Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
2. Собственные исследования 21
2.1. Выбор направления исследований 21
2.2. Материалы и методы исследований 28
2.2.1. Микроорганизмы 28
2.2.2. Питательные среды, растворы и реактивы 28
2.2.3. Методы исследований 29
2.3. Результаты исследований 33
2.3.1. Разработка технологии глубинного способа культи вирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. lichenifor mis №31 33
2.3.1.1. Разработка состава питательных сред 33
2.3.1.2. Отработка условий глубинного выращивания бацилл в ферментерах различного объема 68
2.3.1.3. Стандартизация качества жидких питательных сред для глубинного культивирования В. subtilis №3 и В. Н-cheniformis №31 83
2.3.1.4. Оптимизация условий приготовления и параметров оценки качества посевных рабочих культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 94
2.3.1.5. Оценка эффективности оптимизации состава питательных сред № 4 и № 7 при глубинном выращивании В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 в ферменте рах IG2
2.3.1.6. Воспроизводимость результатов выращивания культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 по новой тех нологии 108
2.3.2. Сравнительная характеристика препарата биоспорина, полученного по разработанной и существующей техно логиям 115
3. Экономическая эффективность полученных результатов 121
4. Обсуждение результатов 123
5. Выводы 128
6. Практическое использование полученных результатов исследований 130
7. Библиографический список 131
8. Приложения 148
- Питательные среды, растворы и реактивы
- Разработка технологии глубинного способа культи вирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. lichenifor mis №31
- Стандартизация качества жидких питательных сред для глубинного культивирования В. subtilis №3 и В. Н-cheniformis №31
- Оптимизация условий приготовления и параметров оценки качества посевных рабочих культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31
Питательные среды, растворы и реактивы
При проведении экспериментальных исследований использовали стандартные и модифицированные плотные (агаризованные) и жидкие ПС, как общеизвестного в микробиологии состава, а также вновь разработанные в ходе проведения работ: мясопептонный бульон на основе мясной воды; мясопептонный агар на основе МПБ; питательный бульон на основе триптического перевара мяса; аммиачно-казеиновую среду на основе казеина и обработанного кукурузного экстракта; питательную среду на основе 3% солянокислотного гидроли-зата рыбной муки и обработанного кукурузного экстракта.
Другие плотные и жидкие ПС стандартного состава, использованные в настоящей работе для выращивания В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 (Гаузе, Громыко, Сабуро), готовили и анализиро вали согласно требованиям, изложенным в научной документации /66, 85/.
Наличие посторонней микрофлоры определяли с помощью мя-сопептонного бульона на основе мясной воды и с помощью селективных сред: среда Эндо - на отсутствие патогенных и условно патогенных бактерий кишечной группы; агаризованная среда Сабу-ро - на отсутствие роста грибов; среда с мочевиной - на отсутствие роста бактерий рода Proteus; желточно-солевой агар Чистовича - на отсутствие роста стафилококков.
Кроме того, в исследованиях использовали стерильные дистиллированную воду и фосфатный буфер с рН, равным 7,0 ед.рН, 50% раствор глюкозы, а также некоторые другие растворы и химические реактивы, состав и наименование которых изложен в последующих разделах работы.
В исследованиях использовали общепринятые в практике Центра ВТП БЗ методы анализа биологических, физико-химических характеристик микроорганизмов. Физико-химические методы
В бактериологической практике физико-химические показатели широко используют для изучения и характеристики состава пи тательных сред, а также в контроле правильности проведения технологического процесса их изготовления /4, 65/.
В настоящее время контроль качества питательных основ и сред проводят по методам, рекомендованным ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Определение проводят по следующим показателям: внешний вид, растворимость, цветность, влажность, показатель концентрации водородных ионов, определение общего и амин-ного азота, золы, белка, хлоридов, сульфатов, редуцирующих веществ и т.д. /36, 37/.
Оценка качества ПС по водородному показателю является необходимым и обязательным этапом анализа, так как рост микроорганизмов обеспечивается при рН от слабокислой 6,2-6,8 ед. рН до слабощелочной рН 7,2-7,4 ед. рН и от данного показателя будет зависеть качество конечного продукта /65/. Определение рН проводили потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода в соответствии с ГФ.
Общий азот определяется методами Къельдаля и Несслера. Для оценки содержания азота в составе аминогрупп использовали показатель "аминный азот", определение которого проводили методом формольного титрования /47, 37, 84/.
Хлор-ионы в питательной среде определяли аргентометриче-ским методом, где титрантом является стандартный раствор нитрата серебра.
Разработка технологии глубинного способа культи вирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. lichenifor mis №31
Для разработки и испытания новых ПС необходимо было определить перечень компонентов из числа источников азотистых веществ, отвечающих питательным потребностям (точнее, пластичности метаболизма) бактерий, ростовых и витаминных добавок. В частности, были установлены высокие питательные и ростовые свойства казеина, кислотного и триптического переваров рыбной муки, ростовые и витаминные особенности КУКа /7,42, 52, 101/. С учетом данных литературы предполагалось, что кормовые дрожжи также обладают приемлемыми для решения данной задачи характеристиками/49, 79/.
Глюкоза является легкоусваемым энергетическим субстратом и, по сравнению с крахмалом, не требует предварительной подготовки, вследствие чего, естественно, и бактериям требуется меньше времени и энергозатрат для ее метаболизма. Тем не менее, сказанное отнюдь не исключает возможности использования крахмала для указанных целей после установления общих закономерностей конструирования ПС и спорогенеза исследуемых бактерий.
Что касается ростовых и витаминных добавок, то пептон, на наш взгляд, при всех его положительных качествах не может быть включен в состав ПС: во-первых, он является высокотехнологичным продуктом переработки пищевого продукта (мяса, летошки и рубца); во-вторых, источники его поступления, как правило, находятся вне пределов России, вследствие чего возможности его приобретения и поставки затруднена.
Подобные затруднения будут иметь место и при использовании дрожжевого экстракта (ДЭ). Тем более, что опыт работы с культурами штамма СТИ-1 указывает на возможность замены ДЭ КУКом. Это в совокупности с другими свойствами данного вещества позволяет рассматривать его в качестве перспективного компонента ПС.
Не отрицая общеизвестной ценности кормовой рыбной муки в качестве источника азотсодержащих компонентов, высокое содержание в продукте жиров и других, примесей затрудняют возможность стандартизации и применения ее в составе ПС.
Кроме того, учитывая тенденцию влияния содержания азотистых веществ и их характера на развитие глубинных культур В. subtilis №3 предварительно было целесообразным определить два принципиальных момента: во-первых желательный уровень содержания в ПС общего и аминного (как показателя степени расщепления белков) азота; во-вторых, характер влияния степени расщепления гидролиза-та на ростовые свойства ПС.
С этой целью были проведены эксперименты на аммиачно-казеиновой среде, разработанной ранее в Центре, и ее вариантах с различным содержанием азотистых веществ, а также образцах ПС, приготовленных с использованием в качестве основы солянокис-лотного гидролизата казеина. При этом минеральный состав и другие компоненты (КУК, глюкоза и т.п.) в этих образцах ПС сохранялись на уровне их содержания в вышеуказанной среде.
Аммиачно-казеиновая среда включает в себя следующие компоненты: казеин, КС1, СаС12.6Н20, MgS04.7H20, FeS04.7H20, MgS04.5H20, витамин В1, КУК, глюкозу.
Результаты приведены в таблицах 1,2. Анализ результатов выращивания В. subtilis №3 на аммиачно-казеиновой среде и ее вариантах (с 15 и 5 г.дм" казеина) показывает (таблицаї), что содержание общего и аминного азота, при равных концентрациях глюкозы и значений показателя KLa, оказывает значимое влияние на скорость развития спорогенеза и качество получаемых при этом глубинных культур. Так, при более высоком их содержании (268 и 52 мг%) значения показателей КС, БК и Т8з на 44 ч роста составили примерно 0,8 и 0,4 109 кл.см"3 и 13% соответственно, в то время как при стандартном содержании (210 и 43 мг%) к 40 ч они равнялись 2,8 и 2,5.109.кл.см"3 и 13%. Это свидетельствует, на наш взгляд, о том, что более высокое содержание в среде азотистых веществ при прочих равных условиях (глюкоза - Юг. дм"3, KLa = 1,3.02.дм"3.ч"\) не сопровождается увеличением накопления биомассы, а наоборот, ее уменьшением, при этом число термоустойчивых спор (зрелых и незрелых) также ниже соответственно 0,05 и 0,31.10 9.кл.см"3. Уменьшение же содержания рассматриваемых компонентов (ІЧобщ = 115 мг% и NaM = 30 мг%) оказывает явное положительное влияние: величины показателей КС, БК и Т8з составили на 42 ч 2,8 и 2,2.109.кл.см"3 и 65% соответственно; при этом число термоустойчивых спор было равным 1,4.109.кл.см"3, т.е. максимальным в данных опытах. Реакция среды в этих культурах была примерно одинаковой (8,8-8,9 ед.рН).
Эти результаты не могут быть объяснены недостатком энергетического субстрата или кислорода, а указывают на целесообразность значительного уменьшения в составе ПС азотистых компонентов.
Анализ результатов выращивания микроорганизмов на амми-ачно-казеиновой среде и ее вариантах с заменой стандартной основы казеина на солянокислотный гидролизат казеина (таблица 2) свидетельствует о том, что при равных величинах KLa и содержания в ПС глюкозы рост, развитие и спорообразование В. subtilis 3 происходит быстрее на средах с расщепленным белком.
Следует особо отметить, что на стандартной среде с содержанием общего и аминного азота, равным соответственно 174 и 41 мг%, к 45 ч в среде накапливается около 1,2.109.кл.см 3, что примерно в 2 раза меньше чем в предыдущих опытах (таблица 1). Число термоустойчивых спор при этом равно 0,4.109.кл.см"3, т.е. вполне сопоставимо с результатами, полученными в предыдущих экспериментах (таблица 1).
Стандартизация качества жидких питательных сред для глубинного культивирования В. subtilis №3 и В. Н-cheniformis №31
В процессе проведения исследований по разработке глубинного способа выращивания антагонистически активных спорообра-зующих бактерий В. subtilis №3 и В. licheniformis №31, как основы принципиально новой отечественной технологии получения био-спорина, были сконструированы жидкие питательные среды, получившие соответственно условные наименования № 4 и № 7 . В состав этих сред включены ГК и КУК ( при определенных соотношениях этих основных компонентов и фиксированных уровнях содер-жания аминного азота - 0,29 и 0,39 г.дм", соответственно) и набор некоторых общепринятых для выращивания культур рода Bacillus солей, обеспечивающих потребности вегетативных и спорулирую щих бактерий в ионах Mg2+, Са2+, Na+, Мп2+ и некоторых других элементов /21, 22, 30, 51, 70/. Эти среды в большинстве опытов по выращиванию бактерий во флаконах на качалке, в ферментерах Ф-1 (вместимостью 12 дм ) и КМ-0,1 (вместимостью 100 дм ) при выбранных в качестве предварительных параметрах культивирования (коэффициенте аэрации, типе мешалки и числу оборотов, температуре и величине ПД) позволяли в целом получать НК с характеристиками, обеспечивающими возможность получения препарата «Биоспорин».
Однако в ряде случаев имели место явления атипичного роста и спорогенеза культур обоих видов бактерий, заключающиеся при прочих равных условиях в том, что накопление биомассы происходило медленно и не достигало уровней базовых и, что не менее значимо, - спорообразование имело место только у незначительной части клеток в популяции и ограничилось I-III, реже IV стадиями /13, 14, 70, 106/, т.е. носило незавершенный характер. Основными причинами такого атипичного роста и развития глубинных культур микроорганизмов служили прежде всего нестандартность качества ПС по их ростовым и спорообразующим свойствам, не регистрируемые общепринятыми физико-химическими методами анализа и их характеристики /31, 35, 54, 68/. С другой стороны, определенное отрицательное влияние могло оказать и качество собственно посевных рабочих культур в сочетании с несоблюдением параметров процесса глубинного выращивания. Поэтому описанные явления атипичного роста спорогенеза глубинных культур подлежали уст ранению, как недопустимые в разрабатываемой экспериментально-производственной технологии.
Это обусловило необходимость проведения соответствующих теоретических и экспериментальных исследований, результаты которых приведены ниже.
Стандартизацию ПС прописей № 4 и № 7 осуществляли следующим образом. Первоначально провели ретроспективный анализ состава, физико-химических характеристик и особенностей приготовления различных серий ПС, использованных в экспериментах по глубинному выращиванию В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 во флаконах и ферментерах КМ-0,1, с одной стороны, и ростовых свойств этих сред, с другой стороны.
Установлено, что одной из основных причин низких ростовых свойств ПС служила нестандартность сырья.
Поэтому нами был стандартизован порядок компоновки ПС прописей № 4 и № 7 следующим образом: во-первых, при расчетах содержания основных компонентов с учетом конечных величин NaM (0,29±0,02 и 0,39±0,02 г.дм"3) в обязательном порядке (см. таблицу 17) необходимо придерживаться рекомендованных соотношений ГК и КУКа, равных соответственно 1,0:1,0 (допускается 1,0:1,25) и 1,0:1,6 (допускается 1,0:1,4); и во-вторых, при замене сырья (прежде всего, КУКа) требуется приведение анализа его характеристик (N и NaM) и предварительная оценка ростовых и способствующих спорообразованию свойств получаемых на его основе ПС в опытах на качалке.
В дальнейшем, в опытах на качалке после корректировки соотношения ГК и КУКа в ПС изучили влияние содержания редуцирующих веществ (РВ) на характеристики НК.
Результаты этих экспериментов, приведенные в таблице 18, показали, что расчетные и опытные концентрации РВ имеют существенные различия причем, как правило, в сторону завышения последних.
Из анализа материалов таблица 18 следует, что из изученных концентраций глюкозы и величин KLa, по значениям показателей ОП, БК и BKt, лучшие характеристики присущи НК, выращенным на ПС с концентрацией глюкозы - (21 ±2) г.дм"3 при KLa = 1,12 г.Ог-дм .ч"1, однако величина рН конкретных культур имеет более выраженное щелочное значение при меньшем содержании РВ.
Поэтому нами было осуществлено усреднение характеристик (таблица 18), которое позволяет более наглядно представить указанную роль глюкозы ( таблица 19).
Оптимизация условий приготовления и параметров оценки качества посевных рабочих культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31
Качество посевных материалов (ПМ), включая порядок их приготовления и подготовки к работе, является значимым фактором глубинного культивирования микроорганизмов /5, 12, 44/. Для выращивания спорообразующих бактерий применяют два вида рабочих посевных культур: споровые и вегетативные. В качестве посевных культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 используют споровые культуры, выращенные на ПС Гаузе № 2 в биологических матрацах /28/.
Споровые рабочие культуры могут быть приготовлены либо из лиофилизированных музейных (эталонных) культур после их ре-гидратации и пересева ( не реже одного раза в год) /50,51/, либо же из культур, хранящихся на скошенных агаризованных ПС Гаузе № 2 под слоем стерильного вазелинового масла при температуре (2±2)С. Обязательным требованием является обеспечение минимального количества предшествующих репродукций (2-3 не более), во избежание возможных диссоциативных изменений и потери высоких репродуктивных свойств, характерных для этих бактерий.
Рабочие культуры выращивали в биологических матрацах на агаровой ПС Гаузе № 2 при температуре (37±1)С. Ежедневно, начиная с 3 суток культивирования, определяли типичность роста и спорообразования, отсутствие ПМФ и инволютивных форм путем микроскопического анализа проб. Через 5-6 суток для В. subtilis №3 и 6-7 суток для В. licheniformis №31 оценивали завершенность спорообразования. По окончании процесса спорообразования культуры смывали с поверхности агара 0,85%-ным раствором хлорида натрия и оценивали качество /85/.
В таблице 21 приведены результаты, характеризующие развитие и спорообразование В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 на ПС Гаузе № 2 в биологических матрацах в течение 8 суток культивирования.
Анализ полученных данных показывает, что на 1 сутки для В. subtilis №3 наблюдается до 50% проспор, а на 7-8 сутки - уже до 40-50% вегетативных клеток; для В. licheniformis №31 на 1 сутки регистрировали единичные проспоры, а на 8 сутки - также до 50% вегетативных клеток. Следовательно, спорообразование для В. subtilis №3 заканчивается в основном к 5-6 суткам, а для В. licheniformis №31 к 6-7 суткам Приготовленные таким образом споровые рабочие культуры имеют высокую терморезистентность (Т83 не менее 50%) и минимальную гетерогенность популяции (не более 10%) и могут быть рекомендованы для использования в качестве ПМ для ферментеров.
Характеристики рабочих культур В. subtilis и В. licheniformis, приготовленных в 1993-1994 гг., представлены в таблице 22. В графе «норма» (таблица 22) представлены требования, сформулированные в итоге настоящей работы и включенные в регламент/85/.
Как следует из данных таблицы 22, рабочие культуры микроорганизмов, приготовленные для производства биоспорина в 1993-1994 гг., соответствовали установленным требованиям, за исключением серии 4, которая отличалась повышенной гетерогенностью (22%) и меньшим содержанием зрелых спор (80%). Приготовленные рабочие культуры в дальнейшем были использованы в качестве ПМ при приготовлении опытных и установочных серий биоспорина.
Далее проводили эксперименты, оценивающие влияние термоактивации споровых рабочих культур на скорость их прорастания с использованием турбидиметрического метода, для чего применяли турбидиметр (ФЭТ-60) с термостатированной ячейкой и магнитной мешалкой. В исследованиях применяли споровые рабочие культуры с концентрацией 1,0.107 кл.см 3, термоактивированные при (70±1)С в течение 30 мин. и без тепловой обработки. В ячейке поддерживали температуру (37,0±0,5)С, изменение оптической плотности оценивали при длине волны 582 нм (светофильтр № 5). Продолжительность опыта устанавливалась по достижению микробной культурой исходных величин оптической плотности. На рис. 9, 10 приведены характерные кривые изменения оптической плотности споровых рабочих культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 в зависимости от применения термоактивации.
