Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Изучение молекулярных нарушений в тканях предстательной железы человека при опухолевой трансформации 10
1.1 Общие характеристики злокачественных опухолей предстательной железы и основные тенденции в их биохимических исследованиях 10
1.2. Протеомные исследования тканей и клеток предстательной железы человека в норме и при опухолевой трансформации 14
1.2.1. Возникновение системного анализа белков как продуктов генной экпрессии. Исследования белков предстательной железы человека в догеномныи период (до 1989 г.) 14
1.2.2. Исследования белков предстательной железы человека в геномный период (1989 - 2001 гг.) 18
1.2.3. Исследования белков предстательной железы человека в постгеномную эру (с 2001 г.) 22
1.3. Молекулярно-генетические исследования предстательной железы человека при опухолевой трансформации 33
1.4. Поиски молекулярных маркеров рака предстательной железы с использованием постгеномных технологий 37
1.5. Исследования полиморфизма некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы человека 44
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Реактивы и биологические материалы 52
2.1.1. Реактивы 52
2.1.2. Биологические материалы 52
2.2. Подготовка образцов для проведения электрофоретических исследований . 53
2.3. Фракционирование белков одномерным электрофорезом по Лэммли 54
2.4. Фракционирование белков двумерным электрофорезом 54
2.4.1. Изоэлектрофокусирование и неравновесное фокусирование в полиакри-ламидном геле в градиенте рН, сформированном амфолинами 54
2.4.2. Изоэлектрофокусирование в иммобилиновом градиенте рН 56
2.4.3. SDS-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля 56
2.5. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия одномерных и двумерных электрофореграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин 57
2.6. Иммуноблоттинг 58
2.7. Масс-спектрометрическая идентификация белков 59
2.8. Определение концентрации белков 60
2.9. Методы получения препаратов ДНК и формирования ДНК-коллекций 60
2.10. Метод дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для исследования однонуклеотидных полиморфизмов ДНК 61
2.11. Статистическая обработка результатов 63
Глава 3. Полученные результаты и их обсуждение 64
3.1. Исследование белкового состава тканей предстательной железы человека с помощью протеомных технологий 64
3.1.1. Формирование обобщенной двумерной карты белков простаты 64
3.1.2. Масс-спектрометрическая идентификация белков предстательной железы на двумерной карте. Различия белковых паттернов образцов с раком и доброкачественной гиперплазией 70
3.2. Изучение изменчивости белков в тканях предстательной железы человека 82
3.2.1. Изоформы актин-связывающих белков в тканях предстательной железы . 82
3.2.2. Полиморфизм ПСА в тканях предстательной железы 85
3.2.3. Полиморфизм енолазы 1 в тканях предстательной железы 87
3.2.4. Уточнение «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей идентифицированных белков предстательной железы 89
3.2.5. Пилотное исследование однонуклеотидных полиморфизмов в некоторых генах, экспрессирующихся в тканях предстательной железы 93
3.3. Изучение специфичности и возможностей клинического использования потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы человека 95
3.4. Формирование макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы человека 99
Заключение 105
Выводы 107
Список литературы 108
Приложение благодарности
- Общие характеристики злокачественных опухолей предстательной железы и основные тенденции в их биохимических исследованиях
- Возникновение системного анализа белков как продуктов генной экпрессии. Исследования белков предстательной железы человека в догеномныи период (до 1989 г.)
- Формирование обобщенной двумерной карты белков простаты
- Масс-спектрометрическая идентификация белков предстательной железы на двумерной карте. Различия белковых паттернов образцов с раком и доброкачественной гиперплазией
Введение к работе
Актуальность темы
Успешная реализация международного проекта "Геном человека" [International Human Genome Sequencing Consortium 2001; Venter C.J. et al. 2001] привела к формированию в начале XXI века нескольких новых научных дисциплин (геномики, протео-мики, транскриптомики, биоинформатики и др.), а также к внедрению в различные молекулярные исследования новых высокоэффективных технологий, предназначенных для изучения генов человека и кодируемых ими белковых продуктов [Baxevanis А., Oueliette B.F.F. 1998; Jungblut P.R. et al. 1999; Арчаков А.И. 2000; Шишкин С.С. 2002; Примроуз С, Тваймен Р. 2008 и др.]- Все это позволяет говорить о переходе биохимии и генетики человека в постгеномную эру развития. К постгеномным технологиям относят многочисленные методы, применяемые в геномике, протеомике, транскриптомике и других новых дисциплинах, несмотря на то, что некоторые из этих методов первоначально были предложены еще в догеномный период развития [Арчаков А.И. 2000; Шишкин С.С. 2002; Serruto D., Rappuoli R. 2006; Hughes С. et a!. 2006; Примроуз С, Тваймен P. 2008 и др.]. Вполне естественно, что новые исследовательские возможности постгеномных технологий в значительной степени ориентированы на решение актуальных биомедицинских проблем [Anderson N.G., Anderson N.L. 1996; Celis J. et al. 1996; Арчаков А.И. 2000; Шишкин С.С. 2002; Jiang Z. et al. 2005; Zhang J.S. et al. 2005; Kris-tiansen G. et al. 2005; Devaney J.M. et al. 2007 и др.].
Одной из важнейших проблем современной медицины является широкая распространенность онкологических заболеваний, среди которых особое место принадлежит раку предстательной железы (РПЖ). За период 1994-2004 гг. в России при незначительном общем снижении заболеваемости злокачественными новообразованиями (на 4,3%) заболеваемость РПЖ увеличилась более чем на 70% со средним годовым ростом на 6,1% [Чиссов В.И. и др. 2004]. В последние годы в России РПЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2006]. В странах с более эффективной системой выявления РПЖ показатель заболеваемости этой формой рака еще выше. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран Запада РПЖ находится на 2-3 месте после рака легких и желудка, а в США в 2007 г. РПЖ вышел на 1-е место [Jemal A. et а!. 2007].
Высокие темпы роста РПЖ (первое место среди других онкологических заболеваний) и обширный контингент в группе риска (фактически, все мужчины старше 50 лет) делают проблемы РПЖ не только медицинскими, но в значительной степени и медико-социальными. Это определяет высокую актуальность исследований, направленных на изучение молекулярных основ патогенеза РПЖ и использование новых данных о молекулярных нарушениях при этой патологии для создания эффективных методов ее диагностики и лечения.
До недавнего времени считалось, что проблему точной диагностики РПЖ решает анализ уровня так называемого простат-специфического антигена (ПСА), однако существуют убедительные данные о недостаточной диагностической значимости этого маркера [Stamey Т.А. et al. 2004; Parekh DJ. et al. 2007; Thompson I.M., Ankerst D.P. 2007]. Показано, что около 40% пациентов с нормальным уровнем ПСА имеют клинически выраженный РПЖ [Lange Р.Н. et al. 1989; Hudson М.А. et al. 1989; Charrier J.P. et al. 2001], тогда как у 65% лиц с повышенным уровнем ПСА (выше 4,0 нг/мл) оказываются иные заболевания простаты, в частности, доброкачественные гиперплазии [Charrier J.P. et al. 2001; Catalona W.J. et al. 1998]. Как следствие, в США и других западных странах более 10 лет ведутся поиски новых, более эффективных маркеров РПЖ [Hudson М.А. et al. 1989; Catalona W.J. et al. 1993; Catalona W.J. et al. 1998; Charrier J.P. et al. 2001; Jiang Z. et al. 2004; Hutchinson LM. et al. 2005b]. Одно из центральных мест в этих поисках занимают работы, проводимые с помощью различных постгеномных и, в частности, протеомных технологий [Jiang Z. et al. 2004; Jiang Z. et al. 2005; Zhang J.S. et al. 2005; Hutchinson LM. et al. 2005a; Kristiansen G. et al. 2005].
Активное использование постгеномных технологий для поисков белков-потенци-альных маркеров уже привело к выявлению нескольких сотен потенциальных маркеров РПЖ. Диагностическая значимость этих белков продолжает интенсивно изучаться [Zhang J.S. et al. 2005; Kristiansen G. et al. 2005; Liu D. et al. 2005; Hutchinson LM. et al. 2005b]. Некоторые из вновь обнаруженных белковых маркеров начали применяться в иммуногистологической диагностике РПЖ при анализе биоптатов. Тем не менее, удовлетворительной замены тестам на содержание ПСА в сыворотке крови пока не найдено.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной диссертационной работы стало системное изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий.
В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи: изучить комплекс белковых продуктов генной экспрессии в тканях предстательной железы человека с помощью двумерного электрофореза. По результатам фракционирования суммарных экстрактов белков построить синтетическую двумерную карту белков предстательной железы; провести сравнительный анализ белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии для обнаружения потенциальных белковых маркеров РПЖ; провести масс-спектрометрическую идентификацию предполагаемых белковых маркеров РПЖ и наиболее представленных белков на двумерных картах анализируемых тканей; провести предварительную проверку диагностической значимости выявленных белковых маркеров РПЖ в «двойном слепом исследовании»; изучить полиморфизм ряда белков в тканях предстательной железы человека;
6) полученные данные использовать для создания компьютерной базы данных об идентифицированных белках тканей предстательной железы человека.
Научная новизна работы
Впервые построена обобщенная двумерная карта белков простаты человека, на которой суммированы результаты двумерного электрофоретического анализа образцов тканей простаты с гиперплазией и раком. На карте представлено 558 белков, среди которых идентифицировано 107, включая 3 новых. Выявлено 10 белков, которые можно рассматривать как потенциальные маркеры рака простаты. В тканях предстательной железы впервые обнаружено 12 изоформ трансгелинов, выявлены 2 изоформы простат-специфического антигена и редкий вариант енолазы 1. Проведено уточнение 59 «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей 16 белков предстательной железы. На основе построенной синтетической карты создана макетная версия трехуровневой компьютерной базы данных о «мажорных» белках простаты человека, включающая 64 белковые фракции и пригодная к дальнейшему расширению.
Научно-практическая значимость работы
Получены обобщенные данные о 558 белковых продуктах генной экспрессии, которые представлены в тканях предстательной железы человека в норме и при патологии (ДГПЖ, РПЖ). На этой основе построена двумерная карта белков предстательной железы, которая может рассматриваться как характерный, генетически детерминированный «белковый портрет» исследованных тканей, и макетная версия компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы. Созданная база данных может быть использована для решения широкого круга задач, в число которых входит изучение молекулярных механизмов этиологии и патогенеза заболеваний предстательной железы, поиск новых диагностических маркеров и т.д.
Проведено сравнительное изучение белкового состава предстательной железы при доброкачественной гиперплазии и раке, что позволило выбрать кандидатные белки для разработки специфических тестов на РПЖ. Сформирована панель из десяти потенциальных белков-маркеров РПЖ (прообраз мультипараметрического диагностику-ма), включающая три новых белка. В ходе клинических исследований на ограниченной выборке пациентов с раком и доброкачественной гиперплазией проверена диагностическая значимость выявленных белковых маркеров РПЖ.
Подготовлена заявка на изобретение способа диагностики рака простаты по определению продукта гена PR02675 - алькарцина 1 (альбумин-родственного карциномного протеина) в диагностических биопсиях протеомными технологиями. Предложенный способ диагностики основан на том, что при раковой трансформации в тканях простаты выявляется ранее не использовавшийся маркер рака - белковый продукт гена PR02675.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. По результатам протеомного изучения белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии построена синтетическая двумерная карта белков предстательной железы, включающая 558 белковых фракций с Мм 6,5 - 450 кДа и pi 4,3 - 13,7; идентифицировано 107 из 558 белковых фракций, нанесенных на двумерную карту, и обнаружено три новых белка предстательной железы.
При сравнительном анализе белков предстательной железы при раке и доброкачественной гиперплазии определены и использованы как специальная панель 10 потенциальных белковых маркеров РПЖ, среди которых - AGR2, а также впервые выявленные белок PR02675 и белковые продукты генов gi:6650826 и gi: 16306948.
Впервые выявлена в тканях предстательной железы человека множественность изоформ трансгелинов, обусловленная в основном биохимическим полиморфизмом белковых продуктов гена трансгелина (TACLN1).
Создана макетная версия 3-х уровневой компьютерной базы данных, содержащей обобщенную информацию о 64 «мажорных» белках предстательной железы человека.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях:
III Всероссийская конференция «Мужское здоровье» (Москва, 2006).
I Международная Пироговская студенческая научная конференция (Москва, 2006).
Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006).
Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2007).
5. 22-ой Ежегодный съезд Европейской ассоциации урологов (EUA Congress, Berlin, 2007).
6. IY съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новоси бирск, 2008).
Публикации по материалам работы
По теме диссертации опубликовано 11 работ в отечественной и зарубежной печати, включая 4 статьи в профильных рецензируемых журналах и главу в коллективной монографии.
Общие характеристики злокачественных опухолей предстательной железы и основные тенденции в их биохимических исследованиях
Рак предстательной железы (РПЖ) - это заболевание, которое в настоящее время является большой медицинской и социальной проблемой. Еще к середине 90-х гг. XX столетия в связи с увеличением продолжительности жизни РПЖ во многих странах мира стал одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. По данным American Cancer Society в США с 2007 г. РПЖ занимает 1-е место в структуре онкологической заболеваемости мужчин и 2-е место (после рака легких) в структуре смертности мужчин от онкозаболеваний, а средняя заболеваемость РПЖ в США составляет 50 человек на 100 тысяч населения в год [www.cancer.com]. По данным Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН в России РПЖ занимает 4-е место в структуре онкозаболеваемости мужчин, а показатель заболеваемости РПЖ у нас в стране составляет 20 человек на 100 тысяч населения в год [Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2006]. Более того, ежегодный прирост в заболеваемости РПЖ в РФ по оценкам Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена достигает 6% [Чиссов В.И. и др. 2004]. При этом молекулярные механизмы патогенеза и возможные молекулярные диагностические маркеры РПЖ остаются недостаточно охарактеризованными [Charrier J.P. eta\. 2001; Stamey Т.А. et al. 2004; Parekh D.J. et al. 2007].
Соответственно, в современной биомедицине различные аспекты исследований РПЖ привлекают пристальное внимание не только клиницистов - урологов и онкологов, но также биохимиков, генетиков, молекулярных биологов и представителей других смежных научных дисциплин.
Морфология предстательной железы человека (ПЖЧ) достаточно хорошо изучена. По существующим оценкам, более 50% объема простаты представлено железистым эпителием, около 25% - гладкомышечными и около 25% - соединительнотканными компонентами [Кушлинский Н.Е. и др. 2002]. Соответственно, злокачественные новообразования ПЖЧ подразделяют на эпителиальные и неэпителиальные. В свою очередь, эпителиальные злокачественные опухоли (раки) представлены в основном аденокарциномами, переходно-клеточным раком и плоскоклеточным раком. Морфологически РПЖ в подавляющем большинстве случаев (более 95%) является аденокарциномой. Различают следующие основные типы аденокарцином: мелкоацинарная, крупноаци-нарная, криброзная, папиллярная, солидно-трабекулярная, эндометриоидная, желези-сто-кистозная, слизеобразугощая [Александров В.П., Карелин М.И. 2004].
В ПЖЧ традиционно выделяют, как минимум, три анатомические зоны: центральную, периферическую и переходную (транзиторную). Предполагается, что центральная зона имеет мезодермальное происхождение, а периферическая и переходная - эндо-дермальное [Lexander Н. et al. 2005]. По существующим оценкам, РПЖ в 60-75% случаев развивается в периферической зоне, в 25% случаев - в переходной зоне и лишь в 5-10% случаев - в центральной зоне [Кушлинский Н.Е. и др. 2002].
Первые системы стадирования аденокарциномы простаты появились более 80 лет назад. К настоящему времени известно около 40 вариантов классификационных систем (MacLennan G.T., Resnik МЛ., Bostwick D.G. 2003). Наибольшее распространение получили система TNM (Tumor Nodulus Metastases) [Bostwick D.G. 1997] и система, разработанная в 1966 г. Gleason [Gleason D.F. 1966]. Гистологическая классификация Глисона основана на степени дифференцировки железистых структур опухоли (дифференци-ровка 1-5). Дифференцировка 1 характеризует тип структуры опухоли с наименее агрессивным ростом (высокая степень дифференцировки), а дифференцировка 5 соответствует наиболее агрессивному типу структуры опухоли (низкая степень дифференцировки). За редким исключением злокачественные опухоли ПЖ имеют неоднородный клеточный состав, поэтому для того, чтобы подсчитать показатель Глисона, суммируют две наиболее часто встречающиеся степени дифференцировки. Полученный показатель (от 2 до 10) служит важным критерием для выбора тактики лечения и определения прогноза заболевания.
Морфологическая и клиническая гетерогенность РПЖ создает значительные трудности для изучения общих закономерностей и молекулярных основ патогенеза этого заболевания.
Пионерами в области исследований патогенеза РПЖ были клиницисты и морфологи [Gleason D.F. 1966; Blennerhassett J.В., Vickery A.L. 1966], однако в последние десятилетия надежды на установление причин болезни связывают с исследованиями молекулярных процессов, ведущих к опухолевой трансформации клеток ПЖ, то есть к приобретению ими способностей к инвазивному росту и метастазированию. Результаты биохимических и молекулярно-генетических исследований проблем РПЖ представлены в многочисленных работах, выполнявшихся в догеномный, в геномный и в постгеномные периоды (например, база данных «PubMed» выдает более 20 000 ссылок на запрос по сочетанию «prostate cancer pathogenesis» и более 40 000 ссылок на сочетание «prostate cancer diagnosis»). Из всего этого огромного информационного массива ниже будут рассмотрены лишь те публикации, которые имеют принципиальный характер для проблем РПЖ или непосредственно связаны с темой данной диссертационной работы.
За несколько десятилетий в работах, использовавших традиционный биохимический подход (который предусматривал выделение индивидуальных белков под контролем ферментной активности из клеток ПЖ или различных биологических жидкостей), были охарактеризованы десятки белков-ферментов [Elhilali М.М. et al. 1967; Terao N. 1968; Rozenszajn L et al. 1968; Chernyshov V.P. 1969; Oliver J.A. et al. 1970 и др.]. Пер вым простатическим ферментом, обнаруженным в крови по его ферментативной активности, была простатическая кислая фосфатаза (ПКФ). Еще в 1936 г. Gutman Е.В. et al. определили, что активность кислой фосфатазы повышена в крови пациентов с РПЖ, особенно имеющих метастазы в кости, по сравнению со здоровыми взрослыми. В 70-х годах было установлено, что повышение активности этого фермента в сыворотке крови больных РПЖ сопровождается понижением его активности в тканях ПЖ [Reif А.Е. et al. 1973]. Сывороточная ПКФ широко использовалась как маркер РПЖ до признания ПСА новым стандартом [Griffiths J.C. 1980; Papsidero L.D. et al. 1980; Wang M.C. et al. 1981; Barak M. et al. 1989; Leitenberger A. et al. 1990]. Традиционный биохимический подход, включавший разнообразные энзиматические методы, активно применялся для изучения простатических изоформ целого ряда других ферментов. В частности, предлагалось проводить определение сывороточной активности изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) для дифференциальной диагностики РПЖ и ДГПЖ [Ishibe Т. 1971].
Определенное место в исследованиях белков в 60-70-е гг. занимали химические методы, в частности, различные варианты электрофореза и хроматографии. Чаще они использовались в комбинации с энзиматическими методами, реже - самостоятельно, в качестве основных методов исследования. Так, Fabris P. et al. (1966) провели подробное электрофоретическое исследование гомогенатов нормальных тканей ПЖ и тканей больных аденомой простаты мужчин.
Возникновение системного анализа белков как продуктов генной экпрессии. Исследования белков предстательной железы человека в догеномныи период (до 1989 г.)
Как отмечалось в разделе 1.1, традиционно поиски онкомаркеров при РПЖ проводились в соответствии со стратегией последовательного изучения, предусматривающей выделение индивидуального белка, установление его строения и функциональных свойств. Появление качественно новой стратегии, предусматривающей параллельное изучение сотен и даже тысяч белков, произошло в середине 70-х годов XX века в связи с разработкой метода высокоразрешающего двумерного электрофореза в полиакрила-мидном геле (2DE). На протяжении более 30 лет 2DE остается одной из основных про-теомных технологий [O Farrell Р.Н. 1975; Anderson N.G., Anderson N.L. 1982; Cell s J.E., Bravo R. 1984; Шишкин C.C. 1985; Klose J. 1989; Арчаков А.И. 2000; Шишкин C.C. и др. 2000; Anderson N.G. et al. 2001; Шишкин C.C. 2002; Шишкин C.C. с соавт. 2004 и др.]. Несмотря на то, что описания базовой методики 2DE белков и ее различных модификаций имеются в большом числе обзоров и даже вошли в некоторые учебники биохимии [например, Марри Р. с соавт. 1993; Muller-Esterl W. 2004 и др.], представляется необходимым кратко рассмотреть основные особенности 2DE, поскольку он является методической основой данной диссертационной работы.
В 1975 г. появились сразу три публикации, описывающие высокоразрешающий метод разделения белков на фракции, представляющий собой сочетание особых модификаций изоэлектрофокусирования и SDS-электрофореза [O Farrell Р.Н. 1975; Scheele G.A. 1975; Klose J. 1975]. Однако приоритет в создании метода отдается Патрику О Фа-рреллу, поскольку этот автор дал наиболее подробное описание методики, представил наиболее впечатляющие результаты (более 1000 белковых фракций при анализе белков Е. Coli) и высказал идею о возможности применения 2DE для получения обобщающих характеристик белковых продуктов генной экспрессии.
При 2DE проводится фракционирование белков по двум независимым физико-химическим свойствам: изоэлектрическои точке и молекулярной массе, что позволяет исследовать практически все белки, содержащиеся в изучаемом образце [O Farrell Р.Н. 1975; Anderson N.G., Anderson N.L. 1982; Celis J.E., Bravo R. 1984; Шишкин C.C. 1985]. Схематически основные стадии 2DE показаны на Рис. 1.1.
В качестве материала для двумерного электрофореза чаще всего используют био-псийные и аутопсийные ткани исследуемого органа. Однако большинство биопсийных и аутопсийных образцов представлены различными типами клеток (клетки соединительной ткани, эндотелий сосудов, органоспецифичные клетки, клетки крови и т.д.). Использование гетерогенных материалов снижает воспроизводимость и усложняет интерпретацию результатов. Поэтому иногда в качестве материала для 2DE используют однотипные по тканевой принадлежности и степени дифференцировки клетки культивируемых клеточных линий [Celis J.Е., Bravo R. 1984; Celis J.E. et al. 1991; Celis J.E. et al. 1995].
Перед проведением 2DE белки изучаемого образца обычно солюбилизируют путем гомогенизации образца в растворе, содержащем мочевину в предельно высокой концентрации и детергенты [O Farrell Р.Н. 1975; Anderson N.G., Anderson N.L. 1982; Celis J.E., Bravo R. 1984; Шишкин C.C. 1985]. Далее, как видно из Рис. 1.1, следует первая стадия 2DE, которая представляет собой изоэлектрофокусирование (IEF) белков в тонких колонках полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии мочевины и неионного детергента (обычно нонидет Р 40 или тритон X 100), проводимое в градиенте рН [Svens-son Н. 1962; Остерман Л.О. 1983; Ригетти П. 1986]. Под действием постоянного электрического поля белки движутся в геле до тех пор, пока не достигнут значений рН, совпадающих с их изоэлектрическими точками. В изоэлектрических точках суммарные электрические заряды молекул белков оказываются равными нулю, и белки прекращают движение, фокусируясь в узких зонах - фракциях. Градиент рН в классических модификациях 2DE по О Фарреллу создается амфолитами - смесями большого числа ам-фотерных молекул сравнительно небольшой молекулярной массы (фирменные названия амфолитов - амфолины, фармалиты, сервалиты, биолиты и др.). В ряде модификаций 2DE для IEF применяется иммобилизованный градиент рН (Immobilized рН gradient, IPG), который создается иммобилинами (амфолитами, сшитыми с мономером акрилами-да). По мнению ряда авторов, IPG позволяет улучшить разрешение и стандартизировать результаты разных лабораторий [Gorg A. et al. 1988; Fawcett J.S. et al. 1988 и др.]. Существенной трудностью IEF в классических модификациях 2DE является постепенное разрушение градиента рН в основной области (выше 8,0-9,0). Для качественного разделения белков с pi, большими 8,0, еще в 70-х годах была предложена специальная модификация 2DE анализа, включающая так называемый неравновесный электрофорез в градиенте рН (Nonequilibrium рН gradient gel electrophoresis, NEPHGE) [O Farrell P.H. et al. 1977; Celis J.E., Bravo R. 1984; Lopez M.F. 1999]. На протяжении всего тридцатилетнего периода 2DE исследований эта модификация успешно использовалась многими авторами в разных лабораториях [Celis J.E. et al. 1991; Celis J.E. et al. 1995; Kovalyov LI. et al. 1995; Ковалев Л.И. и др. 2006 и др.].
На второй стадии 2DE колонка ПААГ с белками, разделенными по изоэлектриче-ским точкам (или по зарядам при модификации NEPHGE), используется в качестве стартовой зоны, от которой начинается фракционирование во втором направлении методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) на пластине ПААГ с градиентом концентрации акриламида. При этом виде фракционирования скорости движения белков в электрическом поле обратно пропорциональны их молекулярным массам, что обеспечивает дополнительное разделение белков по второму важнейшему свойству - по величинам Мм.
После фракционирования технология 2DE предусматривает проведение визуализации белковых пятен в гелевых пластинах. Уже в догеномый период исследований было описано четыре основных способа детекции белков: а) окрашивание органическими красителями [Fairbanks G. et al. 1971; Остерман Л.О. 1983]; б) использование солей серебра [Sammons D.W. et al. 1984; Merril С. et al. 1984]; в) применение флюоресцентных красителей [Jakowski G. et al. 1980; Zakharov S. et al. 1998]; г) авторадиография [O Farrell P.H. 1975, 1977; Wallace A. et al. 1994]. Особенно широкое распространение в догеномный период нашел метод окрашивания органическим красителем кумасси ярко-голубым (Coomassi brilliant blue, СВВ). Этот метод обладает высокой чувствительностью и дает линейную зависимость окрашивания от концентрации белка в широком диапазоне [Anderson N.G., Anderson N.L. 1982; Celis J.E., Bravo R. 1984]. Окрашивание азотнокислым серебром в некоторых модификациях на два порядка чувствительнее, чем окрашивание кумасси R-250, но при серебрении бывает трудно оценить истинное количественное соотношение белков в связи с тем, что при проявлении используется фотохимический принцип [Celis J.Е., Bravo R. 1984].
Формирование обобщенной двумерной карты белков простаты
Стабильность белкового состава операционных образцов тканей простаты при ДГПЖ и РПЖ была предварительно исследована методом одномерного электрофореза по Лэммли, который показал соответствие белковых профилей в проанализированных пробах (Рис. 3.1) при отсутствии существенных различий между ДГПЖ и РПЖ, что позволило перейти к их изучению с помощью протеомных технологий.
Стратегия протеомных исследований предусматривает построение синтетической двумерной карты белков изучаемого объекта [Anderson N.G., Anderson N.L. 1982, 1984, 1996; Celis J.E., Bravo R. 1984; Громов П.С, Целис Х.Э. 2000; Шишкин С.С. и др. 2004], которая характеризует особенности генной экспрессии в данном объекте.
Основой для построения синтетической двумерной карты белков простаты стала коллекция двумерных электрофореграмм образцов с ДГПЖ (п = 50) и РПЖ (n = 100), а также образцов нормальной ПЖ (п=3).
Для создания информационной наполняющей двумерной карты возможно использование различных вариантов гелевого 2DE: IEF-PAGE, NEPHGE, IPG-PAGE. В настоящее время в мире наиболее принятым является использование варианта IPG-PAGE на стан-дартизованых заводских стрипах.
Вариант IEF-PAGE был проверен для тканей простаты в разных сочетаниях условий изофокусирования (800 В/ч, 1400 В/ч, 2400 В/ч и 4000 В/ч), и лучший результат дал вариант неравновесного IEF-PAGE (NEPHGE) при диаметре трубок 2,4 мм и длине геля 13 см (при наборе 2400 В/ч), который позволил одномоментно анализировать до 600 белков в диапазоне Мм б - 450 кДа и pi 4,0 - 15,0 (Рис. 3.2 А). Использование IPG стрипов (согласно протоколу фирмы-производителя) в диапазоне рН 3 - 10 при длине 13 см показало ограничение возможности детекции изменений экспрессии белков при pi 5,0 - 9,0 и Мм выше 100 кДа (при равной белковой нагрузке на уровне 500 мкг на трубку/стрип) (Рис. 3.2 Б). Поэтому в дальнейшем, при наборе статистического материала, использовался вариант IEF-PAGE 2400 В/ч [по Kovalyov L.I. et al. 1995]. 6 7 8 9 10 pi
Типичная двумерная электрофореграмма белков ПЖЧ, полученная при выбранном варианте 2DE, включающем фракционирование белков в первом направлении методом IEF-PAGE 2400 В/ч. Окрашивание азотнокислым серебром. 7 8 pi
Считается, что каждый из этих методов детекции имеет свои преимущества. Все эти варианты, по литературным данным, совместимы с дальнейшей идентификацией методами масс-спектрометрии. Из гелей, окрашенных четырьмя способами, по пять пятен с одинаковыми координатами (pi и Мм) были подвергнуты идентификации MALDIOF масс-спектрометрией, по результатам которой была подтверждена их идентичность. Однако два способа окрашивания (с использованием коллоидного кумасси G-250 и люминисцентного красителя Sypro Ruby) показали худшую чувствительность, и в дальнейшей работе гели обычно окрашивали, последовательно используя кумасси голубой R-250 и азотнокислое серебро.
Распределение белковых фракций на каждой из полученных электрофореграмм документировали в виде соответствующего изображения, которое регистрировалось и сохранялось как графический файл в формате .tif как описано в главе 2 (раздел 2.5). Полные изображения двумерных электрофореграмм и (в некоторых случаях) их отдельных участков получали по результатам сканирования и/или по данным цифровой фотографии. Оценка адекватности отобранных для последующего анализа двумерных электрофореграмм проводилась в ходе предварительного сравнения результатов фракционирования белков. Для этой цели использовался метод компьютерного «наложения изображений».
Каждое изображение стандартизировали с помощью программы Melanie по 15 выбранным реперным точкам, соответствовавшим четко идентифицируемым «мажорным» белковым фракциям (см. Рис. 3.4). (В ходе последующей работы все выбранные репер-ные фракции были идентифицированы и внесены в компьютерную базу данных - раздел 3.6).
Двумерная электрофореграмма белков ПЖЧ. Красными пунктирными овалами показаны белковые фракции, выбранные в качестве реперных точек.
Для удобства ориентирования каждое изображение разделяли на условные прямоугольные участки. Разделение изображения электрофореграммы осуществлялось в соответствии с модифицированным методом Камингса [Comings D.E. 1982; Kovalyov L.I. et al. 1995; Шишкин C.C. и соавт. 2004] по одному и тому же принципу - границы участков образовывали стандартным образом проведенные б горизонтальных и б вертикальных линий, а также края самой электрофореграммы.
Точки для проведения горизонтальных линий находили с помощью рекомбинант-ных белков - маркеров молекулярных масс («Fermentas», Литва), которые наносили на каждую гелевую пластину перед проведением фракционирования во втором направле ний (SDS-электрофорез в пластине градиентного ПААГ). Таким образом, белковые фракции, располагающиеся на соответствующих горизонтальных линиях, имели одинаковые значения молекулярных масс.
Для проведения условных вертикальных линий применяли различные белковые маркеры, одни из которых (белки сердца мыши) были предложены ранее [Kovalyov L.I. et al. 1995; Шишкин С.С. и соавт. 2004], а другие представляли собой карбомилиро-ванные производные креатинфосфокиназы и карбоангидразы, производимые фирмой «Amersham» (Голландия).
Как следствие, каждое анализируемое изображение оказалось фрагментирован-ным на 49 прямоугольных участков, на каждом из которых располагалось обычно не более 10 белковых фракций (лишь на четырех участках количество фракций превысило 20). Проведенная фрагментация изображений существенно облегчила выполнение последующего сопоставления изображений и построение итоговой стандартизированной двумерной карты.
Вышеописанная работа была проведена с 60 наиболее качественными электрофо-реграммами, полученными при анализе образцов тканей простаты с доброкачественной гиперплазией, и с 50 электрофореграммами, полученными при анализе образов тканей простаты со злокачественными новообразованиями (аденокарциномами).
Масс-спектрометрическая идентификация белков предстательной железы на двумерной карте. Различия белковых паттернов образцов с раком и доброкачественной гиперплазией
Для большей доказательности результата идентификации белок 4454692 исследовали дополнительно технологией MALDIOF MS/MS. Масс-спектр одного из полученных в результате фрагментации пептидов представлен на Рис. 3.9. Как видно из этого рисунка и Таблицы 3.2, программа Mascot идентифицировала по приведенному спектру аминокислотную последовательность изучавшегося пептида и установила ее принадлежность альбуминовому домену. На Рис. 3.7. показано расположение идентифицированного пептида в аминокислотной последовательности гипотетического продукта гена PR02675 (выделен серым цветом). Таким образом, результаты MALDIOF MS/MS полностью подтвердили идентификацию белка 4454692 как продукта гена PR02675.
Ген PR02675 был охарактеризован в 1999 г. [Zhang С. et al. 1999] по его информационной РНК, выявленной при изучении транскриптов в клетках фетальной печени человека. При этом является расчетной полная аминокислотная последовательность гипотетического белкового продукта гена PR02675, которая приводится в базе данных NCBI Protein (номер AF119890).
Среди публикаций, имеющихся в базе данных PubMed (и некоторых других доступных в сети Интернет) не удалось найти сообщений о белковом продукте гена PR02675, кроме единственной работы 2007 г., в которой Eun J.P. et al. сообщили о белке PR02675 как о сывороточном маркере оссификации задней продольной связки позвоночника. Таким образом, наше сообщение 2006 г. [Ковалев Л.И., Еремина Л.С. и др. 2006] о присутствии в тканях ПЖЧ с раковыми опухолями белкового продукта гена PR02675, по-видимому, является первым прямым определением этого нового белка человека, который можно рассматривать как потенциальный молекулярный маркер РПЖ.
Продукт гена PR02675 фактически является С-концевым фрагментом альбумина. Учитывая это, наличие продукта гена PR02675 в тканях простаты при ДГПЖ и РПЖ было дополнительно проверено методом иммуноблоттинга с использованием поликло-нальных антител к альбумину человека (ИМТЕК, Россия). В результате при РПЖ наряду с фракцией альбумина была детектирована фракция, соответствующая продукту PR02675 на электрофореграммах.
Ввиду того, что продукт PR02675, присутствующий в ткани карциномы ПЖ, не имеет собственного названия, было предложено назвать его - альбумин-родственный карциномный протеин 1, или алькарцин 1. Параллельно белок под номером 4161675 по результатам масс-спектрометри-ческого анализа был охарактеризован как еще один представитель семейства белков, содержащих альбуминовый домен. Выявленные при этом пептиды покрывали 44% последовательности гипотетического белка, кодируемого геном PRO2044 (Рис. 3.10). Однако белок 4161675 по молекулярной массе почти в два раза уступал расчетному значению для гипотетического продукта гена PRO2044 - 14,5 кДа и 29,3 кДа, соответственно. Вместе с тем, выявленные пептиды покрывали участки как N-концевой области, так и С-концевой области гипотетического продукта гена PRO2044 (Рис. 3.10). Таким образом, можно было предположить, что белок 4161675 или образуется за счет альтернативного сплайсинга при экспрессии гена PRO2044, или является продуктом пока еще неидентифицированного гена. Соответственно, описанный в данной работе белок 4161675 представляется новым содержащим альбуминовый домен белком, родственным продукту PRO2044.
Предсказанная аминокислотная последовательность белкового продукта гена PRO2044. Подчеркнут альбуминовый домен. Красным шрифтом показаны пептиды, выявленные при MALDIOF MS исследовании белка 4161675 (покрытие составило 44% от общей длины последовательности).
Необходимо отметить, что, подобно гену PR02675, ген PRO2044 был охарактеризован в 1999 г. той же группой китайских авторов по соответствующей информационной РНК, выявленной при изучении транскриптов в клетках фетальной печени человека. Позднее, в 2004 г., появилось сообщение об обнаружении протеомными технологиями при проведении пилотного исследования у больных со злокачественными и доброкачественными опухолями простаты белкового продукта PRO2044 [Rehman I. et al. 2004], а в 2005 г. этот белок был найден в гепатокарциноме [Kawakami Т. et al. 2005]. В публикации 2007 г. Jin Т. et al. сообщили о присутствии в спинномозговой жидкости больных некоторыми видами патологии мозга белкового продукта гена PRO2044, который эти авторы характеризовали как безымянный белок («unnamed protein»). Приведенные данные позволяют предположить, что белковые продукты гена PRO2044 и родственный им белок 4161675, вероятно, каким-то образом связаны с процессами карци-ногенеза, возникающими в различных клетках человека.
Вывод об обнаружении третьего нового белка удалось сделать по результатам изучения фракции под номером на карте 4217670. С помощью MALDIOF MS исследования соответствующих триптических пептидов было установлено достаточно высокое сходство этого белка с гипотетическим белком - продуктом гена, зарегистрированного в Genbank e под номером gi: 16306948. Указанный ген был охарактеризован по соответствующему транскрипту, выявленному в клетках эпителиальной карциномы поджелудочной железы [Dickson М. et al. 2001], что позволило рассчитать аминокислотную последовательность гипотетического белка из 159 а.о., которая приведена в базе данных NCBI Protein (номер ААН09544 - unknown protein).
Результаты идентификации белка 4217670. На аминокислотной последовательности гипотетического белкового продукта гена gi: 16306948 красным шрифтом показаны пептиды, найденные с помощью MALDIOF MS технологии (покрытие 38%). Серым цветом выделены три участка со специфичными для данного белка аминокислотными остатками, позволяющими отличить его от С-концевой последовательности у-актина (описание ниже).
У гипотетического продукта гена gi: 16306948 и белка 4217670 совпали значительные участки аминокислотной последовательности (покрытие 38%). Кроме того, экспериментально определенная величина Мм белка 4217670 (16,5 кДа) оказалась очень близка теоретически рассчитанной величине Мм продукта гена gi: 16306948 (17,5 кДа).
Сопоставление аминокислотной последовательности гипотетического белка - продукта гена gi: 16306948 и С-концевого участка актина гамма 2. Зеленым шрифтом показана последовательность гипотетического белка, а черным шрифтом (через слэш) обозначены аминокислотные замены, имеющиеся в последовательности актина гамма 2; подчеркнут консервативный актиновый участок из 16 а.о. Из Рис. 3.11 и 3.12 видно, что три участка с аминокислотными заменами, по которым различаются гипотетический белок - продукт гена gi: 16306948 и С-концевая область последовательности актина гамма 2 (а.о. 218-376), оказались в структурах идентифицированных пептидов белка 4217670. Таким образом, можно полагать, что белок 4217670 не является продуктом деградации актина гамма 2 или результатом альтернативного сплайсинга соответствующего гена, а, по всей вероятности, образуется при экспрессии гена gi: 16306948 или родственного ему неизвестного гена.
Вместе с тем, из Рис. 3.11 и 3.12 следует, что в структуре белка 4217670 (также, как и в гипотетическом белке) присутствует весьма консервативный фрагмент последовательности из 16 а.о., характерный для большинства известных гамма-актинов позвоночных (подчеркнут на Рис. 3.12). Суммируя данные проведенного анализа структурных особенностей белка 4217670, по-видимому, можно рассматривать его как новый у-актин-родственный белок, впервые выявленный в тканях ПЖЧ.
