'І при воспалительных заболеваниях легких.
6.» Предложена концепция о роли функциональных дефицитов белков н на Ю1 енезе заболеваний.
Орукпра диссертации. Диссертация изложена на 300 машинописных страницах, состоит из следующих разделов: введения, двух основных глав, посвященных роли ЦП и ol-ЛТ при различной патологии, заключения и выводов. Список цитированных литературных источников включает 253 рабоп.і. Диссертация содержит 29 таблиц и 44 рис\нка.
