Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Интерферон-бета - строение, свойства и применение 11
1.2. Этапы создания продуцентов рекомбинантных белков 20
1.3. Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих 26
1.4. Методы оптимизации процессов культивирования клеток СНО 34
1.5. Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования 47
2.Собственные исследования 52
2.1. Материалы и методы 52
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Технология получения рекомбинантного ИФН-Р- 1а 64
2.2.2. Создание клонов-продуцентов ИФН-(3-1а 66
2.2.3. Выбор клонов, обладающих максимальной продуктивностью 72
2.2.4. Изучение стабильности клонов-продуцентов ИФН-Р-1а 76
2.2.5. Подбор питательной среды, оптимальной для культивирования клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-Р- 1а 79
2.2.6. Подбор параметров культивирования 84
2.2.7. Оптимизация состава питательной среды для увеличения продуктивности клона-продуцента 91
2.2.8. Оптимизация состава среды для улучшения состава гликозилированных форм ИФН-Р- 1а 98
2.2.9. Анализ ростовых характеристик, продуктивности и гликозилирования при культивировании биореакторах 108
2.2.10. Технологическая схема процесса и материальный баланс 116
2.2.11. Экономическая эффективность процесса 119
3. Осуждение результатов 122
4. Выводы 131
5. Практическое использование научных результатов 132
6. Рекомендации по использованию научных выводов 133
7. Список использованной литературы 134
- Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих
- Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования
- Изучение стабильности клонов-продуцентов ИФН-Р-1а
- Анализ ростовых характеристик, продуктивности и гликозилирования при культивировании биореакторах
Введение к работе
Актуальность темы. Получение белков медицинского назначения, произведенных по рекомбинантной технологии, является перспективной отраслью науки (Andersen D., 2002; Wurm F., 2004). Интерферон-бета (ИФН-), один из широко производимых рекомбинантных белков, применяется в качестве эффективного средства против рассеянного склероза – хронического аутоиммунного заболевания ЦНС (Kagawa Y., 1988).
Получение гликозилированной формы белка – ИФН--1а – возможно только в клетках эукариот (Mark D., 1984). Из них наиболее часто в современной биотехнологии используется культура клеток яичников китайского хомячка (CHO), характеризующаяся высокой скоростью пролиферации, простотой культивирования и изученностью (Wurm F., 2004; Pavlou A., 2004).
ИФН- – сложный для производства белок, что обусловлено его высокой гидрофобностью и склонностью к агрегации (Runkel L., 2000). В связи с этим, необходим особый подход к разработке технологии его получения, включающий выбор оптимальной системы экспрессии, подбор физико-химических параметров культивирования, состава питательной среды, стратегии введения подпиток и добавок, а также типа биореактора.
В настоящее время на российском рынке широко представлены препараты ИФН-, производимые зарубежными компаниями. В рамках стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 г. поставлена задача снижения импортозависимости российского рынка лекарств. Поэтому разработка технологии производства отечественного препарата ИФН- для лечения аутоиммунных заболеваний людей и животных является актуальной задачей для медицины и ветеринарии.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось создание клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН--1а на основе клеток СНО, разработка технологии их суспензионного культивирования и её апробация в рамках общей технологии производства препарата ИФН--1а.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Создание клонов-продуцентов ИФН--1а на основе клеток яичников китайского хомячка СНО.
2. Отбор полученных клонов-продуцентов по ростовым характеристикам и продуктивности.
3. Разработка лабораторной технологии культивирования клона-продуцента рекомбинантного ИФН--1а.
4. Оптимизация параметров и режимов культивирования, состава питательной среды для повышения продуктивности и качества целевого белка.
5. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов ИФН--1а в биореакторах различного типа.
6. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости, определение его физико-химических свойств и противовирусной активности.
7. Проведение доклинических и клинических испытаний полученного препарата ИФН--1а.
8. Разработка нормативной документации на производство субстанции рекомбинантного ИФН--1а и препарата на её основе.
Научная новизна. Впервые создан продуцент рекомбинантного ИФН--1а на основе системы индуцируемой экспрессии и клеток яичников китайского хомяка СНО, не имеющий аналогов на российских биотехнологических производствах. Впервые в России разработана и успешно апробирована технология получения рекомбинантного ИФН--1а, основанная на суспензионном культивировании клеток СНО без использования белков животного происхождения.
Доказана эффективность введения в среду 10 мМ галактозы и 2 мМ уридина, являющихся субстратами реакций гликозилирования, с целью повышения содержания целевой гликозилированной формы рекомбинантного ИФН--1а в культуральной жидкости клеток СНО.
Впервые проведено сравнительное исследование процессов культивирования продуцента рекомбинантного ИФН--1а в биореакторах различного типа – стеклянном с механическим перемешивающим элементом и волновом на основе одноразовых мешков, по результатам которого показаны преимущества последнего для сохранения ростовых характеристик, продуктивности клона и гликозилирования ИФН--1а при масштабировании.
Практическая значимость. Полученные в работе результаты использованы в организации производства отечественного лекарственного препарата ИФН--1а на площадке ООО «Фармапарк». Данные, полученные в ходе проведенных исследований, включены в опытно-промышленный регламент по производству рекомбинантного ИФН--1а. Разработана нормативная документация на производство субстанции (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению). Препарат ИФН--1а, созданный с использованием разработанной технологии, успешно прошёл доклинические исследования, а также первую фазу клинических исследований. Результаты проведенной работы могут быть применены к процессам оптимизации биотехнологических процессов производства других генно-инженерных лекарственных препаратов.
Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты рекомбинантного ИФН--1а созданы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Биотехнологического исследовательского института (Монреаль, Канада). Автором обоснована возможность использования куматной экспрессионной системы для получения клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН--1а человека, проведена работа по характеризации полученных клонов. Автором создан клеточный банк лучшего клона, проведена его паспортизация. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на секрецию и гликозилирование нарабатываемого белка, а также по масштабированию процесса. Эксперименты по очистке рекомбинантного ИФН--1а и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк».
Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011), международной конференции «Биология – наука ХХI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической конференции «Биотехнология – перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 201 источник, из них 189 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 18 таблиц, 35 рисунков, 10 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
1. Рекомбинантная технология на основе суспензионных клеток СНО и индуцируемой экспрессионной системы обеспечивает получение стабильных клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН--1а за счет минимизации негативного влияния данного белка на клетки.
2. Максимальная продуктивность клеточной линии достигается при применении двухфазного температурного режима культивирования, использовании химически определенной бессывороточной питательной среды Power CHO-2CD и концентрации индуктора (кумата натрия) 1,5 мг/л.
3. Профиль изоформ рекомбинантного ИФН--1а может быть приведен в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи путем внесения в питательную среду галактозы и уридина в концентрации 10 и 2 мМ, соответственно.
4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО (продуктивность, гликозилирование и активность рекомбинантного ИФН--1а) остаются стабильными при масштабировании процесса в волновом биореакторе на основе одноразовых мешков объемом 10 л.
Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих
В ответ на проникновение патогенного организма клетки нашей иммунной системы, в частности, лейкоциты, начинают секретировать разнообразные цитокины. Цитокины характеризуются широким спектром действий, заключающихся в активации адаптативного и врожденного иммунитета и прямом воздействии на инфицированные клетки. Интерфероны (ИФН) являются природными цитокинами, которые вырабатываются клетками большинства позвоночных в ответ на проникновение вирусов, препятствуя их репликации и пролиферации (27, 94). Пестка и соавт. показали (147), что важнейшими функциями данных цитокинов является иммуномодулирующая и антипролиферативная.
Первичным сигналом к началу выработки клетками ИФН является двухцепочечная РНК (дцРНК). В норме здоровые клетки организма не содержат дцРНК, а ее появление может быть обусловлено репликацией вирусных частиц (27, 94). Точный механизм активации процессов биосинтеза ИФН в ответ на вирусную инфекцию до конца не выяснен. Однако, несколькими группами авторов (84, 148) описаны факторы, регулирующие транскрипцию генаИФН-(3.
IRF-1 и IRF-2 относятся к факторам транскрипции в семействе интерферон-регулирующих факторов (IRF), играющих важную роль в регуляции экспрессии гена ИФН-(3. IRF-1 индуцирует транскрипцию гена ИФН-Р в инфицированных вирусом клетках, тогда как IRF-2 способен связываться с той же последовательностью ДНК и репрессировать транскрипцию. Оба фактора связываются с молекулой IRF-E - ДНК-связывающим фактором вирус-индуцируемого региона промотора гена ИФН-Р (84, 148). Строение и свойства ИФН-р. Согласно последним исследованиям (19, 120), существует три главных семейства интерферонов (I-III), названных в соответствии с типом рецептора, с которым происходит их непосредственное взаимодействие. Тип I включает семейство ИФН-а (13 субтипов), а также IFN-J3, -8, -є, -к, -т и -со, из них у человека обнаружены ИФН-а, -(3, -є, -к и -со (120, 147). К типу II относится IFN-y, связывающийся с определенным типом рецептора (120). Недавно установлено существование семейства интерферонов III типа - IFN- i: IFN-X1, -А2 и -A3, также известные как интерлейкин-29, -28А и -28В, соответственно (112, 121). Леви и соавт. (121) показали, что все перечисленные типы ИФН обладают сходными свойствами и являются критическими компонентами системы врожденного иммунитета. IFNAR1 IFNAR2 интерфероново-рецепторный комплекс
Интерферон-бета (ИФН-Р), как и все представители семейства I типа интерферонов, связывается с трансмембранным рецептором интерферона-альфа (IFNAR), который экспрессируется на поверхности большинства клеток организма (27, 146) (рис. 1). Рецептор представляет собой гетеродимер, формирующийся из двух трансмебранных субъединиц -интерферонового рецептора I (IFNAR1) и II типа (IFNAR2), состоящего из 550 и 487 аминокислотных остатков, соответственно. Внеклеточные домены обоих рецепторов содержат несколько повторов, сходных по строению с фибронектином III (19). В работе Рассель-Харде и соавт. (158) описана сборка двух субъединиц рецептора в присутствии ИФН-Р в функциональный рецепторный комплекс (рис. 1), который индуцирует дальнейший каскад внутриклеточных событий.
После сборки интерферон-рецепторного комплекса внутриклеточные домены IFNAR1 и IFNAR2 связываются с двумя тирозин-киназами, JAK1 и TYK2, которые трансфосфорилируются, а затем фосфорилируют рецепторы. Фосфорилированные рецепторы IFNAR1 и IFNAR2 далее связываются с белками STAT1 и STAT2 (преобразователи сигнала и активаторы транскрипции 1 и 2). Белки STAT подвергаются димеризации, а затем мигрируют в ядро, где активируют транскрипцию нескольких генов, включая ген комплекса гистосовместимости I класса, 2 ,5 -олигоаденилатсинтазы (159), бета-2-микроглобулина, неоптерина и ген устойчивости к миксовирусам (Мх) (19, 171). Данные белки определяются в плазме людей после парентерального введения ИФН-3, и по повышению их концентрации косвенно судят о биологических эффектах препарата. Репрессирование вышеописанной передачи сигнала по пути JAK/STAT осуществляется тирозин-фосфатазой SHP-1 (133).
Интересно отметить, что хотя молекулы ИФН-а и ИФН-Р имеют один и тот же мембранный рецептор, но запускают разные каскады внутриклеточных событий. В работе Рассель-Харде и соавт. (158) показано, что связывание ИФН-Р с рецепторами IFNAR1 и IFNAR2 является более прочным, нежели у ИФН-а. Таким образом, стабильность комплекса ИФН-рецептор обусловливает природу дальнейшего проведения сигнала, что и объясняет разные эффекты от связывания молекул ИФН-а и ИФН-Р с одним и тем же рецептором.
ИФН-Р - полипептид, состоящий из 166 аминокислотных остатков. По вторичной структуре ИФН-Р является глобулярным белком, имеющем в составе 5 а-спиралей (20) и одну внутримолекулярную дисульфидную связь между остатками цистеинов 31 и 141 (рис. 2). Кроме того, в положении 17 полипептидной цепи белка содержится свободный остаток цистеина, который, по мнению нескольких групп авторов (102, 103), играет важную роль в образовании агрегатов путём создания внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей.
Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования
Создание клона-продуцента рекомбинантного ИФН р-1а. Работы по конструированию клона-продуцента рекомбинантного ИФН-(3-1а проводились совместно с Биотехнологическим исследовательским институтом (Biotechnology Research Institute, Монреаль, Канада).
Источником гена ИФН-(3, использованного при конструировании экспрессионных плазмид, являлась кДНК, выделенная из линии фибробластов человека. Амплификацию гена ИФН-р1 проводили в реакции ПЦР с помощью термоциклера «DNA Engine Thermocycler» (Bio-Rad, США). Разделение фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле с использованием прибора Sub-Cell GT System (Bio-Rad, США). Для элюции фрагментов ДНК из агарозного геля использовали набор QIAquick spin columns Kit (Qiagen, США).
В работе были использованы векторые плазмиды pCI-neo (Promega, США) и CR5B43K (Novagen, США), содержащие маркеры устойчивости к антибиотикам генетицину и гигромицину, а также эндонуклеазы рестрикции и ферменты нуклеинового обмена производства «Fermentas» (Литва). Нуклеотидные последовательности в составе плазмид подтверждали секвенированием на приборе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США) с использованием стандартных праймеров.
Сконструированные плазмиды вводили в клетки линии CHO-S (Invitrogen, США) с помощью процесса трансфекции методом электропорации. Для этой цели брали 4 106 клеток CHO-S, добавляли к ним 10 мкг очищенной плазмидной ДНК в 200 мкл питательной среды CD-CHO (Invitrogen, США). Трансфекцию проводили с помощью электропоратора Т820 (ВТХ, США) при следующих параметрах: 1 импульс при напряжении 130 В в течение 50 мсек. Затем клетки переносили в культуральный флакон площадью 25 см , содержащий 5 мл среды CD-CHO и культивировали в стационарном положении в СОг-инкубаторе МСО-18М (Sanyo, Япония) в атмосфере 5%-ного С02, при температуре 37 С и влажности 95%.
После проведения трансфекции проводили отбор клонов, имеющих максимальную продуктивность по ИФН-[3-1а, с использованием прибора ClonePix FL (Genetix, Великобритания). Отбор клонов проводили с использованием конъюгированных с ФИТЦ антител, специфичных к ИФН-(3 (R&D Systems, США), в соответствии с методикой производителя.
Размораживание клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН-р 1а. Содержимое криопробирки с суспензией клеток в течение 1-2 мин размораживали на водяной бане TW-2 (Elmi, Латвия) при 37 С, следя за остатками льда. Переносили содержимое криопробирки по каплям в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл нагретой полной среды Power СНО-2 (Lonza, США) или CD-CHO (Invitrogen, США) и центрифугировали при 200g в течение 5 мин при комантной температуре на центрифуге Allegra 25R (Beckman, Германия). Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 7 мл свежей питательной среды и переносили во флакон площадью 25 см . Культивировали в стационарном положении в СОг 54
инкубаторе МСО-18М (Sanyo, Япония) в атмосфере 5%-ного С02 при температуре 37 С и относительной влажности 95%.
Культивирование клеток в стационарных условиях. Клетки культивировали в 24- и 6-луночных планшетах, в культуральных флаконах с вентилируемыми крышками площадью 25 и 75 см (весь пластик Corning, США) в С02-инкубаторе МСО-18М (Sanyo, Япония) в атмосфере 5%-ного углекислого газа при температуре 37 и 30 С, относительной влажности 95%. Пересев проводили каждые 2-3 суток, плотность клеток при посеве составляла 0,3-1,0 106 клеток/мл среды. Использовали бессывороточные химически определенные питательные среды с добавками:
Power СНО-2 (Lonza, США) с добавлением 4 мМ аланил-глутамина, 16 мкМ тимидина и 0,1 мМ гипоксантина (оба реагента Invitrogen, США); CD-CHO (Gibco, Invitrogen, США) с добавлением 4 мМ аланил-глутамина, 16 мкМ тимидина и ОД мМ гипоксантина; CDM4CHO (HyClone, Thermo, США), содержащую 4 мМ глутамина, с добавлением 16 мкМ тимидина и 0,1 мМ гипоксантина; EX-CELL CD СНО (Sigma, США) с добавлением 4 мМ аланил-глутамина.
Культивирование клеток при перемешивании. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера (Corning, США) объемом 125 мл (25 мл питательной среды на колбу), 250 мл (50 мл питательной среды на колбу) и 1 л (200 мл питательной среды на колбу) в бессывороточных питательных средах, пересевая каждые 2-3 суток путем разбавления суспензии до плотности 0,2-1,0х 106 клеток/мл среды. Культивирование проводилось в шейкере-С02-инкубаторе Multitron Cell (Infors НТ, Швейцария) в среде с 5% содержанием С02 при перемешивании со скоростью 120 об/мин, при температуре 37 и 30 С, относительной влажности 95%.
Внесение добавок и подпиток в среду культивирования. Добавки в питательную среду вносили однократно во время цикла продукции в планшетах и колбах. Первичный скрининг проводили в 24- и 6-луночных планшетах (по 3 лунки на реагент), затем наиболее эффективные добавки тестировали в колбах Эрленмейера объемом 125 мл. Добавки в среду вносили на 3 сутки культивирования.
Для изучения влияния на продуктивность клеточной линии вносили следующие вещества: 40 и 80 мМ хлорида натрия, 1 и 8 мМ N-ацетилцистеина, 10 и 20 мМ бетаина, 1 и 2 мМ восстановленного глутатиона, 0,35 и 0,70 мМ метионина, 1 и 4 мМ пирувата натрия, 4 и 8 мМ глюкозы, 0,05 и 0,1% твина-20, 0,05 и 0,1% твина-80, 0,05 и 0,1% 3-[(3-холамидопропил)диметиламмония]-1-пропансульфоната (CHAPS), 0,5 и 1% глицерина, 0,5 и 1% ДМСО (все реагенты Sigma, США).
Проводили оценку влияния ингибиторов ферментов, модифицирующих хроматин, на продуктивность клеточной линии. В лунки планшетов вносили следующие вещества: 5, 15 и 45 нМ оксамфлатина, 1,0, 2,5 и 7,5 мМ бутирата натрия, 0,13, 0,40 и 1,20 мкМ СГ-994, 10, 35 и 100 нМ ЕХ-527, 1,0, 3,5 и 10 мкМ AGK2, 3,0, 10 и 30 мкМ 5-азацитидина, 0,5, 1,5 и 4,5 мкМ ВІХ 01294 (все реагенты Sigma, США).
Для изучения влияния на гликозилирование ИФН-(3-1а вносили следующие вещества: 1 и 2 % глицерина, 1,0 и 2,5 мМ пропионовой кислоты, 1 и 4 мМ бутирата натрия, 1 и 8 мМ N-ацетилцистеина, 1 и 2% дМСО, 0,1 и 1 мкм хлорида марганца, 1, 2 и 4 мМ уридина, 2 мМ уридинтрифосфата, 10, 20 и 40 мМ галактозы, 10 мМ глюкозамина, 5 и 20 мМ ТчІ-ацетил-Б-маннозамина, 1-кратный раствор синтетического холестерола, 0,5 мл/л среды смеси жирных кислот (все реагенты Sigma, США).
Изучение стабильности клонов-продуцентов ИФН-Р-1а
По завершении первого длительного этапа наших исследований была создана клеточная линия, продуцирующая рекомбинантный ИФН-Р-1а. Среди множества клонов-продуцентов был отобран один, обладающий наилучшими ростовыми характеристиками, уровнем продукции и степенью гликозилирования целевого белка (ЗЗА). Было показано, что данный клон генетически стабилен и обладает постоянством уровня экспрессии при культивировании в течение 2 месяцев. Была подобрана оптимальная среда для роста клеток и продуцирования ими ИФН-(3-1а (Power СНО-2 CD).
В рамках следующего этапа наших исследований по разработке технологии культивирования необходимо было оптимизировать следующие параметры цикла продукции: концентрацию индуктора, исходную клеточную плотность, продолжительность культивирования.
Температурный режим культивирования. Разработка технологии была начата с оптимизации температуры культивирования. Для ИФН-3-1а, весьма склонного к агрегации белка, подбор оптимального темературного режима является одной из основных стадий разработки технологии культивирования, поскольку температура - важный фактор, воздействующий на белковую агрегацию (182). Нами было опробовано снижение температуры культивирования, как одна из стратегий, применяемых для увеличения продуктивности клеток при производстве рекомбинантных белков (134).
Было проанализировано три варианта температурного профиля: 37 и 30 С в течение всего цикла культивирования, а также 37 С в течение 2 суток с последующим переходом на 30 С (рис. 22). Клетки клона ЗЗА засевали в колбы из расчета 0,75 млн. клеток/мл, культивировали в среде Power СНО-2 CD, содержащей 1 мг/л кумата натрия. Проводили ежедневные отбор проб с целью измерения клеточной плотности и содержания живых клеток в суспензии. Эксперимент был повторён трижды. Как и ожидалось, при поддержании температуры 37 С в течение всего цикла продукции культура достигала максимальной плотности - 6,03 млн. клеток/мл среды (рис. 22, А), однако на 8 сутки культивирования падала до 2,0 млн. клеток/мл, а жизнеспособность снижалась до 60% (рис. 22, Б). А. сутки культивирования сутки культивирования
37 и 30 С постоянно; 37 С в течение 2 суток, затем 30 С При поддержании температуры 30 С наблюдалась значительно более медленная скорость роста культуры (рис. 22, А), при этом жизнеспособность на 8 сутки составляла более 80 % (рис. 22, Б). При двухступенчатом температурном профиле были получены средние значения клеточной плотности (около 5 млн. клеток/мл среды на 6 сутки), жизнеспособность клеток выше 80% также сохранялась примерно на одни сутки дольше, по сравнению с культивированиемм при 37 С (рис. 22, А, Б).
При анализе концентрации ИФН-3-1 а в образцах КЖ, отобранных на 8 сутки культивирования, было выявлено, что продуктивность клона минимальна при температуре 37 С (рис. 23, А, дорожка 3). В КЖ клеток, культивировавшихся при температуре 30 С, концентрация ИФН-(3-1а в 1,5 раза выше, чем при температуре 37 С (рис. 23, А, дорожка 4).
Вестерн-блот образцов, содержащих рекомбинантный ИФН Р-1а А - концентрация ИФН-(3-1 а в КЖ при различных температурных профилях на 8 день культивирования: дорожка 2 - стандарт ИФН-P-la-CRS, 10 нг; дорожки 3, 4, 5 - температура 37, 30 и 37— 30 С, соответственно; дорожки 1 и 7 - маркеры молекулярной массы. Б - концентрация ИФН-(3-1а в КЖ при режиме 37— 30 С на 4, 6, 8 и 10 сутки культивирования: дорожки 6, 8, 9 и 10, соответственно. Однако использование двухфазного температурного режима, несмотря на сниженный темп роста клеток, оказалось наиболее эффективным: достигнутая концентрация ИФН-3-1а в КЖ примерно в 3 раза выше, чем при 37 С (рис. 23, А, дорожка 5). Данный факт может быть обусловлен тем, что снижение температуры культивирования позволяет уменьшить степень агрегации производимого клетками ИФН-рМа вместе с продлением срока жизни (увеличением жизнеспособности) культуры.
При исследовании временной зависимости концентрации и степени гликозилирования ИФН-3-1а при двухфазном температурном режиме было показано, что основная часть белка продуцируется примерно до 4 суток культивирования, после чего концентрация растет более медленно, достигает максимума к 6-му дню и затем практически не изменяется (рис. 23, Б, дорожки 6, 8, 9, 10). На 10-й день культивирования отмечалось снижение степени гликозилирования, что, по-видимому, связано с гибелью клеток.
Таким образом, применяемый подход по снижению температуры культивирования оказался эффективным для повышения продуктивности процесса (3). Возможно, производимый эффект может быть объяснен повышением стабильности белка при температуре 30 С, а также снижением количества агрегатов.
Концентрация индуктора. Далее нами была проанализирована зависимость ростовых характеристик и продуктивности клона ЗЗА от концентрации индуктора - кумата натрия. Был проведен цикл продукции в колбах объемом 250 мл. Начальная плотность клеток составляла во всех случаях 0,75 х106 клеток/мл. Эксперимент был проведен трижды.
Рекомендованная создателями куматной экспрессионной системы концентрация индуктора составляет 1 мг/л, предельная концентрация - 40 мг/л. Нами проводилась индукция выработки ИФН-(3-1а клетками клона ЗЗА с добавлением в среду следующих концентраций кумата натрия: 0 мг/л; 0,3; 1,0; 2,5; 5,0; 15,0 и 40,0 мг/л. Было показано, что концентрации кумата 15 мг/л и выше являются токсичными для клеток (приводят к снижению жизнеспособности на первых этапах цикла продукции). Клетки культивировали при подобранном ранее оптимальном температурном режиме: 2 суток при 37 С и 6 суток температуре 30 С. Продуктивность клона измеряли с помощью вестерн-блоттинга по соответствующей методике. =L 3 4 5 концентрация кумата, ЛЛГ/Л Как видно из рис. 24, зависимость продуктивности от концентрации кумата достигает выхода на плато при концентрации 1,5 мг/л. Именно данная концентрация индуктора являлась оптимальной и применялась нами во всех дальнейших экспериментах (3).
Исходная клеточная плотность и продолжительность цикла продукции. Поскольку ранее было показано, что во время цикла индукции при температуре 30 С пролиферация клеток практически не наблюдается, мы проанализировали зависимость продукции ИФН-рМа и жизнеспособности клеток от исходной клеточной плотности при посеве.
Анализ ростовых характеристик, продуктивности и гликозилирования при культивировании биореакторах
Интерферон-бета (ИФН-Р) - один из широко используемых рекомбинантных белков, применяемый в качестве эффективного средства борьбы с PC (43, 46). В настоящее время на российском рынке представлены в основном зарубежные препараты рекомбинантного ИФН-Р, в связи с этим организация производства отечественного данного белка является приоритетной задачей.
Наша работа была ориентирована на разработку и оптимизацию процесса культивирования эукариотической клеточной линии, созданной для получения рекомбинантного ИФН-3-1а. Для достижения поставленной цели разумным является применение индивидуального подхода к клеточной линии, учитывающий подбор оптимальных физико-химических параметров, состава питательной среды, стратегии введения подпиток и добавок, а также типа используемого биореактора для масштабирования процесса.
Объект нашего исследования - ИФН-Р-1а - во-первых, является гликозилированным белком, а во-вторых, обладает чрезвычайно высокой гидрофобностью и склонностью к образованию агрегатов (40, 131, 153, 156, 179). Именно данные факторы были определяющими в подборе системы экспрессии. Так, изначально нами была выбрана клеточная линия СНО, как хорошо изученная и наиболее широко применяемая в мире для производства гликозилированных рекомбинантных белков (17, 145, 190). В качестве подхода к решению проблемы агрегации нами была применена индуцируемая система экспрессии гена ИФН-(3, где выработка целевого белка в клетках СНО происходит при добавлении в среду безвредного вещества - кумата натрия (3, 136). Мы исходим из того, что только использование индуцируемого промотора способно привести к успеху при экспрессии белка, негативно действующего на клетки, такого как ИФН-3.
Конструирование клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-3-1а было проведено на базе Биотехнологического исследовательского института (Biotechnology Research Institute, Монреаль, Канада). Были созданы клоны как с конститутивной, так и с индуцируемой системой экспрессии гена ИФН-(3. Уже на данном этапе стали очевидны преимущества использования куматной системы, способствующей минимизации негативных эффектов, производимых ИФН-рМа на клетки-продуценты. С помощью специализированного оборудования удалось провести полноценный отбор клонов клеток по критическим параметрам - продуктивности и стабильности экспрессии. В результате было получено 7 клонов-продуцентов, продуцирующих не менее 40 мг/л ИФН-(3-1а. Вся дальнейшая работа с клонами проводилась на базе ФГУП ГосНИИгенетики.
Для оценки концентрации ИФН-рМа в образцах КЖ клонов первоначально использовали два метода: ИФА и вестерн-блотинг. Однако результаты ИФА не обладали необходимой точностью и воспроизводимостью, что, вероятнее всего, обусловлено низкой стабильностью нативного ИФН-(3-1а в неденатурирующих условиях (153, 170), поэтому основным методом анализа был выбран вестерн-блотинг. Данный метод также был использован нами для оценки доли гликозилированных форм белка, по сравнению с негликозилированной формой. Степень гликозилирования рекомбинантного ИФН-(3-1а играет заметную роль в его производстве. Гликозилирование повышает биологическую активность, способствует уменьшению агрегации белка и тем самым снижает иммуногенность препарата (131, 104, 156, 179).
На этапе передачи клонов-продуцентов из Биотехнологического исследовательского института было обнаружено несоответствие значений продуктивности, определяемых вестерн-блоттингом. Как нами было установлено, значительные расхождения результатов были обусловлены использованием разных стандартных образцов рекомбинантного ИФН-3-1а. В дальнейшем для всех проводимых экспериментов при разработке технологии был применен европейский стандартный образец рекомбинантного ИФН-рМа (ИФН-P-la-CRS), описанный в Европейской Фармакопее - основном нормативном документе, регулирующем качество производимых рекомбинантных препаратов.
Для полученных клонов-продуцентов была проведена работа по подбору условий культивирования. Исходно суспензионные культуры клеток отобранных клонов-продуцентов ИФН-рМа культивировали стационарно в малых объемах. Для суспензионной культуры, ориентированной на промышленное производство, этот процесс не подходит по нескольким причинам. Во-первых, оптимальный характер культивирования на производстве - биореактор с перемешиванием, обладающий большими возможностями для повышения клеточной плотности и продуктивности (40, 49). Во-вторых, в стационарных условиях суспензионные клетки склонны к агрегации и прикреплению к пластику. В-третьих, клетки чувствительны к перемешиванию, и они должны быть адаптированы к механическим повреждениям (167, 192). В итоге, продуктивность и жизнеспособность клеток при переходе от стационарного способа культивирования к перемешиванию может существенно измениться в ту или иную сторону.
В результате проведенных экспериментов по адаптации к условиям перемешивания, а также повторного реклонирования, было выбрано 125 клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а с продуктивностью выше 15 мг/л среды и долей гликозилированных форм более 60%. Важным этапом работ являлся анализ клонов на стабильность, поскольку это одна из важнейших характеристик, которой должен обладать продуцент, применяемый в производстве. Использование нестабильной клеточной линии, характеризующейся скачкообразными изменениями уровня экспрессии белка, приводит к серьёзным экономическим потерям (23, 190).
Стабильность клеточной линии включает постоянный уровень продуцирования целевого белка при культивировании клеток в течение длительного срока. Изменения продуктивности могут быть обусловлены как меняющимися условиями культивирования, так и микробиологическим заражением клеточной линии (58, 190). Еще один фактор, который необходимо учитывать при разработке клеточной линии - генетическая стабильность. При долгом нахождении клеток в культуре повышается вероятность хромосомных перестроек и рекомбинаций, в результате которых экспрессия гена целевого рекомбинантного белка может снизиться либо совсем прекратиться (23, 58, 190).
По результатам проведенных экспериментов было отобрано 5 клонов, уровень продукции которых изменялся в пределах ±10% от первоначального значения (приемлемым считаются колебания на не более чем ±30%). Анализ ДНК клеток 5 клонов-продуцентов методом саузерн-блоттинга не выявил нарушений вставки гена ИФН-3. Таким образом, было доказана стабильность полученных клонов-продуцентов, позволяющая применять их в производственном процессе.
Похожие диссертации на Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а
