Введение к работе
Актуальность темы. Вирус иммунодефицита человека первого типа является возбудителем опасного инфекционного заболевания - синдрома приобретенного иммунодефицита. В XXI веке распространение этого заболевания имеет характер пандемии. Уже с первых дней глобальной пандемии затрачиваются большие усилия для контроля прогрессирующего, вирус-индуцированного разрушения иммунной системы организма пациентов со СПИДом. Единственным доступным на сегодняшний день видом лечения является высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ). Однако, несмотря на то, что ВААРТ является триумфом современной медицины, его эффективность ограничивается высокой стоимостью, многочисленными побочными эффектами, необходимостью пожизненного применения без перерывов и, что главное, не полным восстановлением иммунной системы (Llibre et al., 2009). Дисфункция иммунной системы у пациентов, прошедших ВААРТ, ассоциирована с повышенным риском развития оппортунистических инфекционных заболеваний, раковых заболеваний, заболеваний почек и печени, ранним старением (Deeks and Phillips, 2009).
В настоящее время, когда число людей, инфицированных ВИЧ-1, в мире
превысило 39 миллионов, остро необходимы новые, эффективные,
нетоксические терапевтические подходы для борьбы с заболеванием.
Терапевтические вакцины против ВИЧ-1 представляют многообещающую
стратегию, способную эффективно дополнить применяемые сейчас
антиретровирусные препараты. Предполагается, что использование в качестве
антигенов белков ВИЧ-1, отвечающих за иммуносупрессию и развитие СПИДа,
даже у пациентов, прошедших ВААРТ, приведет к восстановлению
нормального функционирования защитных систем организма. При этом
присутствие на данных антигенах эпитопов для
нейтрализующих/ингибирующих антител дополнительно уменьшит горизонтальную и вертикальную передачу вируса за счет выработки антител на слизистых оболочках. Все это уменьшит ВИЧ-1 ассоциированный вред, наносимый иммунной системе, и позволит обеспечить длительные перерывы между курсами ВААРТ.
Исследования последних лет показали, что матриксный белок р17 ВИЧ-1 является ключевым фактором иммунопатогенеза СПИДа, играющим важнейшую роль во всех этапах развития вируса и прогрессии заболевания.
Взаимодействие матриксного белка со своим рецептором-сиротой, экспрессирующимся практически на всех клетках иммунной системы, приводит к дерегуляции иммунной системы человека и созданию воспалительного микроокружения клеток, благоприятствующего размножение ВИЧ-1.
Связывание моноклональных антител против некоторых эпитопов белка р17 с поверхностью ВИЧ-1 инфицированных клеток приводит к уменьшению инфекционности вируса, то есть к уменьшению продуцирования вирусных частиц инфицированными клетками. Кроме этого, антитела к некоторым эпитопам матриксного белка обладают прямой вирус-нейтрализующей активностью, ингибируя инфицирование чувствительных клеточных линий после взаимодействия с вирионами.
Клинические исследования показали, что наличие высокого уровня антител к белку р17 коррелирует с медленным развитием СПИДа и, наоборот, уровень антител к р17 сильно падает при переходе от бессимптомного течения инфекции к СПИДу.
Из вышеизложенного, следует, что выработка антител на белок р17 и его функционально значимые мотивы может уменьшить негативное влияние ВИЧ-1 на иммунную систему, способствовать восстановлению нормального функционирования защитных систем организма и уменьшить горизонтальную и вертикальную передачу вируса за счет выработки антител на слизистых оболочках.
Цель работы заключается в получении, очистке и изучении биохимических и иммунологических свойств белка р17 российского изолята ВИЧ-1 субтипа А и создании на его основе препарата иммуногена с перспективой его последующего использования в составе вакцины против ВИЧ.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Создать штамм-продуцент белка р17 ВИЧ-1 субтипа А с высоким уровнем его экспрессии.
Разработать метод очистки рекомбинантного белка р17 из клеточных лизатов.
Исследовать биохимические и иммунологические свойства рекомбинантного белка р 17.
Изучить системный и местный иммунный ответ на созданный иммуноген. Научная новизна работы. Впервые создан штамм Е. coli суперпродуцент
рекомбинантного белка р17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята и проведено
детальное изучение биохимических и иммунологических свойств белка, полученного в прокариотической системе экспрессии. Обнаружено, что использование GC-богатого модифицированного гена р17 приводит к 40% увеличению его экспрессии в клетках Е. coli по сравнению с нативным геном. Показано, что данный эффект ассоциирован с увеличением термодинамической стабильности целевой мРНК и с повышением ее относительного содержания в клетках E.coli. Разработан эффективный способ одностадийной очистки рекомбинантного белка р17 из клеточного лизата с выходом 38 мг/л.
Впервые показано, что использование интерлейкина-ір в качестве адъюванта при подкожной иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным белком р17 приводит к достоверному увеличению титра специфических антител класса G к слабоиммуногенным, функционально значимым эпитопам белка р1710"30 и р17 " . Обнаружено, что интраназальная иммунизация рекомбинантным белком р17 ВИЧ-1 субтипа А в сочетании с рекомбинантным ИЛ-ір является эффективным способом индукции местного гуморального иммунитета на всех слизистых оболочках мыши, однако, при этом практически не индуцируются системные антитела класса G.
Показано, что при интраназальной иммунизации белок р17 ВИЧ-1 субтипа А не обладает не специфическим иммуносупрессивным действием, а наблюдаемый эффект слабого индуцирования антител IgG при мукозальном введении, вероятно, связан с не достаточной абсорбцией белка или его физическим выведением со слизистой оболочки за счет взаимодействия с гепаран-сульфат протеогликанами.
Обнаружено, что наиболее эффективной схемой иммунизации рекомбинантным белком р17 ВИЧ-1 субтипа А для индуцирования как высокого уровня системного поствакцинального иммунитета, так и местного мукозального иммунного ответа, является первичная однократная парентеральная и последующая двукратная интраназальная вакцинация. Данный вариант позволяет получить высокие уровни IgA к р17 на слизистых оболочках и напряженность поствакцинального системного иммунитета сопоставимую с таковой при только парентеральном введении иммуногена.
Теоретическое и практическое значение работы. Разработана эффективная технология получения рекомбинантного белка р17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята, которая может быть использована при крупномасштабном производстве. Очищенный рекомбинантный белок р17 может быть использован
в качестве терапевтической вакцины против ВИЧ/СПИДа, в составе тест-систем для выявления ВИЧ/СПИДа, для изучения различных функций белка р17.
Показано, что эффективным способом увеличения экспрессии вирусного гена р17 ВИЧ-1 субтипа А в клетках Е. coli является использование GC-богатого модифицированного варианта гена.
Показано, что для слабоиммуногенных эпитопов белка р17, каковыми являются фрагменты белка р17 " и р17 , использование интерлейкина-1Р в качестве адъюванта позволило достоверно увеличить титр специфических антител класса G при подкожном введении.
Разработана эффективная схема иммунизации рекомбинантным белком р17 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята (однократное парентеральное праймирование белком р17 совместно с ИЛ-іри последующие двукратное интраназальное бустирование р17+ИЛ-1Р) для индукции высоких уровней IgA к р17 на всех слизистых оболочках и для индукции высоких уровней IgG в системном кровотоке. Полученная схема вакцинации может быть использована в доклинических и клинических испытаниях терапевтической вакцины против ВИЧ/СПИДа на основе рекомбинантного белка р17.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 17-й и 18-й международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2008, 2009), на рабочем совещании по рассмотрению хода выполнения распоряжения Правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-р (Новосибирск, 2009), а также на заседаниях кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета и научных семинарах лаборатории молекулярной вирусологии ГосНИИ «Особо чистых биопрепаратов» ФМБА России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ: 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК; 2 патента на изобретение (1 патент и 1 заявка на патент с выданным решением о выдаче патента); 4 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 рисунками, содержит 7 таблиц и 2 приложения. Список литературы содержит 262 литературных источников.
