Содержание к диссертации
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Вирусные системы доставки генов в клетки эукариот 12
Общая характеристика аденовирусов и их использование в качестве векторов для переноса генетической информации 18
Общая характеристика и классификация аденовирусов 18
Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации 21
Векторы на основе аденовирусов человека 21
Векторы на основе аденовирусов животных и птиц 24
1.2.3. Аденовирус птиц CELO, его особенности,
использование в качестве вектора 27
1.3. Общая характеристика бета-интерферона, механизмы
действия, свойства и технология получения 32
Бета-интерферон и его функции 32
Производство бета-интерферона. 37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
2.1. МАТЕРИАЛЫ 41
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы 41
Клеточные линии 41
Плазмидные векторы 42
Ферменты и другие реактивы 42
Лабораторные животные 43
Лабораторное оборудование 43 МЕТОДЫ 43
Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК 43
Выделение препаративных количеств плазмидной
ДНК 44
Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами рестрикции 45
Обработка Фрагментом Кленова 45
Лигирование фрагментов ДНК 45
Трансформация клеток E.coli 46
Приготовление компетентных клеток 46
Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli BJ5183 47
Гомологичная рекомбинация в E.coli 48
Получение рекомбинантных аденовирусов 48
Накопление аденовирусов 49
Очистка и концентрирование аденовирусов 49
Титрование вирусов 50
Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом 50
Выделение вирионной ДІЖ 51
Окраска клеток метиленовым синим 51
Определение биологической активности бета-интерферона человека 51
Электрофорез белков в ПААГ-ДСН 52
Иммуноблотинг 52
Дегликозилирование рекомбинантного белка бета-интерферона человека 53
Количественное определение продукции белка бета-интерферона человека методом сэндвич-ИФА 53
Выделение бета-интерферона человека на Ni-NTA-агарозе 54
Выделение бета-интерферона человека на голубой сефарозе 54
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 56
Исследование токсичности бета-интерферона человека для культуры клеток птиц . 56
Получение рекомбинантных аденовирусов птиц СЕЬО-ИФН-р*
и СЕЬО-ИФН-phis 57
3.2.1. Создание челночных плазмидных конструкций,
содержащих исходный и модифицированный ген бета-интерферона человека в составе экспрессирующей
5
кассеты под контролем CMV-промотора 58
Получение плазмиды, несущей геном рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р методом гомологичной рекомбинации в Е. coli 60
Получение аденовируса CELO-ИФН-Р и CELO-ИФН-
phis 63
3. Продукция рекомбинантного бета-интерферона человека in
vitro 66
Экспрессия гена бета-интерферона входящего в состав генома аденовирусов CELO-ИФН-Р и СЕЕО-ИФН-phis и накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуре клеток LMH 66
Изучение динамики накопления и биологической активности рекомбинантного бета-интерферона человека продуцируемого в культуре клеток птиц 66
4. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из
культуральной жидкости методом аффинной хроматографии 68
3.4.1. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона
из культуральной жидкости на Ni-NTA-агарозе 68
3.4.2. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона
из культуральной жидкости на голубой сефарозе 69
Анализ физико-химических и антигенных свойств бета-интерферона человека, продуцируемого в клетках птиц 71
Продукция рекомбинантного белка бета-интерферона
человека in ovo 75
Продукция и накопление рекомбинантного белка бета-интерферона человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-Р 75
Изучение биологической активности бета-интерферона продуцируемого в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов 76
3.7. Исследование возможности использования рекомбинантного
аденовируса CELO-ИФН-р для генной терапии in vivo 77
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 81
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 91
4*Г
7 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Ад — Аденовирус
БОЕ - бляшкообразующая единица
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ед. к. - единица карты
т.п.о. — тысяч пар оснований
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РКА - репликативно-компетентный аденовирус
ЦПД - цитопатическое действие
CAR — coxsackie adenovirus receptor - коксакивирусный-аденовирусный
рецептор
CELO - Chicken Embryo Lethal Orphan FAVl (fowl adenovirus type 1)-
аденовирус птиц типа 1
p - Plasmid - плазмида
PBS - фосфатный солевой буфер
SPF — specific pathogen free - свободный от вирусных и бактериальных
контаминации
трис - гидроксиметиламинометан
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
CMV - цитомегаловирус человека
ORF — открытая рамка считывания
polyA — сигнал полиаденилирования
ИФН-Р - бета-интерферон
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время рекомбинантные аденовирусы (Ад) широко используются в молекулярно-биологических, биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы являются удобным инструментом для исследования, например, антигенов микроорганизмов in vitro и in vivo, а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. В последние годы разрабатывается новое направление получения рекомбинантных белков с использованием Ад векторов. При этом подходе ген целевого белка клонируют в рекомбинантный аденовирусный вектор, с помощью которого осуществляется доставка гена в эукариотические клетки для продукции белка. Большой интерес при этом вызывает возможность создания векторных систем на основе геномов аденовирусов животных и птиц.
В последнее время была продемонстрирована возможность создания векторов на основе генома Ад птиц CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) [Logunov D. и др.2004]. Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на его основе для продукции рекомбинантных белков in vitro и in ovo: большая пакующая емкость, более высокая физическая стабильность вирионов и способность трансдуцировать клетки птиц. Последнее свойство данного аденовируса используется для создания эукариотических систем экспрессии целевых белков на основе клеток птиц, в частности в куриных эмбрионах, которые являются хорошо изученным и безопасным объектом биотехнологии, что обеспечивает чистоту получаемых продуктов от примесей различных патогенов. Таким образом, рекомбинантные аденовирусы CELO могут найти широкое применение в качестве вектора для разработки новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков, в частности интерферона бета.
Интерферон бета (ИФН-р) относится к семейству интерферонов I типа, и подобно альфа-интерферону индуцирует множество биологических событий, включая ингибирование вирусной репликации, стимуляцию иммунной системы и ингибирование пролиферации клеток. Препараты рекомбинантного ИФН-Р нашли применение в медицине при широком спектре патологий. Это лечение, в первую очередь, рассеянного склероза, различных вирусных инфекций (вирусные гепатиты, герпесвирусные заболевания), а также злокачественной меланомы, рака молочных желез и шейки матки, волосатоклеточной лейкемии и других не менее опасных заболеваний. Однако, несмотря на безусловно доказанную медицинскую значимость этого препарата, биологически активный белок ИФН-Р производится в недостаточном количестве.
Для производства рекомбинантного белка интерферона бета человека в настоящее время используются как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии. Однако эти системы имеют определенные недостатки. В частности, ИФН-р человека, синтезированный в Escherichia coli имеет низкую биологическую активность и может быть загрязнен токсичными веществами или пирогенами. Белок интерферона бета, полученный с помощью эукариотической системы экспрессии, идентичен природному по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам, но является токсичным для клетки-продуцента, что требует разработки более сложных систем продукции.
Таким образом, изучение возможности создания новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантного белка ИФН-Р на основе аденовируса CELO, является актуальным направлением исследований.
Цель исследования. Целью данной работы являлась разработка новой системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного Ад птиц CELO, изучение экспрессии и биологических свойств рекомбинантного белка.
10 В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи:
Исследование устойчивости клеток птиц к цитотоксическому действию бета-интерферона человека.
Получение рекомбинантного Ад птиц CELO, несущего ген ИФН-р человека методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.
Изучение экспрессии гена ИФН-р человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса в линии клеток LMH, и динамики накопления биологически активного рекомбинантного бета-интерферона в культуральной среде.
Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р для получения биологически активного секретируемого белка бета-интерферона человека in ovo в куриных эмбрионах.
Выделение и характеристика секретируемого рекомбинантного белка бета-интерферона человека из культуральной среды клеток LMH, трансдуцированных аденовирусом CELO-ИФН-Р методом аффинной хроматографии.
Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р в генной терапии сформированных опухолей in vivo.
Научная новизна. Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, несущие и экспрессирующие модифицированный и исходный гены бета-интерферона человека, методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.
Была показана экспрессия гена ИФН-Р человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO, накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуральной среде трансдуцированных клеток LMH и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также определеа его биологическая активность. Белок ИФН-р человека при этом был получен в препаративных количествах и
отработаны условия его выделения из культуральной среды методом аффинной хроматографии.
Впервые показана возможность использования рекомбинантного аденовируса птиц CELO-ИФН-Р для генной терапии аденокарциномы А431 in vivo.
Полученные результаты демонстрируют возможность создания новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе клеток птиц с использованием рекомбинантного аденовируса птиц CELO; и конструирование нового генотерапевтического препарата ИФН-Р для терапии различных заболеваний человека, в том числе — онкологических.
Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Была получена новая система экспрессии рекомбинантного бета-интерферона человека in vitro на основе аденовируса птиц CELO. Апробирован способ выделения секретируемого рекомбинантного белка ИФН-Р из культуральной среды от клеток LMH, инфицированных аденовирусом CELO-ИФН-р методом аффинной хроматографии. Была показана возможность получения препарата биологически активного рекомбинантного белка ИФН-р in ovo.
Перспективным может быть применение рекомбинантного вектора CELO-ИФН-Р в генной терапии рака in vivo, так как была показана эффективная экспрессия доставляемого с помощью него гена интерферона в клетках опухоли.
Препарат рекомбинантного бета-интерферона человека,
экспрессированного в культуре клеток LMH с использованием аденовирусного вектора CELO-ИФН-р, и препарат рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р подготовлены к предклиническим испытаниям.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патент Российской Федерации RU 2 326 942 СІ (МІЖ C12N 7/01 (2006.01) от 13 июня 2007 года «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии».
Материалы диссертации используются в лекциях для студентов ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» в рамках курса молекулярной биотехнологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005), международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), IV Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), VI международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), совместном заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела медицинской микробиологии и отдела интерферонов 11 ноября 2008 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы (158 источников, из которых 4 отечественных и 154 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 18 рисунков.
Основные положения., выносимые на защиту. 1. Получение новой системы экспрессии in vitro и in ovo бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса CELO, содержащего ген бета-интерферона.
Изучение свойств и функциональной активности рекомбинантного бета-интерферона человека, продуцированного клетками LMH, инфицированными аденовирусом СЕЬО-ИФН-р\
Исследование экспрессии белка бета-интерферона в клетках опухоли in vivo, при доставке гена бета-интерферона в клетки данной опухоли с помощью рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-р.
