Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные принципы лиофилизации иммунобиологических лекарственных препаратов 10
1.1. Иммунобиологические лекарственные препараты иммуноглобулиновой природы 10
1.2. Лиофилизация как метод стабилизации иммунобиологических лекарственных препаратов 13
1.3. Лиопротекторы, применяемые при лиофилизации препаратов для парентерального введения 22
Собственные исследования 29
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований 29
2.1. Объекты исследований 29
2.1.1. Иммуноглобулиновые препараты 29
2.1.2. Вирусный штамм 30
2.1.3. Экспериментальные животные 30
2.2. Материалы и методы исследований 31
2.2.1. Реактивы и растворы 31
2.2.2. Приборы и оборудование 32
2.2.3. Определение тепловых параметров 34
2.2.4. Определение агрегатов и фрагментов 35
2.2.5. Определение концентрации белка 36
2.2.6. Определение потери в массе при высушивании 36
2.2.7. Определение растворимости 37
2.2.8. Определение видоспецифичности 37
2.2.9. Определение прозрачности и цветности
2.2.10. Определение электрофоретической однородности 38
2.2.11. Определение концентрации водородных ионов (рН) 39
2.2.12. Определение остаточного этилового спирта з
2.2.13. Определение остаточного риванола 39
2.2.14. Определение токсичности 40
2.2.15. Определение пирогенности 40
2.2.16. Определение специфической активности in vivo 40
2.2.17. Определение специфической активности in vitro 41
2.2.18. Определение стерильности 42
2.2.19. Статистические методы 42
Глава 3. Исследование тепловых характеристик антирабического иммуноглобулина, влияющих на процесс лиофилизации 43
3.1. Определение эвтектической температуры антирабического иммуноглобулина 43
3.2. Изучение тепловых параметров антирабического иммуноглобулина 45
Глава 4. Разработка технологии сублимационного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его F(ab )2-фрагментов 51
4.1. Подбор лиопротекторов и определение оптимальной рецептуры лиопротектор/препарат для получения лиофилизированной формы антирабического иммуноглобулина 51
4.2. Исследование влияния температурно-временных параметров лиофилизации на качественные характеристики препарата 55
4.3. Расчет экономической эффективности внедрения оптимизированной технологии лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина 72
Глава 5. Исследование свойств лиофилизатов гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Г(аЬ )2-фрагментов 77
5.1. Исследование молекулярно-массового состава антирабического иммуноглобулина жидкой и лиофилизированной форм 77
5.2. Анализ спецификационных показателей лиофилизатов антирабического иммуноглобулина и его Г(аЬ )2-фрагментов 81
5.3. Изучение стабильности лиофилизатов антирабического иммуноглобулина в процессе длительного хранения 88
Заключение 91
Выводы 94
Список сокращений 96
Список литературы 98
- Лиофилизация как метод стабилизации иммунобиологических лекарственных препаратов
- Иммуноглобулиновые препараты
- Изучение тепловых параметров антирабического иммуноглобулина
- Исследование влияния температурно-временных параметров лиофилизации на качественные характеристики препарата
Лиофилизация как метод стабилизации иммунобиологических лекарственных препаратов
Считается, что жидкая форма ИЛИ наиболее экономична и удобна для использования потребителем, однако жидким формам лечебных иммуноглобулинов присущи существенные недостатки: меньшая стабильность и возможное снижение титров специфических антител во время длительного хранения, опасность образования фрагментов и агрегатов. Агрегация способствует образованию труднорастворимых высокомолекулярных комплексов, вызывающих активацию системы комплемента [90, 94, 226]. Известно, что именно агрегаты в препаратах ИГ жидких форм способствуют проявлению побочных анафилактоидных реакций [8].
По мнению ряда авторов, одной из причин агрегации молекул ИГ в процессе хранения является перекисное окисление липидов, обусловленное присутствием в лекарственной форме лабильных липопротеинов и прооксидантов (гемопротеи-нов, металлов переменной валентности) [46, 94]. Продукты окисления липидов вступают во взаимодействие с молекулами ИГ, вызывая агрегацию белков. За счет образования дисульфидных связей между белковыми молекулами и липида-ми снижается устойчивость белковых растворов. Причиной агрегации, снижающей эффективность иммунологических реакций, может служить высокая концентрация белков в жидких формах ИГ [125, 157, 184, 198, 201]. Агрегации молекул иммуноглобулина в жидкой форме может способствовать наличие остаточного спирта, используемого для осаждения специфической фракции [34, 35], а также высокий негативный заряд стекла первичной упаковки [44].
Фрагментация, являющаяся следствием нестабильности жидких форм ИГ, приводит к снижению нейтрализующей активности антител и повышенному клиренсу ИГ из организма [85]. При фракционировании иммунных сывороток спиртом жидкие формы ИГ, в отличие от лиофилизированных, содержат в своем составе небольшое количество сывороточных протеаз типа фибринолизина и тканевых катепсинов, которые в процессе хранения способны вызывать расщепление иммуноглобулина с образованием низкомолекулярных фрагментов [41, 50, 96].
В изученной литературе практически нет современных работ, касающихся исследований молекулярно-массового состава гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Исследования по определению молекулярных параметров АИГ из сыворотки крови лошади проводились в 70-х годах прошлого столетия в Томском НИИ вакцин и сывороток, о чем свидетельствуют единичные работы [72, 74]. Авторы указывают, что в результате гель-фильтрации образцов антирабического иммуноглобулина на хроматограммах наблюдали 2-4 пика: один или два первых пика меньшего размера соответствовали агрегатам, затем следовал основной пик мономерной фракции. В процессе хранения иммуноглобулина появлялся дополнительный пик после мономерной фракции, соответствующий фракции фрагментов. В препарате антирабического иммуноглобулина производства Томского НИИ ВС на момент выпуска содержание агрегатов - наиболее реактогенной молекулярной фракции, составляло 3,8 %; после двух лет хранения эта величина возросла до 27,9 %. Фракция фрагментов соответственно составила 0,9 % и 14,8 %. Столь значительное содержание нежелательных для иммуноглобулина фракций, безусловно, объясняется несовершенными методами очистки, применяемыми в 70-е г.г. XX века при выпуске препарата специалистами Томского НИИ ВС.
Повысить стабильность иммуноглобулиновых препаратов возможно при снижении концентрации липопротеидов и применении антиоксидантов, ингибирующих свободные радикалы [19, 41], но лучшим способом достижения стабильности всех качественных показателей ИГ в процессе длительного хранения является лиофилизация [16, 31, 38, 154, 170, 204].
Под лиофилизацией понимают процесс удаления воды из замороженного материала [15, 45, 51, 60, 143, 177, 191]. Данный процесс протекает в вакуумной среде в условиях заморозки препарата от минус 10 до минус 70 С. Благодаря низким температурам, при которых осуществляется процесс, лиофилизации могут быть подвергнуты продукты, теряющие свои свойства при высоких температурах - ферменты, белки, витамины [30, 137, 138].
В технологии лиофилизации ИЛП применяют сублимационные установки как камерного, так и диффузаторного типа. Конструкция установки предусматривает наличие камеры сублиматора, снабженного полками, на которые помещают препарат в первичной упаковке (ампулы, флаконы). Полки сублиматоров камерного типа, в отличие от диффузаторного, снабжены охлаждающими элементами, с помощью которых можно осуществлять предварительное замораживание ИЛП. Нагрев полок сублиматоров обоих типов осуществляется нагревательными элементами. Установки снабжены вакуумным насосом, который создает разрежение внутри камеры сублиматора и конденсатора. Компрессор обеспечивает охлаждение конденсатора и полок сублиматора. При этом температура в конденсаторе поддерживается на протяжении всего цикла лиофилизации в пределах от минус 50 до минус 80 С.
Энергия, требуемая для испарения влаги из высушиваемых препаратов, передается от нагревательных элементов полки. Испарившаяся из препарата влага в виде пара под действием разности парциальных давлений пара перемещается и осаждается на поверхности конденсатора.
При лиофильном высушивании объект претерпевает незначительные химические видоизменения благодаря низкой температуре, благоприятной газовой среде с минимальной концентрацией кислорода, а также отсутствию жидкой фазы растворителя [49, 88, 106]. Качественно лиофилизированный продукт должен обладать хорошей растворимостью в воде и при растворении сохранять все свойства исходного вещества без потерь качественной и количественной целостности. Разнообразие свойств иммунобиологических препаратов диктует необходимость индивидуального подхода к разработке рациональных биотехнологических приемов по их высушиванию с учетом спецификационных требований к качеству готового продукта.
Лиофилизация состоит из трех основных этапов: замораживание, первичная сублимация и десорбция (досушивание) [45, 59].
Замораживание является первой и важнейшей стадией лиофилизации, при которой формируется окончательная структура продукта, влияющая на качество лиофилизированного материала.
Замораживание может проходить по двум механизмам затвердевания: кристаллизации, при котором молекулы упорядочены; аморфизации - процесса с неупорядоченным расположением молекул и атомов. Однако деление это носит условный характер, поскольку часто кристаллизационные и аморфные фазы имеют комбинированный характер. Предварительное замораживание протекает в две стадии: кристаллизация воды в препарате или первичная кристаллизация, далее кристаллизация растворенного вещества или вторичная кристаллизация [169, 174]. На качество процесса замораживания в значительной степени влияет состав продукта. Если в состав замораживаемого объекта входят соли или способные к кристаллизации вещества, такие как глицин или маннит, то замораживание раствора происходит по механизму эвтектики - выделения смеси кристаллов растворенных веществ и льда. Если основным компонентом являются вещества, не склонные к кристаллизации (желатин, полиглюкин) или углеводы, кристаллизация которых требует длительного времени и положительных температур (сорбит, сахароза, лактоза), то отверждение маточного раствора при замораживании происходит по механизму стеклования [71, 203].
Иммуноглобулиновые препараты
Реакцию нейтрализации (РН) фиксированного вируса бешенства осуществляли на белых мышах {Mus musculus) линии BALB/c массой (11±1) г, прошедших контроль генетической стандартности лабораторных животных инбредных линий. Испытания на токсичность проводили на беспородных морских свинках {Cavia porcellus) массой (300±50) г и беспородных белых мышах массой (19±1) г. Испытания антирабического иммуноглобулина на пирогенность проводили на кроликах {Oryctolagus cuniculus) породы «Шиншилла» массой (2,0±0,5) кг. Экспериментальные животные содержались в соответствии с Приказом № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» (2003) и «Положением о контроле качества лабораторных животных, питомников и экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным Министром здравоохранения РФ 23.04.2003 г. и президентом РАМН 22.04.2003 г. 2.2. Материалы и методы исследований 2.2.1. Реактивы и растворы
Для приготовления рабочих растворов использовали реактивы зарубежного и отечественного производства, соответствующие квалификации чистоты «хч» или «чда». Вода очищенная, ФС 42-2619-97 - для приготовления растворов. Вода для инъекций, ФС 42-2620-97; натрий хлористый, ГОСТ 4233-77 - для приготовления 0,9 % физиологического раствора. Вода деионизованная, раствор БСА (1 %) - для постановки дот-иммуноанализа (ДИА). Антигенный диагностикум на основе наночастиц коллоидного золота (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») - для изучения протективных свойств лиофилизатов ан-тирабического иммуноглобулина и его F(ab -фрагментов in vitro в дот-иммуноанализе.
0,2 % раствор нитрата серебра, ГОСТ 1277-75; 0,5 % раствор лимонной кислоты, ГОСТ 908-2004; 0,2 % раствор метола (4-метиламинофенол сульфата), ГОСТ 25664-83 - для приготовления раствора физического проявителя для усиления цветового сигнала при постановке ДИА.
Набор реагентов «Общий белок-01-Витал» (ООО «Витал Диагностике СПб») ТУ9398-002-52145831-2004; отраслевой стандартный образец содержания белка в иммуноглобулине НЦ ЭСМП ОСО 42-28-340-1Ш, стандартный образец предприятия (СОП) содержания белка в иммуноглобулине СОП 05-06-13 - для измерения содержания белка в антирабическом иммуноглобулине биуретовым методом.
Сыворотки диагностические адсорбированные жидкие, преципитирующие белки крови человека и животных, для судебно-медицинских целей, ТУ 9389-017-01895016-07 - для подтверждения подлинности иммуноглобулина. 20 % вируссодержащая мозговая суспензия белых мышей, зараженных фиксированным вирусом бешенства «CVS»; сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая, ТУ 9385-009-13175637-2008; Второй Международный стандарт иммуноглобулина человеческого против бешенства (код NIBSQRAI, SSI, Дания; MBSC, Великобритания) - для постановки биологической реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах.
Сахароза, ГОСТ 58-33-75; мальтоза, ТУ 6-09-210-77; глицин (имп.) были использованы в качестве лиопротекторов. Ультрагель трисакрил GF 2000М (IBF, Франция) - для определения молекулярных параметров антирабического иммуноглобулина. Термический анализ образцов иммуноглобулина проводили на дифференциальном сканирующем калориметре DSC 204 Fl («Phoenix», Германия).
Определение эвтектической точки проводили с помощью низкотемпературного холодильника НС 700/50 («Frigera», Чехия) с регистрацией данных на установке лиофильного высушивания Frigera LZ-9 (Чехия).
Для охлаждения и замораживания антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ )2-фрагментов использовали рефрижератор сверхнизких температур MDF-U7386S («Sanyo», Япония), для регистрации значений использовали датчик и точечный самописец «Зепакорд».
Лиофилизацию антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ )2-фрагментов проводили на установках Frigera LZ-9 (Чехия), Heto Power Dry PL9000/-50/HSC (Дания), Epsilon 2-6 D («Christ», Германия).
Бокс абактериальной воздушной среды (класс II А) БАВп-01-«Ламинар-С»-1,5 (210.150.01) (Россия) и термостат электрический суховоздушный ТС-1/80 СПУ (Россия) - для проведения испытаний на стерильность. Шкаф сушильный лабораторный вакуумный ШСЛВ (Россия) и весы лабораторные электронные РА-214С («Pioneer», США) использовали для определения потери в массе при высушивании и для взвешивания реактивов.
Концентрацию белка в растворе иммуноглобулина, прозрачность и цветность препарата определяли на фотоэлектрическом концентрационном колориметре КФК-2МП (Россия).
Исследование эвтектической температуры (Тэвт) раствора антирабического иммуноглобулина проводили методом электропроводности [207]. Метод основан на параллельном замере температуры материала и величины удельного сопротивления исследуемого объекта при его замораживании и оттаивании. В качестве контрольного раствора использовали раствор 0,9 % натрия хлористого, эвтектическая температура которого составляет минус 21 С. В плексигласовый стакан вносили 100 мл исследуемого раствора и фиксировали в нем датчики температуры и удельного сопротивления. Образцы замораживали в холодильном агрегате HZ 280/175 А до температуры минус 70 С. Величина удельного сопротивления при данной температуре соответствовала 100 мОм, после чего замораживание прекращали. При оттаивании образца, представляющего собой ледяной блок, измеряли сопротивление, величина которого уменьшалась с повышением температуры. Точка, в которой наблюдали переход от линейной зависимости к криволинейной, соответствовала эвтектической температуре исследуемых растворов.
Определение тепловых параметров иммуноглобулина проводили методом дифференциально-сканирующей калориметрии (ДСК) на ДСК-калориметре в диапазоне от минус 70 С до комнатной температуры. Определяли количество экзотермических пиков, соответствующих кристаллизации (при замораживании иммуноглобулина) и количество эндотермических пиков, соответствующих плавлению (при нагревании иммуноглобулина). ДСК-калориметр предварительно калибровали по шести стандартам высокой чистоты - ц-гексан (99,96 %), ртуть (99,99 %), бифенил (99,5 %), индий (99,999 %), олово (99,999 %) и висмут (99,9995 %) для соответствия измеряемой температуры на калориметре международной температурной шкале. Во всех опытах использовали алюминиевые кон 35
тейнеры с крышкой объемом соответственно 40/25 мкл. Для исключения влияния материала тигля проводили коррекцию опытных данных на материал тигля. Сканирование проводили по составленной температурной программе, при этом на место «образец сравнения» и «образец» в калориметр помещали пустые алюминиевые тигли. Далее в измерительную ячейку на место «образец» помещали предварительно загруженные и запечатанные алюминиевые тигли с исследуемыми образцами иммуноглобулина. Образец раствора взвешивали на весах с точностью ±0,01 мг. Масса образцов для ДСК-измерений составляла от 0,63 до 1,43 мг. В измерительной ячейке пустой алюминиевый тигель оставался на месте «образец сравнения». Проводили сканирование по программе в автоматическом режиме исследуемых образцов в атмосфере аргона. Охлаждение образцов осуществляли жидким азотом. Обработку ДСК-кривых проводили по программам, входящим в комплект технического обеспечения ДСК-калориметра.
Изучение тепловых параметров антирабического иммуноглобулина
Практический интерес представляли исследования по лиофильному высушиванию экспериментальных серий F(ab -фрагментов антирабического иммуноглобулина. В работе использовали установку лиофильного высушивания Power Dry. Препарат F(ab )2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, соответствующий требованиям НД Р N 002639/01-250210 на «Иммуноглобулин антира-бический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций», высушивали во флаконах объемом 3 мл в дозировке 1 мл. В качестве стабилизатора был использован глицин в конечной концентрации (2,25±0,25) %. При разработке схемы лиофилизации F(ab )2-фрагментов учитывали оптимальные параметры, выявленные при высушивании цельного иммуноглобулина.
Основные параметры высушивания F(ab )2-фрагментов антирабического иммуноглобулина представлены в таблице 7.
Лиофилизат F(ab -фрагментов представлял собой хорошо сформированную таблетку белого цвета с однородной мелкопористой структурой. Изучение физико-химических и биологических свойств лиофилизированных F(ab )2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, представленных ниже в главе 5, подтвердило эффективность предложенных биотехнологических приемов по сублимационному высушиванию очищенного иммуноглобулина.
В рамках настоящей работы были проведены исследования по лиофильно-му высушиванию антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл. Данная дозировка оправдана при изготовлении СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина. СОП необходим для обеспечения единства требований к качеству препаратов для постэкспозиционной профилактики бешенства при оценке показателя «специфическая активность» при проведении внутрипроизводственных и внешних контрольных исследований. Специфическая активность иммуноглобулина оценивается в Международных единицах (ME), и для определения специфической активности каждой получаемой серии антирабического иммуноглобулина необходимо сравнить его нейтрализующую активность с таковой у Международного стандарта специфической активности либо СОП, калиброванного против международного стандарта. Для приготовления СОП была использована производственная серия 0141 антирабического иммуноглобулина, отвечающая требованиям ФСП. Лиофильное высушивание образцов проводили на установке Epsilon 2-6 D «Christ», включающей: конденсатор (рабочая температура до минус 85 С, производительность 6 кг льда в сутки); камеру с тремя полками, термостатируемыми в пределах от минус 45 С до 60 С; систему управления с электронным дисплеем, отображающим параметры процесса (величина вакуума, температура конденсатора, температура материала, температура полки), укупорочное устройство (Рисунок 12). Данная установка является наиболее подходящей для лиофилизации небольших объемов препарата и обладает рядом существенных преимуществ: этап замораживания происходит непосредственно в камере установки, что исключает риск микробной контаминации препарата при переносе из одного вида оборудования на другое; нет необходимости использования дополнительного холодильного оборудования; конструкция установки позволяет автоматически закрывать флаконы резиновыми пробками сразу после высушивания, что также предпочтительнее для стерильно разливаемых растворов.
Иммуноглобулин разливали по 1 мл во флаконы объемом 3 мл, замораживали с учетом эвтектической температуры при атмосферном давлении непосредственно на полках сублиматора до температуры минус (38±1) С. Для подбора оптимальных параметров первичной и вторичной десорбции процесс высушивания осуществляли при нескольких режимах (способах). По 1 способу первичную лио-филизацию проводили при температуре препарата от минус (38±1) С до (25±1) С, со скоростью нагрева полки 6,3 С/ч, десорбцию проводили в течение (2±1) ч при температуре полки (30±1) С. После лиофилизации препарат имел вид таблетки со следами вспенивания, что свидетельствовало о имевшем месте коллапсе; остаточная влажность препарата составляла 3 %, время растворения - 30 мин.
По 2 способу лиофилизацию проводили при температуре препарата от минус (3 8± 1) до (25±1) С со скоростью нагрева полки 3 С/ч, вторичную десорбцию проводили в течение (2±1) ч при температуре полки (30±1) С. Лиофилизат представлял собой хорошо сформированную таблетку белого цвета, остаточная влажность составляла - 1,09 %, время растворения - 1 мин. Третий способ лиофилизации иммуноглобулина отличался от второго тем, что этап десорбции проводили в течение (5±1) ч при температуре полки 30 С. После лиофилизации препарат имел вид хорошо сформированной таблетки белого цвета, показатель остаточной влажности составлял 0,08 %, что обусловило плохую растворимость - 40 мин.
Учитывая результаты экспериментов, для лиофильного высушивания анти-рабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл во флаконах объемом 3 мл на установке Epsilon 2-6 D «Christ» предложены параметры, изложенные в таблице 8. Полученный СОП специфической активности АИГ представлял собой хорошо сформированную таблетку белого цвета с показателем потери в массе при высушивании (1,09±0,03) % и растворимостью (1,0±0,2) мин. Основным критерием качества данного образца являлась специфическая активность, определенная in vivo в реакции нейтрализации на белых мышах в сравнении с II Международным стандартом иммуноглобулина против бешенства активностью 30 МЕ/мл. Данные по определению специфической активности СОП в тесте in vivo приведены в таблице 9.
Как следует из представленных в таблице 9 результатов, в 4 сериях опытов зарегистрированы показатели специфической активности более 150 МЕ/мл, что удовлетворяет требованиям НД на антирабический иммуноглобулин. Среднее значение показателя специфической активности лиофилизированного образца-кандидата, откалиброванного против II Международного стандарта, составило (192,1±17,83) МЕ/мл, что позволило рекомендовать его как СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина.
Исследование влияния температурно-временных параметров лиофилизации на качественные характеристики препарата
Неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по бешенству в Российской Федерации определяет высокую востребованность гетерологичного антирабического иммуноглобулина - препарата для постэкспозиционной профилактики бешенства, производимого в РосНИПЧИ «Микроб». В настоящее время препарат выпускают в жидкой форме. С одной стороны, такая форма наиболее удобна для потребителя, однако препарату в жидкой форме присущи недостатки, связанные с нестабильностью во время длительного хранения и транспортировкой, требующей неукоснительного соблюдения холодовой цепи во избежание ухудшения свойств иммуноглобулина, главным образом, снижения вируснейтрализующей активности.
Лучшим способом сохранения стабильности антирабического иммуноглобулина при длительном хранении и транспортировке является лиофилизация, широко применяющаяся в биотехнологии производства иммунобиологических лекарственных средств. Для максимальной эффективности процесса сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина был необходим рациональный выбор параметров каждого технологического этапа лиофилизации, чему и было посвящено настоящее исследование.
Целью работы являлась разработка оптимальных режимов лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина, обеспечивающих максимальное сохранение его спецификационных показателей. В качестве базового варианта технологии сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина была взята технология, традиционно применяющаяся в институте «Микроб» для высушивания диагностических иммуноглобулинов на установке Frigera LZ9. Данное оборудование морально устарело, и в рамках настоящего исследования были проведены исследования по отработке режимов сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина на новых современных сублиматорах Power Dry 9000 и Epsilon 2-6 D «Christ». На первом этапе работы были исследованы тепловые параметры антирабического иммуноглобулина и определена эвтектическая температура препарата с различными комбинациями лиопротекторов: с глицином - минус 36 С; с глицином и сахарозой - минус 44 С; с глицином и мальтозой - минус 34 С. Выявлено, что оптимальным лиопротектором является глицин в концентрации (2,25±0,25) %. Определение температуры эвтектики позволило оптимизировать этап замораживания иммуноглобулина путем сокращения его продолжительности до с 14 до 9 ч.
Второй и третий этапы сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина в дозировке 5 мл осуществляли на современной установке Power Dry 9000, выгодно отличающейся от устаревшей Frigera LZ9 наличием улучшенного хладагента R404A. С использованием данной установки в результате многочисленных экспериментов оптимизированы температурно-временные параметры лиофилизации антирабического иммуноглобулина в дозировке 5 мл, а также Р(аЬ )2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл. Показано, что интенсификация процесса сублимации путем сокращения его продолжительности за счет увеличения подвода тепла не является эффективной, способствуя увеличению потерь белка и ухудшению растворимости препарата после лиофилизации. Было выявлено оптимальное значение температуры полки сублиматора - (30±1) С, время первичной сублимации при этом составило (10±1) ч.
При изучении этапа вторичной десорбции был определен оптимальный показатель потери в массе при высушивании антирабического иммуноглобулина - от 1 до 2 %, который обеспечивает хорошую растворимость препарата при хранении и неизменность показателя специфической активности.
Изучение физико-химических и биологических показателей полученных лиофилизатов выявило их соответствие требованиям НД, что подтверждает эффективность предложенной технологии.
В рамках настоящего исследования с использованием оборудования Epsilon 2-6 D «Christ» был предложен режим сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл при получении серий небольшого объема, в частности, при изготовлении СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина. Активность полученных образцов была изучена в реакции нейтрализации на белых мышах; выявленные значения подтвердили эффективность предложенного режима высушивания, а данные лиофилизаты рекомендованы в качестве СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина.
Методом гель-фильтрации было изучено молекулярно-массовое распределение в антирабическом иммуноглобулине жидкой и сухой форм. Выявлено, что при хранении жидкого иммуноглобулина в течение 3 лет в нем происходит частичная фрагментация белковых молекул до уровня (3,15±0,16) % при отсутствии агрегатов; лиофилизат иммуноглобулина через 3 года сохранил первоначальные показатели молекулярно-массового распределения и характеризовался 100 % фракцией мономеров и димеров. Полученные результаты подтверждают преимущество лиофилизированной формы антирабического иммуноглобулина, обеспечивающей стабильность молекулярных параметров в процессе хранения.
На заключительном этапе исследований была изучена стабильность свойств лиофилизированного антирабического иммуноглобулина в процессе хранения и рекомендован срок годности сухого препарата - 3 года, в течение этого периода иммуноглобулин сохраняет качественные характеристики остаются на уровне, соответствующем требованиям НД.
Похожие диссертации на Разработка технологии лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина
