Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Циклодекстрипы 13
История открытия циклодекстринов 13
Строение циклодекстринов 16
Физико-химические свойства циклодекстринов 19
Биодоступность и биологическое действие циклодекстринов 23
1.2. Получение циклодекстринов 27
Технологии получения ЦД 27
Циклодекстриногенные бактерии - продуценты
циклодекстринглкжанотрансфераз 30
1.2.3.Реакции, катализируемые циклодекстринглюканотрансферазой 33
1.3. Применение циклодекстринов 35
Применение циклодекстринов в пищевой промышленности 36
Применение циклодекстринов в косметической промышленности 40
Циклодекстрины как модели ферментов 41
Применение циклодекстринов в медицинской,
фармацевтической промышленности 41
Применение циклодекстринов в химической промышленности 43
Применение циклодекстринов в сельском хозяйстве 44
Циклодекстрины и экологическая биотехнология 45
Использование циклодекстринов для удаления
холестерина из продуктов питания 45
1.3.9. Комплексы включения Р-циклодекстрина с витаминами 46
1.4. Получение комплексов включения циклодекстринов 49
Процесс комплексообразования с цикло декстринам и 49
Получение комплексов в водных растворах ЦД 52
Влияние химической модификации на свойства циклодекстринов 57
Нерастворимые полимеры на основе ЦД 61
1.5. Витамины 61
1.5.1. Витамин Е 63
Строение витаминов группы Е 63
Биологическая активность витаминов группы Е 64
Физико-химические и химические свойства
DL-a-токоферола ацетата 66
1.5.2. Рибофлавин 67
Строение рибофлавина и его производных 67
Биологическая активность рибофлавина 68
Физико-химические свойства витамина В2 69
1.6. Подходы к реализации принципов обогащения пищевых продуктов 70
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 74
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 74
Материалы исследований 74
Методы исследований 77
2.1.2.1. Методы, используемые при скрининге
Р-ЦГТ-активных штаммов микроорганизмов 77
2.1.2.1.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов
из природных мест обитания 77
Метод выделения чистых культур микроорганизмов 79
Определение морфологических признаков бактерий 80
Определение физиолого-биохимических признаков 81
2.1.2.1.4.1. Изучение способности утилизировать
углеводы и сахаро-спирты 82
Анализ на анаэробный рост и выделение кислоты 82
Образование ацетилметилкарбинола
(реакция Фогес-Проскауэра) 83
2.1.2.1.4.4. Восстановление нитратов 83
Рост на синтетической среде 84
Рост на среде при концентрации NaCl 7% 85
Рост культуры при различных температурах 85
Филогенетические особенности культуры 85
Определение активности р-ЦГТ-азы
фенолфталеиновым методом 86
2.1.2.1.7. Определение циклодекстринов методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии 88
2.1.2.1.8. Выращивание культуры микроорганизма
в лабораторных условиях 89
2.1.2.1.9. Выделение циклодекстринглюканотрансферазы из
культуралыюй жидкости органическим растворителем 90
2.1.2.1.10. Получение лиофилизированных ферментных препаратов 90
2.1.2.2. Методы, используемые при получении производных Р-ЦД 91
2.1.2.2.1. Введение альдегидных групп в молекулы поливинилового
спирта и кремнезема 91
Определение альдегидных (СНО-)групп на сорбенте 91
Подбор температурных условий реакции при синтезе производных р-ЦД с сорбентами 92
Подбор оптимальных количеств р-ЦД и сорбентов, участвующих в реакции синтеза производных 92
Подбор времени проведения реакции синтеза
производных р-ЦД 92
2.1.2.2.6. Определение комплексообразующей способности
синтезированных производных Р-ЦД с холестерином 93
2.1.2.3. Методы, используемые при получении и
анализе комплексов включения : 94
Методы синтеза комплексов включения 94
Определение массовой доли а-токоферол ацетата в комплексе 95
Определение массовой доли |3-ЦД в комплексе 96
Определение стабильности водных растворов
комплекса «витамин Е : |3-ЦД» 97
2.1.2.3.5. Контроль процесса комплексообразования
методом центрифугирования 98
2.1.2.3.6. Определение воздействия дневного света
на витамин В2 и его комплексы с Р-ЦД 98
2.1.2.3.7. Фотофлуориметрический метод анализа комплекса
«витамин В2: Р-ЦД» 98
2.1.2.3.8. Определение растворимости комплексов в воде
при разных температурах 99
2.1.2.3.9. Термический анализ комплексов 100
2.1.2.4. Приготовление конфет «Помадка витаминизированная»
и мармелада желейного формового витаминизированного, оценка
их качества с учетом весомости основных показателей 101
Определение содержания сухих веществ 105
Определение величины рН растворов 105
Определение содержания влаги 105
Определение восстанавливающих Сахаров 106
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 107
Скрининг микроорганизмов продуцентов Р-ЦГТ-азы 107
Исследование фенотипических признаков и
идентификация штамма 16Ь продуцента Р-ЦГТ-азы ПО
Морфологические и культуральные признаки штамма 16Ь ПО
Физиолого-биохимические признаки штамма
Bacillus sp. 16b продуцента Р-ЦГТ-азы Ill
2.2.2.3. Филогенетические особенности культуры Bacillus circulans 117
Биосинтез Р-ЦГТ-азы Bacillus circulans шт. 16b ГЮХ и Р-ЦД 120
Разработка условий получения иммобилизованных
сорбентов Р-ЦД-поливиниловый спирт и Р-ЦД-кремнезем 122
Подбор температурных условий реакции при синтезе производных Р-ЦД с сорбентами 122
Подбор оптимальных количеств (3-ЦД и сорбентов,
участвующих в реакции синтеза производных 124
Подбор времени проведения реакции синтеза производных Р-ЦД'. 125
Определение комплексообразугащей способности синтезированных производных р-ЦД с холестерином - 127
2.2.5. Получение комплексов включения витамина Е с Р-ЦД 128
2.2.5.1. Выбор метода получения комплексов включения
витамина Е с Р-ЦД 129
Характеристика получаемых комплексов витамина Е с Р-ЦД 130
Изучение стабильности водных растворов комплексов 134
Определение растворимости комплекса 135
Хранение витамина Е и комплексов 136
2.2.5.6. Термический анализ комплексов витамин Е: Р-ЦД 137
2.2.6. Получение комплексов включения витамина В2 с Р~ЦД 140
2.2.6.1. Выбор метода получения комплексов включения
витамина В2 с Р-ЦД 141
2.2.6.2. Изменение растворимости комплексов витамина
В2 с р-ЦД в зависимости от температуры 143
2.2.6.3. Воздействие дневного света на витамин В2 и его
комплексы с р-ЦД 144
2.2.6.4. Анализ процесса комплексообразования витамина В2
с Р-ЦД с помощью флуориметрического метода 146
2.2.6.5. Термический анализ комплексов витамин В2: Р-ЦД 148
2.2.7. Апробация полученных комплексов Р-ЦД с
витаминами при изготовлении кондитерских изделий 153
2.2.7.1. Характеристики сахарной помады и мармелада при хранении 159
ВЫВОДЫ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
ПРИЛОЖЕНИЯ 185
Введение к работе
Актуальность темы. Важное место среди веществ, способных выступить в качестве хозяина комплекса типа «хозяин-гость» занимают цикл о декстрины (ЦД). Этим свойством циклодекстрины обладают благодаря своему строению: их молекулы имеют гидрофильную внешнюю поверхность и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений. ЦД связывают молекулу «гостя» главным образом путем, так называемых, гидрофобных взаимодействий.
ЦД являются продуктами биохимической трансформации крахмала при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстринглюкано-трансферазами (ЦГТ-азами). Семейство ЦД включает в себя три основных продукта: а-ЦД, Р-ЦД и у-ЦД, макрокольца которых состоят из шести, семи и восьми остатков глюкопиранозы соответственно. В продуктах конверсии всегда присутствуют и ЦД большего размера. Из реакционной смеси могут быть выделены молекулы циклических Сахаров, имеющие девять, десять, одиннадцать и более звеньев глюкозы в цикле, обозначаемые буквами латинского алфавита 8-, є-, С,-ЦД, но практического интереса эти продукты не представляют.
Использование ЦД при обогащении пищевых продуктов витаминами и другими биологически активными веществами направлено в первую очередь на повышение качества получаемых продуктов и их функциональности. При образовании комплексов с ЦД уменьшается окисление витаминов, эфирных масел. Ряд витаминов в виде комплексов с ЦД становятся более стабильными, устойчивыми, проявляют лучшую биодоступность. Стабилизирующий эффект сказывается и на процессе фоторазложения витаминов. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышлеиностях, сельском хозяйстве и других областях.
На мировом рынке в производстве ЦД, их производных и комплексов включения с различными веществами лидерство принадлежит фирмам из
Японии, США, Китаю и Венгрии. В России проводились исследования в этом направлении в 80-х годах, однако рентабельные технологии разработаны не были.
Таким образом, исследования, связанные с поиском активного продуцента Р-ЦГТ-азы, получением ферментного препарата на основе нового штамма, ЦД и комплексов включения ЦД с нерастворимыми в воде витаминами, являются актуальными для пищевой промышленности нашей страны.
Цель и задачи исследования. Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента (3-ЦГТ-азы для получения очищенного ферментного препарата со степенью очистки Г10Х и последующего синтеза Р-ЦД для создания комплексов включения Р-ЦД с витаминами.
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из
природных мест обитания, и коллекционных культур с целью отбора штамма,
обладающего преимущественно Р-ЦГТ-азной активностью;
идентификация нового штамма-продуцента Р-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
получение на основе нового продуцента ферментного препарата Р~ ЦГТ-азы Г10Х для синтеза Р-ЦД;
синтез новых производных Р-ЦД на основе поливинилового спирта и кремнезема;
разработка технологии получения комплекса включения витамина Е с Р-ЦД, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ;
разработка технологии получения комплекса включения витамина В2 с Р-ЦД, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ.
- апробация полученных комплексов в опытном производстве кондитерских изделий.
Научная новизна работы. Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих р-ЦГТ-азной активностью, выделенных из различных видов почв и растительных объектов. Из 60 выделенных изолятов 8 новых штаммов обладали высокой р-ЦГТ-азной активностью (не менее 4,5 ед/см ) и специфичностью фермента по отношению к синтезу Р-ЦД (не менее 60%). Для исследований отобран штамм-продуцент Р-ЦГТ-азы с максимальной активностью фермента р-ЦГТ-азы (6,7 ед/см3) и высокой бета-специфичностью ЦГТ-азы (79,13%). На основании изучения совокупности морфологических, культур ал ьных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий р-ЦГТ-азу, идентифицирован как Bacillus circulans 16b.
Впервые разработаны и экспериментально обоснованы условия синтеза производных Р-ЦД на основе поливинилового спирта (ПВС) и кремнезема (иммобилизованного Р-ЦД). Предложено и реализовано использование данных сорбентов для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов.
Разработаны условия получения комплексов включения Р-ЦД с витаминами Е и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки, изучены их свойства, позволившие обосновать возможность их применения в технологии кондитерских изделий. Экспериментально установлено, что комплексы могут быть получены с молярным содержанием витаминов и р-ЦД 1:1. Оптимальным стехиометрическим соотношением компонентов в комплексе витамин Е: Р-ЦД является 1:3, для комплекса витамин В2: Р-ЦД 1:2 моль/моль. Впервые термическим методом анализа подтверждено образование комплексов между р~ ЦД и витаминами Е и В2. Флуориметрическим методом подтверждено образование комплексов витамина В2 с Р-ЦД.
Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с (3-ЦД на устойчивость витаминов к воздействию света и кислорода воздуха. Установлено, что комплексообразование витаминов с Р-ЦД позволяет повысить их растворимость в воде. Для витамина Е растворимость в воде при комнатной температуре в виде комплекса включения 25,9 мг/100 см3, для витамина В2 - 81
мг/100 см , увеличившись более чем в 6 раз по сравнению с чистым витамином.
Практическая значимость работы. В результате направленного скрининга продуцентов ЦГТ-аз, пополнена коллекция культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП. На основе нового штамма-продуцента Р-ЦГТ-азы Bacillus circulans J6b в лабораторных условиях осуществлена наработка опытной партии ферментного препарата Р-ЦГТ-азы, проведен синтез Р-ЦД из картофельного крахмала с использованием выделенного фермента. Получены опытные партии комплексов включения витаминов Е и В2 с р-ЦД с молярным содержанием компонентов от 1:5 до 1:1. Разработаны проекты Технических Условий, составлены акты об изготовлении опытных партий этих комплексов.
В лабораторных условиях кафедры «Технология кондитерского производства» МГУПП изготовлены кондитерские изделия (сахарная помадка и мармелад) с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с Р-ЦД. Применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию данных кондитерских изделий, не влияют на вкус и аромат продукции, при этом повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их витаминами. Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний.
«Способ получения иммобилизованного бета-циклодекстрина» защищен патентом РФ №2295539 от 20.03.2007. Синтезированные новые производные р-ЦД на основе ПВС и кремнезема могут быть рекомендованы для удаления холестерина из различных пищевых продуктов.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на международных конференциях и симпозиумах: на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006); на V Международной научно-технической конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2007); на V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 патент'РФ, где отражены основные положения диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 204 источника, и 6 приложений. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 44 рисунка.
