Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ИЗУЧАЕМЫХ ПЕПТИДАХ... . 12
1.1.1. АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН И ЕГО ПЕПТИД
АФПм-зо-ин 13
-
ИНСУЛИН И ЕГО ПЕПТИД ИНСі7-2і-ин 21
-
ПЛАЦЕНТАРНЫЙ АЛЬФАМИКРОГЛОБУЛИН И ЕГО ПЕПТИДЫ ПАМГ^б-цин, ПАМГП5-ш-тин 24
-
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСПОРТЕРЫ
ГЛЮКОЗЫ 28
1.1.5. НАРУШЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА ПРИ
САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 33
САХАРНЫЙ ДИАБЕТ И ЕГО ДИАГНОСТИКА
КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ САХАРНОГО ДИАБЕТА ПО ПЕРОРАЛЪНОЙ ПРОБЕ НА ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ГЛЮКОЗЕ
1.2. ОЦЕНКА ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
НА ОСНОВЕ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ... 43
1.2.1. ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВ, ПЕПТИДОВ НА
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
СПЕРМАТОЗОИДОВ 47
II. - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. ОБОРУДОВАНИЕ 50
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
ЭРИТРОЦИТАМИ 51
2.2.1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ
ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ 54
2.2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ
НА СПЕРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ 56
2.2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА И ПОДВИЖНОСТИ
СПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭЯКУЛЯТЕ 57
2.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
СПЕРМАТОЗОИДОВ 59
2.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ
ФРУКТОЗЫ В ЭЯКУЛЯТЕ 59
2.2.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ
ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ В ЭЯКУЛЯТЕ. : 60
Ш. - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
3.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА
ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ... . 62
3.1.1. ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА НА ПОГЛОЩЕНИЕ
ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ 62
3.1.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ИНСИН А НА ПОГЛОЩЕНИЕ
ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ 65
3.1.3. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМПімгі-тин НА
ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ . ... 67 3.1.4. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГ5^6-Цин НА
ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ 69
3.1.5. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФПі4.2о-ин НА
ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ 71
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА
ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ 73
3.2.1. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ АФПМjo-ин НА
ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ 74
3.2.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГпэ-ш-тинНА
ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ. .' 75
3.2.3. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГ59-бб-Цин
НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ 77
3.2.4. ВЛИЯНИЕ FPP И ОУАБАИНА НА
ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ. .; 19
3.2.5. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФП14.20-ин
НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ НА ФОНЕ
ДЕЙСТВИЯ FPP И ОУАБАИНА 81
-
ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФПі4-2о-ин И FPP НА ПОДВИЖНОСТЬ . СПЕРМАТОЗОИДОВ 83
-
ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФПМ-20-ин И ОУАБАИНА НА
ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ. 84
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПОГЛОЩЕНИЕ
ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ 86
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ И ИНГИБИТОРОВ НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ
ЧЕЛОВЕКА 91
ВЫВОДЫ 96
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФП - альфа-фетопротеин
АФГТ-ин - синтетическая последовательность альфа-фетопротеина
(14-20) - пептид LDSYQC(acm)T, он же АФПи.2о АКТГ - адренокортикотропный гормон 4-ААП - 4-аминоантипирин НАГ - бета-2-амниотический глобулин ИНЗСД - инсулиннезависимый сахарный диабет . ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет ИНС-ин - синтетическая последовательность а-цепи инсулина (17-21)
- пептид ENYC(acm)N, он же сс-ИНСп-2гИН ИФР - инсулиноподобный фактор роста ПАМГ - плацентарный альфаг-микроглобулин, он же - П АМГ-2,
АМГФ, гликоделин, САМГ-гликоделин, РР-14 ПАМГ-тин -^ синтетическая последовательность гликоделина
(1J 5-121) - пептид QSMMC(acm)QY, он же
ПАМГп5-121-ТИН
ПАМГ-цин - синтетическая последовательность гликоделина (59-66) -
пептид HRTENNSC(acm), он же ПАМГ59.66-ЦИН ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты ПОЛ - перекисное окисление липидов ПОД - пероксидаза
ПСАГ - плацентарно-спермальный альфа-глобулин
СБГ - секреторный бета-1-глобулин
СД - сахарный диабет
РАЛ-2 - растворимый антиген лейкоцитов-2
FPP - fertilization promote peptide
Г-6-ф - птюкозо-6-фосфат
Введение к работе
Актуальность проблемы. Первые сведения о находках гомологичных .и гетерогенных антигенов в опухолевой ткани человека появились еще в тридцатых годах прошлого столетия. После этого потребовалось около 30 лет, чтобы идентифицировать первый эмбриоспецифический антиген альфа-фетопротеин (АФП) в химически индуцированной гегатоме у мышей [Абелев Г.И.,1962] и в сыворотке крови при гепатоцеллюлярном раке у человека [Татаринов Ю.С.J963]. Дальнейшее изучение этого белка продемонстрировало его иммуномодулирующие свойства и потенциально высокую терапевтическую значимость. Однако создание лекарственных средств на основе очищенного АФП натолкнулось на ряд трудностей, из которых на первом месте стоят инфекционная безопасность сырья и стандартизация как методов выделения АФП, так и самого полученного препарата по его чистоте и биологической активности.
Изучение первичной структуры АФП позволило выявить в нем возможную сигнальную последовательность LDSYQCT (АФП^о), отсутствующую в альбумине, в белковое семейство которого входит АФП (Терентьев А.А., 1997; Терентьев А. А., Татаринов Ю.С., 1997). Эта последовательность оказалась гомологичной подобным участкам в первичных структурах некоторых факторов роста и инсулина - белков, индуцирующих внутриклеточную тирозинкиназную активность путём действия на специфические цитоплазматические мембраны и поверхностные мембранные рецепторы соответствующих клеток-мишеней.
Определенную гомологию и сходные мотивы последовательности АФП 14-20 удалось выявить в ряде онкофетальных и плацентарных белков, в частности в гликоделине (Терентьев А.А., Татаринов Ю.С., 1999) - белке, известном также под названием плацентарный альфа-микроглобулин (ПАМГ) и играющем важную роль в процессах репродукции (Петрунин Д.Д., Татаринов Ю.С. 1976)..
Нами были учтены достижения в изучении регуляторных пептидов, в ходе которого выяснилось, что во многих случаях воздействие на физиологические процессы оказывают не целые макромолекулы, а их небольшие фрагменты олигопептиды. Это обстоятельство позволило сделать заключение о том, что регуляция и координация , функций организма могут осуществляться за счет ключевых фрагментов полипептидов, отщепляющихся от достаточно длинных молекул в соответствии с потребностями организма, а также самими этими фрагментами, презентированньши на поверхности белковых молекул при белок-рецепторных взаимодействиях. Эти фрагменты обладают определенной направленностью действия, специфичностью и адекватной активностью [Гомазков О. А., 1991]. Синтетические фрагменты биологически активных белков и полипептидов могли бы, по нашему мнению, адекватно моделировать активность самих макромолекул и воспроизводить биологические и терапевтические эффекты этих макромолекул.
Представляло интерес исследовать в клеточных системах биологическую активность аналогов небольших аминокислотных последовательностей белков - синтетических пептидов: LDSYQC(acm)T - аналог последовательности АФП^о, ENYC(acm)N - гомологичной ей последовательности (17-21) а-цепи инсулина - (а-ИНСп-гі-ин), RRTENNSC(acra) и QSMMC(acm)QY, имеющих с ней сходные по аминокислотному составу мотивы участков (59-66) и (115-121) последовательности гликоделина - плацентарного альфа2-микроглобулина (ПАМГ59-бб-Цин, ПАМГш-ш-тин).
Проверку биологической активности таких синтетических пептидов на .первом этапе целесообразно проводить на наиболее доступных клеточных системах: лимфоцитах, эритроцитах и спермальных клетках. Частично иммунобиологические свойства пептида LDSYQC(acm)T были исследованы (Терентьев А. А., Казимирский А.Н. и др., 1999,2000, 2001, 2002, 2003 гг.) в различных модельных системах на лимфоцитах человека и были выявлены иммуномодуляторные эффекты синтетической последовательности АФП^-го- В данном исследовании в качестве модельных клеточных систем использовались эритроциты и спермальные клетки человека.
Цель исследования. В связи с вышеизложенным, целью исследования нашей работы явилось изучение в наиболее доступных клеточных системах (изолированных и отмытых эритроцитах и спермальных клетках) биологической активности синтетических пептидов: LDSYQC(acm)Tt ENYC(acm)N, HRTENNSC(acm) и QSMMC(acm)QY.
Задачи исследования. Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи: . 1 -ИЗУЧИТЬ ВЛИЯНИе СИНтеТИЧеСКИХ ПОСЛеДОватеЛЬНОСТеЙ АФП14-20,
ПАМГ59-66-ИИН, ПАМГц5-і2гтин и а-ИНСі7-2і-ин на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом;
2 - сравнить влияние синтетических пептидов и инсулина на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и II типа;
3 - сравнить интенсивность поглощения глюкозы эритроцитами больных различными типами сахарного диабета под влиянием синтетических пептидов и инсулина;
4 - ИЗУЧИТЬ ВЛИЯНИе СИНтеТИЧеСКИХ ПеПТИДОВ АФП14.20, ПАМГ59-66- цин, ПАМГп5-і2і-тин на подвижность спермальных клеток репродуктивной системы у человека;
5 - сравнить влияние синтетических пептидов: АФП14-20 и ингибиторов "Fertilization promote protein" (FPP), а также Ouabain (Оуабаин) на подвижность спермальных клеток.
Научная новизна работы. В данной работе впервые проведен анализ биологической активности синтетических пептидов — аналогов
ГОМОЛОГИЧНЫХ ПеПТИДНЫХ ПОСЛеДОВатеЛЬНОСТеЙ АФП14-20. ПАМГ^-бб*
ПАМГц 5-121 и а-цепи инсулина 17.21 в клеточных моделях in vitro. Проведено сравнение влияния синтетических пептидов на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и II типов. Выявлены возможности распознавания биологической активности
ОЛИГОПеПТИДНЫХ ПОСЛеДОВатеЛЬНОСТеЙ В Структуре АФПі4-20, ПАМГ59-66,
ПАМГц5.і2і и а-цепи инсулина|7-2і в простых клеточных моделях на отмытых эритроцитах человека.
Выявленные эффекты действия изученных синтетических пептидов позволяют предположить вовлечение их в регуляторные механизмы клеточного метаболизма на уровне цитоплазматических рецепторов. Впервые продемонстрировано различие во влиянии инсулина и изученных пептидных инсулиномиметиков на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом, сочетанным с хроническим панкреатитом, при сравнении с эритроцитами от больных сахарным диабетом 1 и II типов. Эти данные дают дополнительное экспериментальное обоснование этиологической классификации нарушений гликемии (ВОЗ, 1999), согласно которой сахарный диабет, связанный с болезнями экзокринной части поджелудочной железы, относится к. другим специфическим формам диабета, отличным от диабета 1 и II типов.
Показано протективное действие последовательности АФП14-20 на сохранение жизнеспособности и поддержание подвижности активной фракции сперматозоидов.
Практическая значимость. Практическим выходом проведенных экспериментов могут служить рекомендации по применению теста поглощения глюкозы эритроцитами in vitro с использованием инсулина и изученных'пептидов с целью выявления истинной резистентности к инсулину при сахарном диабете. Пептидный фрагмент АФПн-20 может быть применен для сохранения подвижности и жизнеспособности сперматозоидов в андрологии при искусственном оплодотворении и создании банков спермы.
Внедрение результатов. Результаты исследования могут быть внедрены в. практическую работу Центрального научного исследовательского института гастроэнтерологии и Института урологии (больница №47), Москва, Россия, и в программу учебных и элективных курсов кафедры биохимии Российского Государственного Медицинского Университета (РГМУ).
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных съездах ISOBM (International Society Oncodevelopmental Biology and Medicine) в 2001 и 2003 гг., на конференции «БЕЛКИ -МАРКЕРЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ», Астрахань, 2003 г., на заседаниях кафедры биохимии Российского государственного медицинского университета (РГМУ).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы и 2 находятся в печати.
Структура и объём работ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, изложения собственных результатов, обсуждения результатов, приложения и литературы.
Работа изложена на 114 страницах компьютерной верстки, содержит 18 таблиц, 5 рисунков, 9 гистограмм. Список использованной литературы включает 140 наименований, из них 67 отечественных.
