Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Киназы глицерофосфолипидов 7
1.1.1. Фосфатидилинозитол 3 -киназы 7
1.1.2. Фосфатидилинозитол 4-киназы 11
1.1.3. Фосфатидилинозитол-4-фосфат5-киназы 12
1.2. Киназы сфинголипидов 13
1.3. Каталитически активные антитела 14
1.3.1. Моноклональные абзимы с синтетическими свойствами 17
1.3.2. Механизмы генерации каталитически активных антител 25
1.3.3. Природные абзимы при аутоиммунных заболеваниях 26
1.3.4. Природные абзимы молока человека 28
1.3.4.1. Абзимы с протеинкиназнои активностью 29
1.3.4.2. Иммуноглобулины класса А с липидкиназной активностью 30
1.3.4.3. Абзимы с другими типами активностей 31
1.4. Защитные факторы молока человека 33
1.4.1. Иммуноглобулины 33
1.4.2. Липиды 35
1.4.3. Олиго-и полисахариды 38
2. Материалы и методы 41
2.1. Реактивы и материалы 41
2.2. Методы 42
2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из молока человека 42
2.2.2. "Кислый шок" препаратов антител 42
2.2.3. Концентрирование препаратов антител 43
2.2.4. Определение концентрации белка 43
2.2.5. Электрофоретический анализ белка 43
2.2.6. Определение липидкиназной активности препаратов антител 44
2.2.7. Опредение полисахаридкиназнои активности препаратов антител 44
2.2.8. Анализ стабильности комплекса олигосахаридов с антителами 45
2.2.9. Гидролиз 32Р-меченных олиго- и полисахаридов 45
2.2.10. Определение протеинкиназнои активности препаратов антител 46
2.2.11. Гидрофобная хроматография антител на фенил-сефарозе SL-B6 46
2.2.12. Исследование взаимодействия антител с аффинными сорбентами 46
2.2.13. Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах с иммобилизованными анти Ig-антителами 47
2.2.14. Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах с иммобилизованными антителами против легких цепей 47
2.2.15. Тестирование липидкиназной активности антител in situ 47
2.2.16. Тестирование полисахаридкиназной активности антител in situ 48
2.2.17. Получение и очистка Fab-фрагментов иммуноглобулинов класса А 49
2.2.18. Получение и очистка Fab-фрагментов имуноглобулинов класса G 49
2.2.19. Определение кинетических параметров реакции фосфорилирования 50
2.2.20. Аффинная хроматография препаратов антител на АТР-сефарозе 50
3. Результаты и их обсуждение 51
3.1. Выделение иммуноглобулинов из молока 51
3.2. Исследование антител с липидкиназной активностью 56
3.2.1. Стабильность комплексов антитела - липиды 61
3.2.2. Анализ структуры эндогенных липидов 62
3.3. Исследование антител с полисахаридкиназной активностью 64
3.3.1. Стабильность комплексов антитела - сахариды 66
3.3.2. Анализ структуры эндогенных олиго- и полисахаридов 70
3.4. Доказательства принадлежности каталитической активности антителам 77
3.4.1. «Кислый шок» препаратов антител 78
3.4.2. Взаимодействие антител с аффинными сорбентами 79
3.4.3. Тестирование препаратов антител in situ 83
3.5. Субстратная специфичность антител 85
3.5.1. Липидкиназная активность антител 85
3.5.2. Олигосахаридкиназная активность антител 90
3.6. Локализация активных центров антител 92
3.6.1. Каталитическая активность Fab-фрагментов иммуноглобулинов 92
3.7. Кинетические параметры реакции фосфорилирования липидов 95
3.8. Кинетические параметры реакции фосфорилирования олигосахаридов 100
3.9. Возможная биологическая роль абзимов с киназными активностями 104
1. Выводы 105
2. Список литературы 106
- Моноклональные абзимы с синтетическими свойствами
- Абзимы с другими типами активностей
- Исследование антител с липидкиназной активностью
- Каталитическая активность Fab-фрагментов иммуноглобулинов
Введение к работе
Процессы фосфорилирования играют важную роль в регуляции жизнедеятельности организма; фосфорилирование существенно меняет химические свойства белков, липидов и углеводов. Реакции переноса фосфатной группы от АТР или других NTP катализируют ферменты - киназы, например, протеинкиназы фосфорилируют аминокислотные остатки, липидкиназы - ОН-группы липидов. Известно, что киназы принимают активное участие в процессах клеточного роста, деления и апоптоза.
В Лаборатории ферментов репарации ИХБФМ были впервые получены данные о том, что помимо канонических липидкиназ, способностью фосфорилировать липиды могут обладать антитела (AT), выделенные из молока здоровых рожениц. Каталитически активные антитела (КААТ), или абзимы, были найдены в крови больных астмой, аутоиммунными патологиями (СКВ, аутоиммунный тиреоидит, полиартрит, рассеянный склероз), некоторыми вирусными (СПИД, вирусный гепатит), раковыми и лимфопролиферативными заболеваниями [1 - 5]. Показано, что природные абзимы возникают при развитии аутоиммунных заболеваниях (АИЗ), а также в период беременности и лактации у здоровых рожениц и способны ускорять реакции гидролиза белков, ДНК, РНК, полисахаридов, АТР, фосфорилирования белков и некоторые другие реакции. Абзимы из крови здоровых людей катализируют ряд окислительно-восстановительных реакций [5]. Как и иммуноглобулины, генерируемые при обычном иммунном ответе, абзимы поликлональны по своей природе, т.е. представляют собой широкий набор моноклональных AT, различных по сродству к субстратам и обладающих разными каталитическими активностями.
Первыми абзимами, обнаруженными у здоровых по медицинским показателям людей, были slgA молока здоровых рожениц, катализирующие фосфорилирование около 15 белков молока. Молоко рожениц оказалось уникальным источником большого числа различных абзимов, биологические функции которых еще не до конца выяснены. Особенностью этих абзимов является более высокая каталитическая активность, по сравнению с активностью AT из крови больных с различными АИЗ.
Наряду с другими компонентами молока, антитела обеспечивают его защитные функции и ответственны за создание пассивного иммунитета ребенка в первые месяцы его жизни. В связи с этим, можно предположить, что антитела могут не только связывать компоненты патогенных вирусов или бактерий, но и при наличии у них каталитических активностей, также гидролизовать белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды вирусов и бактерий, усиливая защитное действие AT молока [1-5]. Кроме того, выдвинута гипотеза
о том, что в каталитических активностях абзимов могут быть запрограммированы
дополнительные ферментативные функции белков организма, проявления которых
наблюдается только в особых условиях, например при беременности и АИЗ. При этом до
сих остается открытым вопрос, являются ли абзимы дополнительной, резервной системой
ферментов млекопитающих, которая работает в экстремальных ситуациях и обеспечивает
такие активности, которых нет у обычных ферментов, или абзимы - это все-таки
побочный результат функционирования иммунной системы. Кроме того, нельзя
исключить, что абзимы могут иметь пока не известную специфическую биологическую
функцию в организме млекопитающих. Поэтому, исследование и сравнение абзимов у
доноров без каких-либо патологических иммунных отклонений (КААТ молока здоровых
рожениц), а также у больных с различными АИЗ, позволит понять возможные
биологические функции абзимов и внести ясность в понимание механизмов патогенеза
аутоиммунных заболеваний, которые до сих пор в большинстве случаев неизлечимы.
Основной фракцией AT молока являются секреторные иммуноглобулины класса А (slgA), продуцируемые В-клетками молочной железы. Суммарный пул иммуноглобулинов класса G (IgG) молока формируется не только в результате секреции В-лимфоцитами молочной железы, но и за счет транспорта AT из кровотока. Более того, в отличие от slgA, IgG способны проникают в кровь младенцев через эпителий кишечника [6]. Недавно было обнаружено, что slgA молока прочно связаны с липидами, которые фосфорилируются под действием этих AT. Учитывая различное происхождение и разницу в биологических функциях slgA и IgG молока, сравнение ферментативных функций этих антител представляет особый интерес.
Цель данной работы заключалась в исследовании фосфорилирующих активностей slgA и IgG молока человека. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:
Исследовать активность IgG в реакции фосфорилирования прочно связанных с ними липидов. Доказать, что липидкиназная активность является собственным свойством IgG и slgA;
Исследовать полисахаридкиназную активность slgA и IgG. Сравнить структуру эндогенных олиго- и полисахаридов, прочно связанных с slgA и IgG. Доказать, что данная активность является собственным свойством этих антител;
Изучить субстратную специфичность абзимов в реакции фосфорилирования липидов, олиго- и полисахаридов;
Определить кинетические параметры реакций фосфорилирования, катализируемых slgA и IgG.
Моноклональные абзимы с синтетическими свойствами
Изучение антител, обладающих ферментативной активностью, является одним из новых направлений, возникших в последние годы развития иммунологии и биохимии [50]. Общим свойством ферментов и антител является способность связывать специфические лиганды - субстрат или антиген. В 1948 г. Л. Полингом была теоретически обоснована принципиальная возможность индукции каталитически активных антител (КААТ) на основе общих черт механизмов узнавания антигена антителом и переходного состояния химической реакции при ферментативном катализе [51]. В 1969 г. Б. Дженкс высказал гипотезу о том, что AT, полученные иммунизацией химически стабильными аналогами переходных состояний, будут катализировать эти реакции, а их активные центры будут содержать структурные элементы, подобные таковым для ферментов [52].
Для получения абзимов были использованы гаптены, которые имитируют переходное состояние субстрата в ферментативных реакциях. Поэтому гаптены получили название аналога переходного состояния (АПС). Таким образом, AT, которые обладают высоким сродством к гаптену или АПС, при взаимодействии с субстратом снижают энергию активации реакции, что обеспечивает её протекание.
Первые экспериментальные попытки получить абзимы были предприняты Б.Д. Столляром и В. Резо, которые применили для иммунизации кроликов конъюгат N-(5-фосфопиридоксил)-3 -амино-Ь-тирозина с бычьим сывороточным альбумином [53]. Однако полученные к гаптену поликлональные антитела неэффективно ускоряли реакцию переаминирования L-тирозина [54]. И только в 1986 г. одновременно двумя группами: А. Трамонтано с соавт. [55] и С. Поллаком с соавт. [56] были получены КААТ или абзимы (abzyme от AntiBody - enZYME) с использованием гибридомной технологии для отбора клонов В-лимфоцитов, продуцирующих AT. Это были первые искусственные индуцированные абзимы.
Среди большого числа полученных к настоящему времени моноклональных абзимов основную часть составляют AT, гидролизующие сложноэфирные или амидные связи. Также получены абзимы, катализирующие реакции стереоспецифического гидролиза неактивированных эфиров, реакции рециклизации, реакции переноса ацетильного радикала и реакции с участием кофакторов [57, 58, 59].
Одной из основных проблем абзимологии является получение высокоспецифических моноклональных AT с высокой удельной активностью и высоким сродством к субстратам. В большинстве случаев AT имеют достаточно высокое сродство к антигенам (0.1 - 100 нМ), когда высокие скорости химических реакций практически не достижимы [60, 61]. Это объясняется тем, что величины максимальных скоростей и констант диссоциации (или констант Михаэлиса) связаны между собой обратной зависимостью: чем выше сродство субстрата к ферменту, тем ниже скорость его превращения [60, 61, 62]. В отличие от AT, все быстро действующие ферменты живых организмов имеют относительно низкое сродство к субстратам {Ку = 0.01-1 мМ) [62]. Таким образом, слишком высокое сродство абзимов к субстратам может быть существенным препятствием на пути создания эффективных катализаторов. Следует отметить, что первые моноклональные абзимы, катализирующие реакцию гидролиза сложных эфиров и амидов, отличались низкой скоростью и специфичностью катализа соответствующих реакций. В дальнейшем были получены новые моноклональные AT, такие как 50D8, активность которых была сравнима с таковой у аналогичных ферментов - эстераз: значение кса, для AT 50D8 было всего в 10 - 100 раз ниже, чем у эстеразы печени свиньи в реакции гидролиза эфира. Существенное улучшение каталитических свойств AT 50D8 достигнуто благодаря тому, что AT обладали высоким сродством (К; = 50 нМ) к АПС, но сродство к субстрату было достаточно низким: #л/ 1.5мМ[63].
Так как иммунная система способна отвечать практически на любой чужеродный антиген, вполне логичной казалась попытка получить КААТ, для которых нет ферментов-аналогов. Первым удачным подходом к получению таких абзимов стали AT, катализирующие реакцию Дильса-Альдера - реакцию присоединения между этиленовой связью и сопряжённой системой из двух соседствующих двойных связей, которые могут быть сведены к простой схеме:
При конструировании аналогов переходного состояния реакции Дильса-Альдера авторы работы [64] опирались на достаточно хорошо изученный механизм реакции с участием N-замещенного малеимида (И) (рис. 4), где достигалось ускорение двухсубстратной реакции циклизации приблизительно в 10 раз. Так, AT 1Е9 катализируют реакцию циклоприсоединения диоксида (I) и ./V-этилмалеимида (II) с образованием продукта III. Интермедиат III с расщеплением диоксида серы превращается продукт IV, который в результате окисления превращается в N-этил тетрахлорофталимид (V). AT 1Е9 были получены против гаптена 1, который является структурным анатогом переходного состояния (III).
Моноклональные AT 1Е9 связывали аналог переходного состояния III с Kd =1.3х10б М и показывали значение kcaJkmcat - 1000. Поэтому AT 1Е9 считаются наиболее эффективными быстродействующими катализаторами реакции Дильса-Альдера по сравнению с другими моноклональными Дильс-Альдеразами (39А11, 13G5, 10F11). Анализ кристаллической структуры данных абзимов показал, что ключевым аминокислотным остатком в связывающем кармане является остаток аспарагина Н35, образующий гидрофобные связи с карбонильной группой гаптена 1, а также с остатком триптофана Н50, что обусловливает л-стэкинг взаимодействия с кольцом сукцинимида гаптена 1.
Абзимы с другими типами активностей
В работе [102] было показано, что препараты IgG, а также их гомогенные фракции Fab и Р(аЬ)2-фрагментов обладают ДНК- и РНК-гидролизующими активностями. Исследования вклада в катализ гидролиза ДНК и РНК легкой и вариабельной цепей Р(аЬ)г-фрагмента IgG показали, что именно L-цепи, как к- так и .-типа, ответственны за связывание и гидролиз ДНК [120]. Лучшими активаторами для IgG-зависимого гидролиза олигодезоксирибонуклеотида были ионы Zn , причем активность большинства препаратов не ингибировалась при добавлении в реакционную смесь ЭДТА. Расщепление одно- и двухцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов протекало со сравнимыми скоростями, тогда как эффективность гидролиза высокомолекулярных субстратов (ДНК плазмид, ДНК фага к) была в несколько раз выше. В отличие от препаратов IgG с нуклеазными активностями, препараты sIgA обладали низким сродством к ДНК, что подтверждено результатами аффинной хроматографии на ДНК целлюлозе: около половины препаратов sIgA с нуклеотид-гидролизующей активностью не обладало сродством к этому сорбенту. Величины Км для олигодезоксирибонуклеотидов в случае sIgA (Км =1.4- 7.6 мкМ) в реакциях гидролиза были примерно в десятки раз меньше таковых для IgG (Км = 0.1 - 1.5 мкМ) [121]. Более того, было показано, что каталитический центр в молекулах sIgA располагается на L-цепи, а за связывание с субстратом отвечает Н-цепь. Сродство sIgA к различным одноцепочечным субстратам оказалось на порядок ниже, чем у IgG. Нуклеазная активность slgA проявлялась в широком диапазоне рН (5.5 - 9.0), слабо активировалась ионами Mg2+, Mn2+, Zn2+ и ингибировалась ионами Са2+ и Си2+. Как и в случае IgG молока, конечными продуктами гидролиза ODN были мононуклеотиды [121].
Субфракции препаратов IgG и slgA, а также их Fab-фрагменты кроме ДНК также гидролизуют РНК [102, 122]. Оптимум рН в реакции гидролиза РНК абзимами лежал в диапазоне 7.0 - 7.5 (для РНКазы молока оптимум рН - 7.7) и ингибировался ионами Na+ и К+, в то же время, РНК-гидролизующая активность абзимов молока практически не зависела от наличия в реакционной смеси ионов Mg2+ и Мп2+. Препараты IgG не проявляли заметной избирательности в отношении гидролиза различных по структуре и длине олигорибонуклеотидов. В то же время препараты slgA расщепляли различные гомоолигорибонуклеотиды с разной эффективностью. Эффективность гидролиза субстратов убывала в ряду r(pC)io r(pU)io»r(pA)i0 для большинства исследуемых препаратов slgA. Самыми лучшими субстратами абзимов в реакции гидролиза РНК оказались тРНК различной специфичности. Было обнаружено, что продукты реакции гидролиза TPHKL S из митохондрий человека с помощью IgG и slgA из молока одного донора практически идентичны. В отсутствии ионов металлов точки расщепления 5 -[32P]TPHKLys с помощью РНКазы A, IgG и slgA совпадают. Добавление MgCb приводит к практически полному ингибированию РНКазы А, а специфичность гидролиза тРНК антителами изменяется - расщеплению подвергаются двухцепочечные участки тРНК. Стимуляция уникальной РНКазной активности абзимов с помощью ионов магния может быть обусловлена несколькими причинами. Во-первых, координирование ионов Mg2+ в активном центре абзимов может быть необходимым для гидролитической функции. Второй возможной причиной может являться формирование активной конформации абзимов под действием ионов магния или марганца [122].
В молоке человека также обнаружены абзимы-гликозидазы. Так, в 2001 г. впервые были описаны IgG и slgA молока, обладающие амилолитической активностью [111], которые гидролизуют мальтоолигосахариды с различным уровнем полимеризации и 4-нитрофенил 4)6-0-этилиден-а,В-мальтогептазид. При этом Fab-фрагменты IgG также обладали амилолитической активностью. Величины Км гидролиза «ора-нитрофенил-a-D-глюкопиранозида препаратами IgG составляли 0.22 - 0.32 мМ, а препаратами slgA - 0.4 -0.54 мМ [123], что сопоставимо со значениями Км (5 - 0.005 мМ) для большинства известных моноклональных абзимов, а также некоторых канонических амилаз [124]. Данные значения также близки к значениям Км (около 0.35 мМ) для аутоантител с протеолитической активностью, способных гидролизовать амид Pro-Phe-Arg метилкумарина [125]. Показано, что относительная амилолитическая активность AT сильно варьирует в зависимости от доноров молока. В отличие от ос-амилазы слюны, для активации которой необходимы ионы СГ, абзимы молока способны катализировать гидролиз соответствующих субстратов в отсутствии данных ионов. При этом основное отличие IgG-зависимого гидролиза от ферментативного заключалось в том, что абзимы в 2.5 - 3 раза быстрее гидролизовали мальтогексозу, тогда как лучшим субстратом амилазы является крахмал. Максимальный уровень гидролиза пара-нитрофеннл-a-D-глюкопиранозида различными фракциями IgG и slgA наблюдается при рН 7.0. Интересно, что сравнение амилолитической активности фракций IgG и IgM крови больных, страдающих АИЗ (рассеянный склероз, системная красная волчанка), и препаратов slgA и IgG молока здоровых рожениц показало, что последние обладают более высоким уровнем амилолитической активности [126]. Эти данные свидетельствует в пользу того, что абзимы с амилолитической активностью предпочтительно генерируются или накапливаются в молоке здоровых рожениц.
В 2004 г. были впервые обнаружены AT с нуклеотидфосфатазной активностью [111]. Показано, что в формировании активного нуклеотидфосфатазного центра абзимов участвуют как легкая, так и тяжелая цепи AT. В отличие от известных АТРаз, препараты IgG катализировали гидролиз не только АТР, но и других нуклеозидтри-и дезоксинуклеозидтрифосфатов с сопоставимой эффективностью. Субстратами данных абзимов также являлись аденозиндифосфат и нуклеозидмонофосфат. IgG активировались в присутствии ионов Mg2+ и намного быстрее гидролизовали нуклеозидтрифосфаты, чем нуклеозидмонофосфаты, что также отличало их от других фосфатаз. В то же время, сродство IgG к АТР было на 1 - 2 порядка выше, чем сродство к АТР канонических АТРаз и фосфатаз. Более того, IgG не гидролизовали типичные субстраты фосфатаз, например, ш/ю-нитрофенилфосфат [110]. Приведенные данные свидетельствуют в пользу того, что нуклеотидфосфатазная является собственным свойством IgG молока человека.
Исследование антител с липидкиназной активностью
Как указано выше, небольшие субфракции slgA молока прочно связаны с эндогенными липидами, которые фосфорилируются под действием данных AT в присутствии АТР [118, 119]. На прочность комплекса AT с липидами указывало наличие липидкиназной активности в препаратах slgA после диализа, осаждения 10%-ной ТХУ или сульфатом аммония, гель-фильтрации антител в солевых растворах, а также промывки колонок с протеин А-сефарозой, содержащих адсорбированные AT, буфером, содержащим 1% Тритона Х-100.
Согласно данным SDS-электрофореза в ПААГ препаратов IgG, инкубированных с [у- Р]АТР, гель имеет мощный радиоактивный фон, обусловленный распределением Р-меченных липидов, фосфорилируемых антителами. При анализе препаратов AT после различных этапов очистки абзимов, наблюдалось постепенное уменьшение радиоактивного фона, но небольшая фракция 32Р-меченньгх липидов остается связанной с IgG даже после электрофореза (рис. 11 а, дорожка 1). Полученные результаты свидетельствует о высоком сродстве IgG к эндогенным липидам.
Гель-фильтрация очищенных препаратов slgA в буфере, содержащем 15%-ный диоксан, является самым эффективным способом удаления эндогенных липидов. Диоксан является органическим растворителем, который обеспечивает диссоциацию липидов, имеющих гидрофобную природу, из препаратов AT. При этом наблюдается полное исчезновение липидкиназной активности в препаратах slgA, но в то же время они не утрачивают способность фосфорилировать казеин (рис. 14, а). Подобная картина была получена и в отношении IgG-абзимов. Это свидетельствует о том, что при такой обработке AT не происходит их существенной денатурации.
Гель-фильтрация комплекса IgG с 32Р-меченными эндогенными липидами в буфере, содержащем 15% диоксана, также приводила к диссоциации липидов от AT (рис. 14, б). Другим способом удаления эндогенных липидов из препаратов AT является экстракция смесью хлороформ-метанол (2 : 1, по объему). Однако это очень жесткие условия, ведущие к полной потере способности абзимов связывать эти лиганды и катализировать их фосфорилирование.
Таким образом, подобно sIgA-абзимам молока человека, IgG-абзимы также образуют высокостабильные комплексы с липидами. Так, липидкиназная активность очищенных препаратов IgG полностью не исчезала после диализа, осаждения AT с помощью 10%-ной ТХУ, а также промывки протеин G-сефарозы с адсорбированными AT буфером, содержащим 1%-ный Тритон Х-100. Более того, показано, что липиды остаются связанными с IgG и slgA даже после процедуры "кислого шока", когда обычно происходит практически полная диссоциация очень прочных нековалентных иммунных комплексов.
Исследования показали, что эндогенные липиды, образующие высоко устойчивые комплексы как с slgA [118, 119], так и с IgG, представляют собой исключительно минорную фракцию липидов молока человека. Поэтому их изучение невозможно с помощью классических методов, используемых для анализа структуры липидов (масс-спектроскопия, элементный анализ, метод ЯМР и т.д.) [173 - 176]. В связи с этим, исследование структуры [ 2Р]липидов, фосфорилируемых slgA молока, ранее было проведено с помощью методов их химической и ферментативной деградации [118, 119].
Для ферментативного анализа эндогенных липидов, прочно связанных с slgA, был использован фермент нейраминидаза. Известно, что нейраминидаза из V. cholerae отщепляет нейраминовую кислоту, присоединенную к остатку гексозы, гексозамина или другой нейраминовой кислоты. Тип гликозидной связи не имеет значения, но в любом случае, фермент отщепляет только терминальную нейраминовую кислоту [172]. Обработка липидов Л1 и Л2 нейраминидазой приводила к потере их хроматографической подвижности. Поэтому авторы работы [118, 119] предположили, что фосфатная группа находится на остатке нейраминовой кислоты. В молоке человека обнаружено только три сиалосодержащих липида - ганглиозиды GM1, GM3 и GD3 [142, 143], сиаловые кислоты которых являются терминальными и отщепляются нейраминидазой [171]. В то же время результаты щелочного метанолиза и периодатного окисления не позволяют отнести исследуемые липиды Л1 и Л2 ни к одному из этих ганглиозидов. Так, результаты частичного щелочного метанолиза липида Л1 показали, что он содержит не менее пяти остатков жирных кислот, а Л2 - не менее четырех. Тогда как максимальное число щелочелабильных связей равно 1 у ганглиозидов GM1 и GM3, и 2 для GD3. Кроме того, у исходных липидов в ходе периодатного окисления не было обнаружено а-гликольных группировок. В то же время ганглиозиды молока GM1, GM3 и GD3 окисляются периодатом. Интересно, что липиды Л1 и Л2 после процедуры метанолиза также окисляются периодатом. По-видимому, эти данные можно объяснить тем, что расщепление сложноэфирных связей у таких липидов ведет к образованию вицинальных диольных групп, которые и окисляются в ходе обработки периодатом. Подобные результаты были получены и в отношении липидов Л1 и Л2, фосфорилируемых IgG.
В данной работе показано, что slgA и IgG из молока одного донора фосфорилируют одинаковые по хроматографической подвижности липиды (рис. 12, а). Спектры липидов, фосфорилированных препаратами slgA и IgG, вьщеленных из молока разных доноров могут отличаться (например, рис. 12, в). В то же время, во всех случаях, в спектре Р-меченных липидов обнаруживаются липиды Ш и Л2 как мажорные продукты фосфорилирования (рис. 12, в).
Как указано выше, только AT катализируют фосфорилирование белков, липидов и полисахаридов в присутствии [ Р]о/?/пофосфата в качестве субстрата. При этом фосфорилирование липидов, связанных с AT, путем добавления [32Р]ортофосфата непосредственно в молоко приводит к образованию тех же продуктов, что и при добавлении [32Р]ортофосфата к очищенным препаратам slgA и IgG. Таким образом, липиды, связанные с slgA и IgG, в основном идентичны. Особенностью данных липидов является их необычное поведение при одно- и двумерной ТСХ в различных стандартных системах, используемых для анализа липидов и глицерофосфолипидов. Так, два минорных липида Л1 и Л2 в системе хлороформ : метанол : вода (14 :6:1, по объему) обладают весьма высокими одинаковыми значениями коэффициента R/равными 0.62 и 0.5 для IgG и slgA, что сопоставимо с ганглиозидами (R/ = 0.4 и 0.6) [171]. Таким образом, по-видимому, данные липиды Л1 и Л2 можно отнести к ганглиозидам. Не исключено, что они могут иметь структуру, сходную с недавно описанными GXl t ганглиозидами молока человека, которые к настоящему времени полностью не изучены [175,176].
Каталитическая активность Fab-фрагментов иммуноглобулинов
Одной из важных задач при изучении абзимов является выявление локализации их активных центров, что позволяет оценить вклад легких и тяжелых цепей AT в связывание субстрата и катализ реакции. Как показано ранее [1-5], организация активных центров абзимов может зависеть от природы субстрата, типа ферментативной реакции, катализируемой AT, характера аутоиммунных процессов, протекающих в организме больного. Следует отметить, что решение такой задачи усложняется гетерогенностью поликлональных абзимов, а также наличием в суммарном пуле Ig каталитически неактивных AT, которые связывают субстрат, но не проявляют ферментативной активности. В настоящее время не разработано эффективных методов разделения "обычных" некаталитических AT и абзимов.
Молекула IgG состоит из трех функциональных доменов, два из которых отвечают за связывание антигена (Fab-фрагменты), а третий выполняет эффекторные функции, связанные с активацией комплемента и сорбцией на поверхности клеток (Fc-фрагмент). Fab-фрагменты молекулы IgG состоит их легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, которые содержат антиген-связывающие вариабельные домены. Выделение Fab-фрагментов было проведено с помощью мягкого протеолитического расщепления Ig цистеиновой протеиназой - папаином, специфически гидролизущей S-S связи между Сні- и Снг-доменами. Далее продукты реакции разделяли с помощью ряда последовательных хроматографии: аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе (для отделения папаина и Fab-фрагментов от непрореагировавших IgG и Fc-фрагментов AT) и гель-фильтрации (для разделения Fab-фрагментов и папаина). Гомогенность полученного препарата Fab-фрагментов была подтверждена электрофоретическим анализом в системе Лэммли, аналогично работе [166]. Полученные электрофоретически гомогенные препараты Fab-фрагментов IgG обладали липид- и олигосахаридкиназной активностью, но были менее активными по сравнению с интактными молекулами Ig (рис. 30).
Особенности строения slgA обуславливают невозможность использования папаинового гидролиза антител данного класса для получения Fab-фрагментов как целевых мажорных продуктов протеолитического расщепления. По-видимому, это обусловлено несколькими причинами. Прежде всего, наличием дополнительной субъединицы - секреторного компонента, что придает slgA повышенную устойчивость к действию протеолитических ферментов. Помимо этого, секреторный компонент стерически затрудняет действие протеаз в районе "талии" мономерных субъединиц IgA. Особенности строения этого района молекулы антитела приводят к тому, что данная область не является основным сайтом протеолитического расщепления IgA с помощью папаина и/или пепсина. В настоящее время в литературе описаны подходы к получению Fab-фрагментов slgA с помощью IgA-специфических протеаз [182, 183], однако, следует заметить, что такие данные крайне немногочисленны. Более того, нет однозначных данных о специфичности разных типов IgA-протеаз по отношению к различным изотипам IgA. Одним из наиболее распространенных и доступных ферментов этого типа является IgA-протеаза из Neisseria gonorrhoeae. Известно, что ее действие на IgAl (в том числе и slgAl) приводит к образованию Fab-фрагментов иммуноглобулинов [183], однако данные о возможности получения Fab-фрагментов IgA2 с помощью этого фермента противоречивы. Использование IgA-специфичной протеазы для протеолиза slgA (по крайней мере фракции, обладающей сродством к протеин А-сефарозе) в сочетании с очисткой продуктов реакции протеолиза с помощью хроматографии на протеин А-сефарозе (выделение Fab-фрагментов и интактных slgA) и последующим гель-фильтрационным разделением slgA (380 кДа) и Fab-фрагментов (около 50 кДа) приводит к получению гомогенных, согласно данным гель-фильтрации и электрофореза, каталитически активных Fab-фрагментов AT, по аналогии с работой [166]. Как видно из данных рис. 31, Fab-фрагменты slgA обладали каталитической активностью, но, по-сравнению с интактными молекулами sIgA-абзимов, их активность была достаточно низкой. Другие продукты протеолитического расщепления slgA, как отмечалось выше, не обладали активностью в реакциях фосфорилирования липидов и олигосахаридов.
Сравнительно низкая активность Fab-фрагментов IgG и slgA по-сравнению с интактными молекулами этих AT не коррелирует с данными, полученными при изучении каталитической активности Fab-фрагментов IgG молока человека, катализирующих реакции гидролиза ДНК и РНК, где активность Fab-фрагментов была значительно выше, чем исходных препаратов AT [102]. Подобные результаты были получены и при исследовании каталитической активности Fab-фрагментов IgG, выделенных из крови больных рассеянным склерозом и обладающих ДНК-гидролизующей активностью [169].
При анализе возможных причин понижения относительной активности Fab-фрагментов IgG и slgA с фосфорилирующей активностью следует принять во внимание следующие данные. Во-первых, абзимы с фосфорилирующими активностями являются уникальными, так как они катализируют не реакцию деградации, как в случае абзимов с ДНК-гидролизующей активностью, а реакцию синтеза. Во-вторых, эти абзимы с синтетическими функциями катализируют не одно, а двухсубстратную реакцию, в которой одним из субстратов являются прочно связанные с AT липиды, олиго- и полисахариды. В случае двухсубстратных реакций, катализируемых каноническими ферментами, зачастую наблюдается синергизм в связывании и превращении субстратов. Эффективность этих превращений может зависеть от структуры белков и уменьшаться при нарушении их полной структуры в результате отщепления каких-либо полипептидных фрагментов. Не исключено, что структура эндогенных липидов, олиго- и полисахаридов может меняться в ходе выделения и очистки препаратов AT, что также приводит к потере высокого сродства данных лигандов к молекуле иммуноглобулинов. В результате может наблюдаться падение удельной активности Fab-фрагментов по сравнению с исходными препаратами AT.
Наличие каталитической активности Fab-фрагментов иммуноглобулинов одновременно является весомым доказательством собственной фосфорилирующей функции Ig, поскольку свидетельствует о сохранении функциональной активности каталитических центров AT в процессе их выделения и очистки.
Как было показано ранее, поликлональные препараты IgG и slgA с протеинкиназной активностью могут содержать различное количество моноклональных AT, сильно отличающихся по сродству к АТР. Так, поликлональные AT при хроматографии на АТР-сефарозе разделяются на несколько фракций и демонстрируют
Подобно абзимам с протеинкиназной активностью, поликлональные IgG и slgA, фосфорилирующие эндогенные липиды, также демонстрируют существенные различия в сродстве к АТР и о/жофосфату и обладают каталитической гетерогенностью. Как видно из данных рис. 32, хроматография препаратов IgG и slgA на АТР-сефарозе приводит к разделению поликлональных AT на несколько субфракций, отличающихся по сродству к АТР. При этом все фракции активны в реакции фосфорилирования прочно связанных липидов, что свидетельствут о каталитической гетерогенности этих абзимов. Показано, что все три исследованных препараты IgG содержат AT, обладающие меньшим сродством к данному сорбенту, по сравнению с тремя препаратами slgA, которые более эффективно взаимодействуют с АТР-сефарозой.
