Введение к работе
Акт>алыюсть проблемы. Лекарственные препараты нового поколения, создаваемые на основе рекомбинантных белков, в частности, гормонов и цитокинов, находят все большее применение в медицинской практике Один из наиболее интересных белков семейства цитокинов - бета-интерферон (ИФН-бета), является центральным регулятором неспецифического иммунитета Он обладает сильным антивирусным и антипролнферативным действием и используется в комплексной терапии различных онкологических и аутоиммунных заболеваний, тяжелых вирусных и бактериальных инфекций, сопровождающихся иммунодефицитнымн состояниями ИФН-бета является наиболее эффективным из известных препаратов для лечения рассеянного склероза (Dubois et al, 2003 )
Одним из наиболее эффективных способов получения белков со сложными поеттрансляционными модификациями, свойственными клеткам высших эукариот, является создание трансгенных животных, продуцирующих нужные белки в молоке К настоящему времени некоторые линии трансгенных животных уже используются для производства рекомбинантных белков Так, например, в 2006 г Европейской коммисией было дано разрешение фирме GTC Biotherapeutics на производство препарата АТгуп, созданного на основе синтезирумого в молочной железе коз рекомбинантного антитромбина человека (www gtc-bio com/pressreleases/pr080206 html), завершается разработка препарата rhClINH (Pharming Group NV) на основе CI-ингибитора, получаемого из молока трансгенных кроликов (www pharming com/index php''act=prod&pg=l) К сожалению, очень мало в настоящее время известно о регуляции экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных Создание животных - продуцентов рекомбинантных белков основано на полуэмпирическом подборе "удачного" гибридного гена, обеспечивающего требуемый уровень экспрессии белка Изучение особенностей экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных не только расширяет наши познания о молекулярных механизмах функционирования клеток животных, но и помогает создавать более эффективные системы производства рекомбинантных белков
Цель работы. Целью работы было создание трансгенных животных, продуцирующих бета-интерферон человека в молоке, и изучение закономерностей экспрессии введённых генов
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены трансгенные кролики и мыши, продуцирующие бета-интерферон человека в молоке. Полученные результаты позволили сделать выводы о принципиальной возможности экспрессии биологически активного бета-интерферона человека в молоке трансгенных животных, невозможности универсального использования метода "вставки в первый экзон" и возможной невидоспецифичности действия бета-интерферона человека Впервые была предпринята попытка повышения уровня экспрессии трансгена в молоке с помощью регуляторного элемента, содержащего комбинацию SAR-элемента и тканеспецифичного энхансера. Использование такого элемента не привело к повышению уровня
экспрессии бета-интерферона у трансгеннных мышей, при этом наблюдалось уменьшение тканеспецифичности экспрессии трансгена Кроме того, в работе использовался малоизученный подход коинъекции двух фрагментов ДНК в пронуклеус зиготы Была подтверждена высокая эффективность коинтеграции инъецирумых фрагментов и показана возможность встраивания фрагментов в ориентации, при которой соединяются два различных липких конца
Апробация работы и публикации. Результаты данной работы были доложены на XX зимней международной молодежной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии " и VIII Молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". По материалам исследования опубликовано 3 печатных работы в журналах, одобренных ВАК
Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов, приложения и списка цитируемой литературы, включающего 180 ссылок
