Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Современные подходы к оптимизации технологии производства генно-инженерных продуктов 10
1.2. Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков 15
1.3. Типы культивирования 17
1.4. Оптимизация физико-химических параметров культивирования 19
1.5. Оптимизация состава питательной среды 23
1.6. Режимы культивирования 32
1.7. Оборудование для культивирования 35
1.8. Свойства дарбэпоэтина и его применение в медицине 42
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы 46
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Создание эукариотического продуцента дарбэпоэтина 55
2.2.2. Оптимизация культивирования продуцента дарбэпоэтина 59
2.2.3. Процесс масштабирования в биореакторе 67
2.2.4. Процесс выделения и очистки дарбэпоэтина 75
2.2.5. Получение ГЛФ дарбэпоэтина 78
2.2.6. Оценка стабильности и эффективности процесса 79
2.2.7. Технологическая схема процесса суспензионного культивирования СНО 801
2.2.8. Экономическая эффективность производства дЭПО
3. Обсуждение результатов 82
4. Выводы 84
5. Практическое использование научных результатов 85
6. Рекомендации по использованию научных выводов... З
7. Список использованной литературы
- Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков
- Оборудование для культивирования
- Оптимизация культивирования продуцента дарбэпоэтина
- Технологическая схема процесса суспензионного культивирования СНО
Введение к работе
Актуальность темы. Препараты на основе эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина широко используются в практике здравоохранения для лечения тяжелых анемий при хронической почечной недостаточности, химиотерапии у онкологических больных и др. Широкое применение эритропоэтина и его аналогов связано с их стимулирующим действием на эритропоэз. Препараты на основе эритропоэтина выпускаются в виде готовых лекарственных форм (ГЛФ) – растворов для внутривенного и подкожного введения.
В России до настоящего момента не существовало технологии производства субстанции рекомбинатного дарбэпоэтина, поэтому ее разработка является актуальной задачей. Дарбэпоэтин – рекомбинантный белок, который производится клетками яичников китайского хомяка (СНО). Технология их промышленного культивирования заключается в следующем: суспензионная клеточная линия продуцента дарбэпоэтина культивируется в биореакторах разного типа в питательной среде специально разработанного состава с добавлением подпитки, восполняющей дефицит питательных веществ в процессе культивирования, что обеспечивает высокий выход и качество целевого белка.
В рамках данного исследования была разработана технология производства субстанции дарбэпоэтина. Продуцент целевого белка был создан на основе суспензионных клеток СНО, была разработана высокоэффективная схема его культивирования, а также были изучены биотехнологические аспекты повышения эффективности процесса.
Предложенная схема культивирования клонов-продуцентов на основе платформы CHO-S использует новейшие компоненты питательных сред и позволяет применять ее для других продуктов и оптимизировать уже существующие технологии. При широком использовании клонов-продуцентов на основе суспензионных клеток CHO в современном биотехнологическом производстве разработка такого универсального способа культивирования весьма актуальна.
В последние годы существенно ужесточаются требования к лекарственным средствам на основе рекомбинантных белков. Они должны быть произведены по технологии, не использующей компонентов животного происхождения, органических растворителей, иммуноаффинных сорбентов, других токсичных и биологически активных веществ. Рекомбинантный продукт должен пройти полную характеризацию по ключевым физико-химическим и биологическим параметрам, список которых подготавливается отдельно для каждого белка в зависимости от его индивидуальных особенностей. Предлагаемая технология производства дарбэпоэтина является одной из первых в России, которая учитывает эти современные тенденции.
Таким образом, разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства дарбэпоэтина, соответствующего по параметрам качества и безопасности современным требованиям, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований – разработать и реализовать на практике технологию промышленного производства дарбэпоэтина, соответствующего современным требованиям качества и безопасности.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Создание клонов-продуцентов дарбэпоэтина на основе суспензионных клеток яичников китайского хомячка СНО; отбор полученных клонов-продуцентов по продуктивности и профилю гликозилирования.
2. Оптимизация состава питательной среды и добавок для повышения продуктивности и качества целевого белка.
3. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов дарбэпоэтина в биореакторах различного типа.
4. Исследование качества препарата дарбэпоэтина, полученного с использованием разработанной технологии, в том числе проведение доклинических испытаний.
5. Разработка технологической документации на производство субстанции рекомбинантного дарбэпоэтина и препарата на её основе.
Научная новизна. Впервые в России была разработана схема получения и культивирования клонов-продуцентов белка дарбэпоэтина.
При создании генетической конструкции использовался нестандартный подход, при котором рекомбинантная плазмида содержала две одинаковые копии гена дарбэпоэтина и участок связывания с ядерным матриксом S/MAR.
При разработке технологии особое внимание уделялось такому важному показателю эффективности препарата как соотношение гликозилированных форм дарбэпоэтина в целевом продукте. Поскольку биологическая активность дарбэпоэтина напрямую зависит от степени сиалирования его молекулы, целью оптимизации технологического процесса являлось повышение выхода высокосиалированных изоформ. Данная цель была достигнута с помощью периодического добавления в среду культивирования химически определённого компонента, состоящего из липидов, что является новым способом оптимизации гликозилирования.
Технология промышленного культивирования была разработана с учётом перспективных направлений современной биофармацевтики – с использованием биореактора волнового типа, создающего более комфортные условия для эукариотических клеток по сравнению с традиционными биореакторами перемешивающего типа, а также с применением одноразовых контейнеров для культивирования, что позволяет снизить риск контаминации, сократить время обслуживания биореактора и упростить валидацию процесса.
Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производства генно-инженерных лекарственных средств. Разработанная технология станет основой для производства субстанции дарбэпоэтина на технологической площадке ООО «Фармапарк». Разработанная технология использовалась для получения опытных серий препарата, которые успешно доклинические испытания.
Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты дарбэпоэтина созданы в ходе совместных исследований автора с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк» Воробьёвой И.Г. и Шукуровым Р.Р., а также заведующим лабораторией эукариотических систем экспрессии генов ФГУП «ГосНИИгенетика» Козловым Д.Г. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на продуктивность и степень гликозилирования нарабатываемого белка. Автор осуществлял масштабирование процесса в биореакторах различного типа. Эксперименты по очистке дарбэпоэтина и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк» Кряжевских И.С., Орловой Н.В., Мосиной А.Г и Антоновой Л.П.
Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международной конференции «Биология – наука ХХI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической конференции «Биотехнология – перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 143 источника, из них 136 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 12 таблиц, 21 рисунок, 5 страниц приложений.
Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков
Класс медицинских препаратов, изготовленных из белков, произведенных по рекомбинантной технологии, занимает одно из ведущих мест в мире по объему продаж. Данные препараты успешно применяются для лечения таких тяжелых заболеваний, как рак, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, анемии различной этиологии и т.д. (8). Большую долю из выпускаемых рекомбинантных белков составляют гликопротеины (антитела, цитокины, факторы коагуляции, гормоны), синтез которых возможен лишь в клетках млекопитающих (10). Данные клетки имеют неоспоримые достоинства по сравнению с другими клеточными линиями, так как позволяют адекватно осуществлять множество посттрансляционных изменений рекомбинантного протеина, такие как N- и О-гликозилирование, отщепление лидерного пептида во время секреции, и корректное сворачивание молекулы белка (39, 69, 101, 111, 132). Причина более частого применения клеточных линий млекопитающих заключается в повышенной активности производимых протеинов, по сравнению с белками, получаемыми из растений и прокариот. (20, 34, 41, 106). Все вышесказанное делает клетки млекопитающих незаменимыми в современном производстве рекомбинантных белков, представляющем бурно развивающуюся отрасль биотехнологии.
С целью продукции белков, входящих в состав биопрепаратов, применялись различные виды линий клеток: ВНК (из почек карликового хомяка), COS (почки африканской зеленой мартышки), NS0 (мышиная миелома), Рег.Сб (сетчатка глаза человека), НЕК293 (почки человеческого зародыша и др. (27, 131). Но чаще всего для производства белков, входящих в состав биофармацевтических препаратов, сейчас применяются клетки яичников китайского хомячка - СНО (61, 103). Их особенностью является способность поддерживать амплификацию вводимых рекомбинантных плазмид (74). Важной характеристикой клеток СНО является широкая приспособляемость к разнообразным условиям культивирования и высокая генетическая пластичность, что дает возможность с относительной легкостью проводить различные генетические манипуляции. Эти клетки гемизиготны по многим генам, включая гены синтеза аминокислот и полиаминов, преимущественно вследствие инактивации последних (103), что позволяет использовать эти дефекты как селективные маркеры путем добавления метаболитов в культуральную среду. К положительным особенностям клеток СНО можно отнести высокую скорость пролиферации, простоту культивирования и способность к росту при очень высокой клеточной плотности, что является незаменимым для промышленного производства (69). Другое полезное свойство клеток СНО, объясняющее их предпочтительное использование для продукции разнообразных медицинских биопрепаратов - это их соответствие принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, не способно в них размножаться (128).
К настоящему времени линия СНО подробно охарактеризована, что заметно облегчает процесс регистрации фармпрепаратов на основе рекомбинантных белков. Хотя существуют небольшие недостатки (различное соотношение гликозилированных изоформ по сравнению с человеческим, присутствие эндогенных вирусов), клетки СНО имеют важнейшее значение в фармацевтической промышленности. К данному моменту примерно 2/3 терапевтических продуктов на основе белков медицинского назначения нарабатываются в клеточных линиях на базе СНО. В табл. 1 суммированы данные о рекомбинантных препаратах, производимых в клеточных линиях на основе клеток СНО за прошедшие 20 лет. Методология культивирования клеток СНО для получения рекомбинантных белков медицинского назначения изложена во многих статьях и обзорах (10, 19, 27, 61, 131, 132, 134, 143). Первостепенное значение для развития отечественной биотехнологической промышленности имеют задачи повышения эффективности культивирования клеток млекопитающих, основанные на оптимизации физико-химических параметров процессов и состава применяемых культуральных сред, а также внедрение современных типов биореакторов.
Недостатком клеток СНО, который вытекает из их достоинств, является их раковая, иммортализованная природа. В связи с этим у клеток нарушен контроль за генетическими изменениями, такими как мутации, хромосомные перестройки и даже изменения количества хромосом (130). За 40 лет, прошедшие с момента выделения клеточной линии, эти изменения накопились, и в настоящее время представляют серьезную проблему. Так, в современной клеточной линии CHO-DG44 из 22 исходных гаплоидных хромосом осталось только 20, из которых только 7 являются нормальными (35). В результате стабильность генетических характеристик клонов-продуцентов на основе СНО и их продуктивности является скорее исключением, чем правилом (29). Поэтому достижение высокой стабильности экспрессии является важнейшей задачей, для решения которой предлагаются разные генетические и технологические подходы.
Оборудование для культивирования
Использование добавок существенно увеличивает концентрацию клеток в культуре, длительность цикла производства и, в итоге, количество полученного белка. К примеру, если стандартная длительность культивирования составляет от 5 до 7 дней при наибольшей концентрации клеток от 6 до 8 млн/мл, то использование добавок повышает длительность процесса до 10-14 суток и наибольшую концентрацию клеток в культуре до 10-15 млн/мл. В итоге продуктивность по конечному белку возрастает в 2-3 раза (61, 132).
Смеси добавок сильно различаются по составу, тем не менее есть вещества, присутствующие в большей части подпиток. Обычно этими веществами являются глюкоза, аминокислоты, витамины и микроэлементы в разных пропорциях. Смеси добавляются в течение культивирования по разработанному графику, например, 5% от всего объёма среды на 3-й день процесса и по 10 % на 5-й, 7-й дни и т.д. Данные программы добавления смесей подбираются индивидуально для каждой конкретной клеточной линии продуцента генноинженерного продукта, так как каждая линия клеток имеет свой собственный профиль потребления питательных веществ.
Следует указать, что уровень нутриентов в смеси дополнительных веществ должен быть как можно меньше, так как во время процесса происходит поступление питательных веществ, а выведение продуктов катаболизма не осуществляется, что приводит к их накоплению в культуралыюй жидкости и угнетению жизнедеятельности клеток (56). К примеру, считается подходящим поддержание уровня глюкозы от 1 до 2 г/л, при этом молочная кислота не будет образовываться в больших количествах. Для снижения отрицательного влияния со стороны аммониевых солей уровень глутамина следует поддерживать в пределах 1-2 ммоль/л (44, 45). Отметим, что указанные концентрации нутрентов не всегда возможно поддерживать в процессе культивирования. Так, типичная скорость потребления глюкозы составляет 2-4 г/л/день, т.е. для ее поддержания на уровне 1-2 г/л необходимо контролировать остаточную концентрацию каждые 2-4 часа, в том числе ночью. В условиях производства это обычно неприемлемо, за исключением случаев, когда биореактор оборудован автоматической системой мониторинга в реальном времени.
В ходе процесса с добавлением подпитки культуральная жидкость не удаляется из сосуда. Тем не менее бывают режимы, которые характеризуются частичным удалением культуральной жидкости вместе с находящимся в ней требуемым белком определёнными порциями либо непрерывным потоком. Клетки-продуценты в ходе культивирования или остаются внутри сосуда, либо выводятся наружу вместе с культуральной жидкостью (44, 45). Первый режим называется перфузией, второй - режимом непрерывного культивирования. В режиме перфузии концентрация клеток в культуре способна достичь уровня 100 млн/мл, так как постоянный приток свежей среды поддерживает концентрацию нутриентов на постоянном, достаточно высоком уровне. Также увеличивается и объём продуцируемого линией требуемого белка. Тем не менее увеличенное потребление среды культивирования в большинстве случаев является фактором, сдерживающим применение перфузионного режима. Кроме того, для внедрения перфузии требуется дорогостоящее переоборудование имеющихся производств. Поэтому в данный момент культивирование производится, как правило, в режиме с добавлением подпиток, хотя доля перфузионных производств постоянно растет.
Оптимизация процесса культивирования осуществляется с помощью определения состава подпиток и графика их внесения в среду культивирования (127).
Существенным этапом создания методики культивирования считается выбор оборудования, необходимого для проведения эффективного процесса культивирования продуцентов нужного продукта. Раньше в биотехнологическом производстве генноинженерных продуктов использовались как правило адгезионные линии клеток, растущие в прикрепленном состоянии на стенках роллерных сосудов (22, 124, 125). Роллерное культивирование производится в бутылях в виде цилиндров, которые устанавливаются в термостатируемые стеллажно-ярусные аппараты - роллерные установки. В установках бутыли медленно вращаются, в результате чего монослой клеток, прикрепленных к внутренней поверхности стенок бутылей, периодически омывается питательной средой. Аэрация осуществляется за счёт диффузии смеси воздуха и СОг через мембраны в крышках бутылей.
Метод культивирования в роллерах, хоть и на относительно дёшев с точки зрения стоимости расходных материалов, обладает существенными недостатками: низким выходом целевого белка, повышенными трудозатратами, сложностью в в обеспечении постоянства параметров культивирования, масштабировании и валидации. Именно поэтому в промышленности данный метод постепенно вытесняется культивированием суспензионных линий клеток в биореакторах различных видов (27). Суспензионные клетки могут расти во всём объёме культуральной среды, что значительно увеличивает концентрацию клеток в культуре и выход целевого белка, а также простоту работы с культурой (112).
Процесс культивирования в биореакторе перемешивающего типа является наиболее подходящим для применения в промышленности. Использование биореакторов заключает в себе очевидные преимущества -уменьшение расходов на производство белка, возможность масштабирования процесса культивирования, сохранение заданных условий культивирования, снижение количества отработанных материалов. Сейчас для культивирования клеточных линий млекопитающих используют аэрируемые
Оптимизация культивирования продуцента дарбэпоэтина
Для первичной оптимизации цикла культивирования по продолжительности и поддержанию высокой жизнеспособности клеток был опробован ряд добавок, вносимых в 6-луночные планшеты с клеточной линией. Среди них были глюкоза, аминокислоты и их смеси, а также коммерческие подпитки (Invitrogen и Lonza). В проведеном эксперименте аминокислоты вводились либо по отдельности, либо в виде смесей. Смешивали аминокислоты, обладающие сходными физико-химическими характеристиками и сходным метаболизмом, например, лизин и аргинин. На рис. 9 приведены суммарные данные по клеточной плотности и продуктивности клеток после добавления тех или иных составов. 200
Влияние добавок, вносимых в питательную среду, на ростовые характеристики и продуктивность клеток, продуцирующих дЭПО
Для контрольной культуры, в отсутствии вводимых подпиток, длительность цикла культивирования составила 8 суток, при этом достигнутая концентрация дЭПО в культуральной жидкости (КЖ) составила 70,5 мг/л. Введение глюкозы положительным образом сказалось как на продуктивности, так и на жизнеспособности клеток на поздних сроках культивирования. Поддерживаемая внесением подпитки концентрация глюкозы в среде оказалась оптимальной для роста клеток. При этом содержание токсических метаболитов глюкозы - лактатов, находилось на низком уровне - менее 200 мг/л (данные не приведены). Введение глюкозы позволило повысить продуктивность на 50% по сравнению с контролем.
Введение глутамина и аланил-глутамина в концентрации 2 мМ также оказало положительное влияние на рост и продуктивность клеток (увеличение на 15-20% по сравнению с контролем). Обычно рекомендуемые концентрации глутамина в среде - 4-8 мМ, однако в таких условиях концентрация аммиака достигает токсичных значений за несколько дней культивирования. Поэтому поддержание концентрации глутамина на уровне 1-2 мМ за счёт контролируемого высвобождения из аланил-глутамина явилось оптимальным для роста клеток и продукции дЭПО. Наилучшие результаты были получены для коммерческих подпиток от Invitrogen (СНО CD Efficient Feed А и В) и Lonza (СНО Xtreme Feed и PowerFeed А). Данный факт можно объяснить тем, что состав подпиток является сбалансированным по содержанию питательных веществ, витаминов, антиоксидантов и др. Для успешного роста и продуцирования целевого белка клетки нуждаются в ряде добавок. Причем подбор вводимых подпиток и добавок проводится индивидуально для каждой клеточной линии и технологического процесса. Использование коммерческих подпиток в проведенном эксперименте позволило увеличить продолжительность цикла культивирования с сохранением высокой жизнеспособности клеток (более 70%), а кроме того, положительным образом сказалось на концентрации дЭПО (увеличение в 2-3 раза по сравнению с контрольной культурой).
Коммерческие подпитки далее были опробованы нами при культивировании в колбах объемом 125 мл. Длительность цикла культивирования в колбах с коммерческими подпитками составила 9-11 суток. Подпитки вводились на 3, 5, 7 и 9 сутки культивирования в объеме 10% от объема культуральной среды. В экспериментах использовали каждую подпитку индивидуально, а также смесь подпиток СНО CD Efficient Feed А и В, введенных в соотношении 1:1. Для каждого варианта подпиток было использовано по три колбы. На рис. 10 приведены средние измеренные значения клеточной плотности и продуктивности в зависимости от дня кул ьтивирования.
На протяжении 5 суток культивирования наблюдалась одинаковая динамика клеточного роста во всех колбах. Далее в контрольной колбе началось постепенное снижение клеточной плотности, и на 9 сутки жизнеспособность культуры составила около 30%.
Добавление подпитки СНО CD Efficient Feed А хоть и привело к увеличению клеточной плотности, однако это не сказалось на повышении продуктивности. Интересен тот факт, что жизнеспособность клеток оставалась более 90% вплоть до 9 суток, однако на 10 сутки произошло резкое падение данной величины. Использование смеси подпиток СНО CD Efficient Feed А и В позволило также повысить клеточную плотность, продлить цикл продукции с сохранением жизнеспособности более 90% на 11 сутки. При этом достигнуто увеличение продуктивности в 2 раза по сравнению с контролем.
Динамика клеточной плотности (А) и концентрации дарбэпоэтина (Б) при культивировании клона-продуцента 28Х в колбах с подпиткой.
Наилучший результат был получен при введении подпитки PowerFeed А: достигнут максимальный прирост клеточной массы, жизнеспособность клеток на 11 сутки составила более 85%, при этом продуктивность повышена в 3 раза в сравнении с контролем. Данная подпитка является оптимальной для культивирования выбранного продуцента, поскольку не только позволяет увеличить прирост клеточной массы, а следовательно, продуктивность, но и продлить цикл культивирования за счёт повышения жизнеспособности клеток. . Таким образом, по результатам проведенного эксперимента можно сделать вывод, что подпитка PowerFeed А применима для последующих
Технологическая схема процесса суспензионного культивирования СНО
Созданная методика культивирования состоит из нескольких основных стадий (рис. 21). Предварительно перед всеми стадиями готовят нужные среды и подпитки.
Культивирование начинается с размораживания криопробирки с рабочим банком клона-продуцента дарбэпоэтина. Размороженную суспензию вносят в матрас 25 кв. см, с культуральной средой и источниками глутамина и гипоксантина с тимидином. Клеточную линию инкубируют в неподвижном состоянии в течение 2-3 дней в атмосфере 5% углекислоты, при температуре 37 С и относительной влажности 95%. При нарастании клеточной линии до плотности 1 млн/мл с выживаемостью более 80% клетки переносят из матраса в плоскодонную колбу объемом 125 мл. Культивирование проводят на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 120 об/мин, в атмосфере 5%-ной углекислоты, при температуре 37С и относительной влажности 75%. При нарастании клеточной линии до плотности 3 млн/мл клетки переносят в колбу объемом 1 л и культивируют при идентичных условиях. После того, как клеточная плотность составит 3 млн/мл суспензию клеток засевают в биореактор и инкубируют 11 дней при контролируемых параметрах процесса: температура 37 С, рН 6,8 - 7,2, DO 40 - 60%. По истечении вышеуказанного срока либо при снижении жизнеспособности клеточной линии до 80%) КЖ удаляют из мешка, отфильтровывают и передают на очистку хроматографическими методами.
Дарбэпоэтин является одним из часто применяемых генноинженерных гдикопротеинов, используемый для лечения анемий различного генеза. В данный момент на российском рынке находятся исключительно импортные препараты дарбэпоэтина, поэтому разработка отечественной технологии производства этого продукта весьма актуальна.
Данная работа имела своей целью создание клона-продуцента дарбэпоэтина и оптимизацию культивирования линии этого клона. Для выполнения соответствующих задач следовало подробно изучить свойства клона-продуцента, его ростовые характеристики и продуктивность с тем, чтобы определить наиболее подходящие условия культивирования, режим добавления питательных веществ в процессе культивирования, а также провести масштабирование культивирования с сохранением выокого выхода дарбэпоэтина.
Изучаемый в ходе работы белок, представляет собой гликопротеин, что ставит особенные задачи по повышению качества целевого продукта помимо увеличения его выхода. Одним из главных критериев качества дарбэпоэтина является доля наиболее высокогликозилированных изоформ по сравнению с общим количесвом гликоформ этого белка.
В качестве клеточной линии-продуцента была выбрана линия клеток яичников китайского хомячка СНО, которая является наиболее изученной производственной линией клеток млекопитающих и широко распространённой в биотехнологическом производстве гликозилированных генноинженерных белков.
Создание клеточной линии продуцента дарбэпоэтина проводилось с помощью химической трансфекции базовой клеточной линии СНО. Из нескольких сотен клонов методом предельного отбора было получено около 30 клонов-продуцентов. В ходе дальнейших экспериментов, направленных на выбор наиболее перспективного клона с точки зрения производства рекомбинантного продукта по таким важным характеристикам как продуктивность, динамика роста и жизнеспособность клеточной культуры, стабильность продуцента, был отобран клон 28Х.
Для выбранного клона, продуцирующего дарбэпоэтин было изучено влияние различных факторов на продуктивность и соотношение гликозилированных изоформ.
Проведена оптимизация сред, состава и схемы внесения подпиток для культивирования продуцента дарбэпоэтина, позволившая достигнуть продуктивности 156 мг/л за счет увеличения продолжительности цикла культивирования с 6 до 11 дней. Разработанная схема культивирования оптимизирована для повышения выхода целевых изоформ с помощью добавления липидной подпитки Lonza.
Проведено масштабирование процесса культивирования до волнового биореактора объемом 10 л с сохранением продуктивности.
Проведены 3 установочные серии культивирования клона-продуцента дарбэпоэтина на качающейся платформе волнового биореактора в одноразовых мешках рабочим объёмом 5 л. Полученные данные подтверждают стабильность и воспроизводимость процесса по динамике клеточного роста, выходу целевого белка и его биологической активности in vivo.
Подсчёт экономической составляющей процесса показал окупаемость разработанной технологии культивирования. Данный процесс может быть перенесён на технологические площади ООО «ФАРМАПАРК».
