Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Агрегация белков 9
1.1. Классификация агрегации белков по структуре агрегатов 9
1.2. Упорядоченная агрегация белков 10
1.3. Неупорядоченная (аморфная) агрегация белков 14
1.4. Связь агрегации белков с заболеваниями человека и животных 28
1.4.1. Амилоидные заболевания 28
1.4.2. Приопные инфекции 33
1.4.3. Прочие заболевания 35
1.5. Влияние детергентов на агрегацию белков 36
1.5.1. Понятие детергентов 37
1.5.2. Индукция и ингибирование детергентами аморфной агрегации белков 41
1.5.3. Индукция и ингибирование детергентами амилоидной агрегации 50 белков
1.5.4. Детергенты как "искусственные шапероны" 54
2. БО ВТМ как модель для изучения агрегации белков 59
2.1. Структура вириона ВТМ 59
2.2. Упорядоченная агрегация БО ВТМ ("полимеризация") 60
2.2.1. Разнообразие упорядоченных агрегатов БО ВТМ 60
2.2.2. Структура БО ВТМ в составе вирионов ВТМ 62
2.2.3. Структура БО ВТМ в составе 20S-дисков 62
2.3. Неупорядоченная (аморфная) термоиндуцироваиная агрегация БО ВТМ 64
2.3.1. Зависимость термоиндуцированной агрегации БО ВТМ от условий 65 среды
2.3.2. Температура термической денатурации БО ВТМ 67
2.3.3. Частично развернутая форма БО ВТМ 68
2.3.4. Механизм термической денатурации БО ВТМ 68
2.3.5. Кинетический анализ прироста мутности при термоиндуцированной 72 агрегации БО ВТМ
2.3.6. Взаимодействия белковых молекул в ходе термоиндуцированной 73 агрегации БО ВТМ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 75
1. Материалы 75
2. Накопление и выделение вирионов ВТМ 75
3. Выделение белка оболочки ВТМ 75
4. УФ-спектроскопия 76
5. Определение истинного поглощения светорассеиваюших систем методом экстраполяции
6. Турбидиметрия 77
7. Флуоресцентная спектроскопия 77
8. Спектроскопия кругового дихроизма 78
9. Аналитическое ультрацентрифугирование ' 78
10. Динамическое лазерное светорассеяние 79
11. Дифференциальная сканирующая калориметрия 79
12. Определение ККМ детергентов методом УФ-спектроскопии (методика Reis и 80 соавт.)
13. Определение стехиометрии связывания ЦТАБ и ВО ВТМ 80
14. Математические расчёты 81
РЕЗУЛЬТАТЫ 82
1. Влияния детергентов разных групп на термоиндуцироианпую (52 С) аморфную агрегацию БО ВТМ
1.1. Анионный детергент ДСН 82
1.1.1. Ингибирование термоиндуцированной агрегации БО ВТМ 82
1.1.2. Реверсия термоиндуцированной агрегации БО ВТМ при помощи ДСН 86
1.2. Катионпый детергент ЦТАБ 88
1.2.1, Низкие концентрации ЦТАБ значительно ускоряют ход термоиндуцированной агрегации БО ВТМ
1.2.2. ЦТАБ в высоких концентрациях проявляет свойства "искусственного шапсропа" в отношении БО ВТМ
1.3. Неионный детергент Тритон Х-100 в зависимости от концентрации по-разному влияет на термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ
2, Влияния трёх разных детергентов на БО ВТМ при комнатной температуре
2.1. Индукция аморфной агрегации ВТМ и его БО при 25 С катионным детергентом ЦТАБ
2.1.1. Зависимость кинетики прироста мутности от соотношения компонентов в ходе агрегации БО ВТМ. индуцируемой ЦТАБ
2.1.2. Влияние ионной силы среды на кинетику индуцированной ЦТАБ агрегации БО ВТМ
2.1.3. Структура молекул БО ВТМ в составе ЦТАБ-индуцированных агрегатов
2.1.4. Стехиометрия детергент-белковых комплексов 98
2.1.5. Определение ККМ ЦТАБ по методике, предложенной Reis и соавт. 100
2.1.6. Реверсия ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ при помощи ДСН
2.1.7. Структура молекул БО ВТМ, освобождённых из ЦТАБ- 105 индуцированных агрегатов
2.1.8. Сравнение кинетики ЦТАБ-индуцированной (при 25 С) и термоиндуцированной (при 52 С) агрегации БО ВТМ методом ДЛС
2.1.8.1. Изучение методом ДЛС термоиндуцированной агрегации БО 107 ВТМ
2.1.8.2. Изучение методом ДЛС ЦТАБ-индуцированной агрегации БО 117 ВТМ
2.1.9. Сравнение кинетики ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ разными методами
2.1.10. "Сверхнизкие" концентрации ЦТАБ препятствуют агрегации БО J20 ВТМ в процессе хранения на комнатной температуре
2.1.11. Агрегация цельных вирионов ВТМ, индуцируемая ЦТАБ при 25 С 122
2.2. Влияние анионного детергента ДСН на БО ВТМ при комнатной температуре 122
2.3. Индукция аморфной агрегации БО ВТМ неионным детергентом Тритон Х- 125 100
2.3.1. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 125 от температуры
2.3.2. Зависимости кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 128 при 30 С от соотношения компонентов
2.3.3. Определение ККМ Тритон Х-100 по методике, предложенной Reis и 128 соавт.
2.3.4. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 130 при 30 С от ионной силы среды
2.3.5. Изучение влияния Тритон Х-100 на БО ВТМ методом ДСК 132
2.3.6. Изучение методом ДЛС аморфной агрегации БО ВТМ. 132 индуцированной Тритон Х-100 при 30 С
2.3.7. Реверсия ДСН аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон 133 Х-100приЗОС
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 136
1. Влияние детергентов разных групп на термоиндуцированную (52 С) аморфную агрегацию БО ВТМ
2. Влияние детергентов разных групп на БО ВТМ при комнатной температуре 143 ВЫВОДЫ 155 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 156
- Агрегация белков
- Накопление и выделение вирионов ВТМ
- Влияния детергентов разных групп на термоиндуцироианпую (52 С) аморфную агрегацию БО ВТМ
- Влияние детергентов разных групп на термоиндуцированную (52 С) аморфную агрегацию БО ВТМ
Введение к работе
Долгое время процессы аморфной агрегации белков изучались в основном в контексте проблем пищевой промышленности. Однако с развитием биотехнологии и увеличением доли лекарственных препаратов на белковой основе в фармацевтике, процессы аморфной агрегации стали создавать серьёзные технические и экономические проблемы и в этих отраслях хозяйства [18]. Это привело к увеличению числа работ, посвященных исследованию процессов аморфной агрегации белков, а выражаясь точнее, работ посвященных поиску путей предотвращения аморфной агрегации. Работами ряда лабораторий было показано, что детергенты могут не только ингибировать агрегацию белков, но и разрушать аморфные агрегаты и вызывать ренатурацию белков [15, 20-22].
Несколько лет назад, когда выяснилось, что причиной ряда важных заболеваний человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) являются именно аморфные агрегаты - предшественники зрелых амилоидов [7, 9], изучение процессов агрегации белков и влияния на эти процессы детергентов стало особенно актуальным.
Белок оболочки (БО) вируса табачной мозаики (ВТМ) характеризуется ярко выраженной склонностью к образованию упорядоченных агрегатов (т.н. «полимеров») (рис. 1) [8]. Формирование «полимеров» БО ВТМ происходит за счёт сильных специфических межсубъединичных взаимодействий разных типов [16]. Кроме того, этот белок является удобной моделью и для изучения неупорядоченной (аморфной) агрегации. Процесс термоиндуцированной (52 С) аморфной агрегации БО ВТМ хорошо воспроизводим и может легко регулироваться путём изменения условий среды [3, 17].
Согласно данным рентгено-структурного анализа [16] субъединица БО ВТМ состоит из классического пучка из четырех а-спиралей, расположенного в вирусной частице вблизи оси вириона и менее упорядоченной части, расположенной ближе к
Нам представляется удобным использование старого термина «детергент», поскольку термин «сурфактант» в русском языке используется мало, а сокращением ПАВ во многих случаях пользоваться не удобно.
Список сокращений: БО - белок оболочки, ВТМ - вирус табачной мозаики, ДЛС -динамическое лазерное светорассеяние, ДСН - додецилсульфат натрия, ФБ - фосфатный буфер, рН 8,0, ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид, А32о - кажущееся поглощение при длине волны 320 нм, обусловленное светорассеянием (оптическая плотность), Vm -начальная скорость прироста А32о в ходе агрегации.
поверхности вириона, на расстояниях более 65 А от его оси (рис. 2). «Внешняя» часть молекулы содержит значительное число гидрофобных остатков, образующих так называемый «гидрофобный гребень» вблизи поверхности вириона. В составе гидрофобного гребня располагаются и все имеющиеся в молекуле БО ВТМ остатки тирозина (2, 70, 72, 139) и триптофана (17, 52, 152) [16].
Термоиндуцированная аморфная агрегация БО ВТМ вызывается нарушением баланса между электростатическим отталкиванием молекул белка и их взаимным притяжением, определяемым мужсубъединичными взаимодействиями. Агрегация инициируется за счёт аберрантных взаимодействий частично-разупорядоченных участков гидрофобного гребня молекул белка [3, 17].
Ранее нами было показано, что при внесении до начала агрегации анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в низких концентрациях (15 молекул детергента на одну молекулу белка) полностью ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ [4]. Поэтому мы решили исследовать действие детергентов двух других групп на БО ВТМ. В качестве таковых нами был выбран катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) и неионный детергент Тритон Х-100.
II CH3-(CH*)]0-CH2-O-S — о
(CH3)3N Br"
додецилсульфат натрия цетилтриметиламмонийбромид
СН3-С(СНз)2-СН2-~С(СНз)2-/^Ь-О-[СН2~СН2-О]10.Н
Тритон Х-100 Целью данной работы было исследование возможных структурных и кинетических механизмов агрегации и дезагрегации БО ВТМ под действием детергентов разных групп. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать действие анионного детергента ДСН, катионного детергента ЦТАБ и неионного детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре.
Исследовать влияние ДСН, ЦТАБ и Тритон Х-100 на термоиндуцированную (52 С) аморфную агрегацию БО ВТМ.
3. Изучить процесс индуцированной нагреванием и детергентами аморфной агрегации БО ВТМ методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).
Научная новизна и практическая значимость работы.
Исследовано действие детергентов трёх разных групп на БО ВТМ при разных условиях среды. Выяснено, что в зависимости от своей природы и условий среды исследованные детергенты могут по-разному влиять на БО ВТМ, причём даже действие одного детергента может меняться на прямо противоположное при изменении его концентрации или температуры.
Обнаружено, что анионный детергент ДСН в концентрациях от 250 мкМ предотвращает термоиндуцированную аморфную агрегацию БО ВТМ, не защищая молекулу белка от термоиндуцированного разупорядочения гидрофобного гребня. В более высоких концентрациях (от 460 мкМ) ДСН вызывает денатурацию этого участка молекулы БО ВТМ при комнатной температуре (25 С), но этого оказывается не достаточно для индукции агрегации.
Катионный детергент ЦТАБ, известный как «искусственный шаперон» [20, 21], в высоких концентрациях (от 400 мкМ) вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ. Оказалось, однако, что в чрезвычайно низких концентрациях (от 17 мкМ) этот детергент оказывает противоположное действие - не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию, но, напротив, эффективно индуцирует агрегацию БО ВТМ при 25 С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,0-8,0. Результатом такой агрегации является образование детергент-белковых комплексов, в составе которых на одну молекулу белка приходится четыре молекулы детергента. Предположительно, аморфной агрегации под действием ЦТАБ при 25 С подвергаются нативные молекулы БО ВТМ. Добавление ДСН в ходе агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации вследствие образования смешанных мицелл из двух детергентов. Использование детергента, несущего противоположный заряд, для удаления «искусственного шаперона» с белка, по-видимому, может представляться в некоторых случаях более удобным вариантом, чем общепринятое использование пиклодекстринов [20, 21].
Концентрации ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию при комнатной температуре (около 0,00005 %) способны защищать БО ВТМ от агрегации при
длительном хранении при комнатной температуре. Вероятно, ЦТАБ может защитить и другие белки от подобной неприятности.
Обнаружено также, что другой «искусственный шаперон» - неионный детергент Тритон Х-100, подобно ЦТАБ, в высоких концентрациях (около 5 мМ) предотвращает аморфную агрегацию БО ВТМ при 52 С. Однако в концентрациях более низких (от 460 мкМ) Тритон Х-100 сам вызывает аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при 30 С, которая может быть реверсирована добавлением ДСН. Эффект индукции агрегации БО ВТМ при помощи Тритон Х-100 сильно зависит от температуры, что может объясняться необходимостью частичной денатурацией молекул белка для инициирования процесса агрегации.
Таким образом, звание «искусственных шаперонов» [20, 21] детергенты оправдывают отнюдь не всегда. Более того, влияние конкретного детергента на отдельно взятый белок невозможно предсказать, а можно выяснить лишь экспериментальным путём.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на XI и XII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2004, 2005), на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006). Работа была апробирована на совместном заседании Учёного Совета Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова МГУ и Отдела физических методов измерений НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ и на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 11 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы.
Работа содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы включает 242 литературных источника.
Агрегация белков
Биополимеры, Б т.ч. белки и пептиды, склонны к формированию надмолекулярных структур, которые принято называть агрегатами. Для обозначения процесса формирования таких структур используются различные термины: агрегация, самосборка, «полимеризация», ассоциация (Waugh, 1957; Oosawa & Kasai, 1962; Butler, 1984; Alberts et al., 2004; Knight & Miranker, 2004).
Так исторически сложилось, что в 50-е и 60-е года годы, когда проводились первые (и чрезвычайно плодотворные) исследования структуры и свойств, скажем так, «самоассоциирующихся» белков (актина, тубулина, инсулина, белка оболочки вируса табачной мозаики), подобными исследованиями занимались в основном физики и биологи. Образующиеся структуры исследователи называли «полимерами», а процесс их образования - «полимеризацией» (Waugh, 1957; Oosawa & Kasai, 1962; Butler, 1984). В эти же годы была разработана система понятий и предложены модели для организации молекул в более крупные, как правило, упорядоченные, структуры (Waugh, 1957; Oosawa & Kasai, 1962). Однако в дальнейшем химики заявили о своих (вполне законных) правах на термины «полимер» и «полимеризация», которые обозначают формирование больших молекул из менылих путём образования ковалентних связей между ними (Травень, 2004). Данные термины практически перестали использоваться для обозначения процессов организации молекул в более крупные структуры и лишь изредка используются в применении к молекулам тех белков, для которых эти термины были введены в 50-60-х годах.
Термин «агрегация» часто употребляется без всяких специальных оговорок, и когда речь идет об образовании высокоупорядоченных амилоидных фибрилл, и когда имеются в виду неструктурированные аморфные агрегаты. Известно, что белковые агрегаты могут не только иметь упорядоченную структуру, но и не обнаруживать регулярного характера взаимодействий между входящими в их состав компонентами, т.е. иметь неупорядоченную структуру (London et al., 1974; Wetzel, 1996; Fink, 1998; Орлов и др., 2001; Kopito, 2002). Наличие или отсутствие упорядоченной структуры является важнейшей характеристикой агрегатов белков.
Известно, что образование некоторыми белками протяженных упорядоченных агрегатов необходимо для выполнения этими белками своей функции (тубулины, актин, миозин, коллаген, эластин, а-кератин, белки оболочки палочковидных вирусов) (Alberts et al., 2004; Butler, 1984), в то время как неупорядоченные (аморфные) агрегаты представляют собою отложения белков, и их образование часто оказывается весьма вредным для клеток и организмов (Kopito, 2002; Маркосян и Курганов, 2004). Кроме того, формирование аморфных агрегатов различных белков и пептидов создаёт серьёзные проблемы в биотехнологии, пищевой промышленности и фармацевтической индустрии (Fink, 1998; Randolph & Jones, 2002).
Долгое время считалось, что патогенным действием в развитии нейродегенеративиых заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) обладают упорядоченные белковые агрегаты, называемые амилоидными фибриллами (Sipe & Cohen, 2001; Zerovnik, 2002). Однако в последнее время уже не вызывает сомнения тот факт, что патогенным началом являются не сформированные амилоидные нити, а какие-то аморфные (нефибриллярные) промежуточные продукты их формирования (Guijarro et al., 1998; Lambert et al., 1998; Chiti et al,, 1999; Hartley et al,, 1999; Conway etal, 2000; Fandrich et ah, 2001).
Мы считаем, что. говоря о процессе агрегации белков, необходимо обозначать характер структуры образующихся частиц: употреблять термин «упорядоченная агрегация», если речь идет о формировании высокоорганизованных надмолекулярных белковых структур (Fink, 1998) и «неупорядоченная агрегация», или «аморфная агрегация» применительно к формированию агрегатов, не имеющих упорядоченной структуры (Wetzel, 1994; Wetzel, 1996; Fink, 1998; Ganesh, 2001: Орлов и др., 2001; Kopito, 2002; Rafikova et al.. 2003). Заметим, что под термином «неупорядоченная агрегация» мы имеем ввиду неупорядоченную структуру именно образующихся агрегатов. Молекулы белка в составе неупорядоченных агрегатов могут быть нативпыми, частично или полностью денатурированными. Иными словами, пространственная структура самих молекул белка в составе агрегатов может быть, как упорядоченной, так и не иметь порядка.
В последние годы становится понятно, что In vivo, в клетках про- и особенно эу кари от ферменты и другие белки функционируют, как правило, не порознь, а в виде сложных «многоферментных» и «многобелковых» («многосубъединичных») комплексов (Ленииджер, 1985; Alberts et al., 2004). Рассмотрение структуры подобных комплексов (которые, наверное, тоже можно было бы назвать агрегатами) находится, однако, далеко за рамками данного обзора.
Накопление и выделение вирионов вирус табачной мозаики
ВТМ размножали на растениях Nicoliana labacum гаг. Scnnsun. Зараженные растения выращивали при 24 С в теплице в течение 3-4 недель, после чего срезали пораженные листья, и хранили их в морозильной камере при -20 "С.
Замороженные листья гомогенизировали в мясорубке и отжимали через марлю. К полученному гомогенату добавляли двойной объем 20 мМ ФБ (рН 7,0). Полученный клеточный сок центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин на центрифуге «Beckman J2-21» (Beckman, США) для осаждения клеточного дебриса, а затем встряхивали со смесью хлороформа с бутанолом (1:1 по объему) в количестве 1/8 от объема полученного препарата. Водную фракцию отделяли низкоскоростным центрифугировнием и осаждали из нее вирус, добавляя полиэтиленгликоль-6000 до концентрации 4 % и хлорид натрия до концентрации 0,5 М. Осадок вируса собирали центрифугированием при 10000 об/мин и ресуспендировали в 20 мМ ФБ (рН 7,0). Вирус из суспензии осаждали ультрацентрифугированием в течение 90 мин при 30000 об/мин на центрифуге «Beckman L5-50» (Beckman, США). Затем вновь ресуспендировали в 10 мМ ФБ (рН 7,0) и осветляли центрифугированием на центрифуге «Beckman J2-21» в роторе JA 20 при 8000 об/мин в течение 20 мин. Цикл дифференциального центрифугирования повторяли 2-3 раза (Атабеков, 2002).
Выход ВТМ составлял около 1 г на 1 кг листьев. Вирусные суспензии с добавлением нескольких капель хлороформа хранили в холодильнике при +4 С.
3. Выделение белка оболочки ВТМ
Выделение белка оболочки из препаратов дикого (U1) штамма ВТМ проводили ацетатным методом (Fraenkel-Conrat, 1957). К суспензии вирионов, помещенной в ледяную баню, добавляли, помешивая, по каплям двойной объем охлажденной ледяной уксусной кислоты до полного разрушения вириоиов и выпадения осадка РНК. Хлопьевидный осадок РНК отделяли центрифугированием при 16000 об/мин и +4 С в течение 20 мин на центрифуге «Beckman J2-21» в роторе JA 20. К прозрачному супернатаиту, содержащему белок оболочки, добавляли равный объем холодной деионизировашюй воды и диализовали в течение суток против двух-трех смен дистиллированной воды (по 3 л) при +4 С (Атабеков, 2002).
При достижении рН 4,5 (что соответствует изоэлектрической точке белка оболочки ВТМ) белок выпадал в осадок, который собирали центрифугированием при 18000 об/мил в течение 20 мин на центрифуге «Beckman J2-21». Осадок растворяли в 10 мМ ФБ. Белок осветляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге «Beckman ,12-21» (Атабеков, 2002).
Выход белка состанля.ч обычно 50-70 % от рассчетного. Полученные препараты белков разделяли на аликвоты и хранили при концентрации 4-7 мг/мл и температуре -20 С.
Во всех расчётах молекулярную массу БО принимали равной 17,5 кДа.
4. УФ-спектроскопия
УФ-спектры БО В ЇМ, детергентов или смесей измеряли в кюветах с длиной оптического пути 0,2-1,0 см на двулучевых спектрофотометрах «SPECORD UV-VIS» (Carl Zeiss Jena, Германия) или «Shimadzu UV-1601» (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Япония) в области 190-350 нм.
Для определения концентрации ВТМ. и использованных в работе белков использовали следующие коэффициенты поглощения: А2Ь0"= 2,30 для ВТМ, АШ)" = 1,30 для БО ВТМ (Dobrov el aL 1977), А\= 2,63 для лизоцима, А = 0,83 для миоглобина и A g 0% = 0,65 для БСА.
В экспериментах использовались следующие концентрации веществ: ВТМ 0,21 мг/мл (содержит IL5 мкМ БО); БО 5,75-28,8 мкМ (0,1-0,5 мг/мл); лмзоцим, миоглобин и БСА 0,2 мг/мл; ДСН 11.5-460 мкМ; ЦТАБ 0,00144-2 мМ; Тритон Х-100 0,0021 -2 мМ. Все эксперименты проводились в 10-460 мМ ФБ.
Влияния детергентов разных групп на термоиндуцироианпую (52 С) аморфную агрегацию белок оболочки вирус табачной мозаики
Как было сказано в Обзоре литературы, БО ВТМ является удобным модельным объектом для изучения неупорядоченной агрегации белков. Ранее в нашей лаборатории было показано, что прирост мутности в ходе термоиидуцированнои аморфной агрегации БО ВТМ является необычайно хорошо воспроизводимым, и его скорость можно легко регулировать, изменяя ионную силу раствора, концентрацию белка и другие факторы (Орлов и др., 2001; Rafikova et al., 2003). Именно поэтому, прежде всего, мы решили посмотреть влияние детергентов именно на термоиндуцированиую агрегацию БО ВТМ.
Нами были выбраны три детергента, имеющие разную природу: анионный детергент - додецилсульфат натрия (ДСН), катионный детергент -цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) и неионный детергент - Тритон Х-100.
Влияние ДСН на аморфную агрегацию БО ВТМ при 52 С в случае добавления детергента до старта агрегации (ДСН добавлялся в буфер при 52 С за 10 мин до добавления белка, регистрация агрегации начиналась с момента добавления белка) было изучено в сотрудничестве с Э. Р. Рафиковой и детально представлено в диссертации Рафиковой и работе Рафикова, Панюков и др.. Биохимия, 2004. Поэтому здесь эти результаты мы опишем кратко.
Как видно из рис. 1 б (кривая /), прогревание 0,2 мг/мл (11,5 мкМ) БО ВТМ в 50 мМ ФБ при 52 С в отсутствии детергента приводит к быстрому увеличению мутности (кажущегося поглощения при длине волны 320 нм).
Присутствие низких (0,0016% - 0,005%) концентрации ДСН до добавления в систему белка вызывает уменьшение начальной скорости прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ (рис. 16, кривые 2-6). Полное подавление термоиидуцированнои агрегации БО ВТМ в этих условиях наблюдается при концентрации ДСН 172,5 мкМ (0,005%), что соответствует молярному соотношению [ДСН]:[БО] равному 15:1, Таким образом, ингибирующий эффект имеет место в присутствии примерно одной молекулы детергента на 10 аминокислотных остатков БО ВТМ.
В аналогичных экспериментах с разными концентрациями БО ВТМ было обнаружено, что наблюдаемое ингибирутощее действие ДСН определяется не абсолютной концентрацией детергента, а молярным соотношением [ДСН]:[БО ВТМ].
Ранее в нашей лаборатории было показано (Rafikova et al., 2003), что при частичной денатурации БО ВТМ максимум собственной флуоресценции сдвигается от классических 320 нм к 340 им и уменьшается в 2,5-3 раза. Это свидетельствует о разупорядочении «внешней» части молекулы, содержащей остатки триптофана и тирозина и соответствующей «гидрофобному гребню». Такое разупорядочение приводит молекулу БО ВТМ в склонное к агрегации состояние.
Локализация всех остатков триптофана и тирозина во внешней части молекулы (за пределами пучка из четырех а-спиралей) (см. рис. 14) дает возможность по отдельности наблюдать за разупорядочением этих двух сегментов молекулы: за денатурацией пучка по спектрам кругового дихроизма в дальнем ультрафиолетовом свете (200-250 нм), а за денатурацией «наружной» области - по спектрам флуоресценции в области 300-400 им и спектрам кругового дихроизма в ближнем ультрафиолете (250-300 нм).
По данным флуоресцентной спектроскопии (рис. 17), ДСН в молярном соотношении с белком равном 15:1 при 52 С не предотвращает разупорядочения внешнего сегмента субъединицы БО ВТМ («гидрофобного гребня»). Спад интенсивности флуоресценции и сдвиг максимума при 52 С имеет место и в присутствии 0,005% ДСН (172,5 мкМ) (кривые 2,3).
Оказалось, однако, что ДСН совершенно по-разному действует на разные сегменты молекулы БО ВТМ.
Ранее было показано (Орлов и др., 2001; Rafikova el ah, 2003), что примерно при 42 С (т.е. при частичной денатурации) БО ВТМ, утрачивает около половины исходного содержания а-спиралей и переходит из нативной формы с []зо8 равной -16300 град см дмоль 1 в частично-развёрнутую форму с [в]2ов равной примерно -10000 град см2 дмоль" (так называемую «-10000-форму»). Эта форма содержит примерно половину исходного содержания а-спиралей (25 из 50%) и пе разрушается вплоть до 90 С. Температура перехода из нативной структуры в «-10 000-форму» практически не зависит от молярности ФБ в интервале 10-50 мМ.
Влияние детергентов разных групп на термоиндуцированную (52 С) аморфную агрегацию белок оболочки вирус табачной мозаики
Изучение взаимодействий детергентов с белками продолжается на протяжении уже многих десятилетий. Но хотя в этой области было выполнено некоторое количество фундаментальных работ (Anson, 1939; Duggan & Luck, 1948; Shirahama et al., 1974; Bon et ai., 1999; Hoffmann & van Mil, 1999), в основном, эти исследования носили прикладной характер и публиковались в специфических журналах (Journal of agricultural and food chemistry, International journal of food science and technology и т.п. - см. Обзор литературы). Изначально считалось (и в значительной мере это остаётся верным), что детергенты должны разрушать упорядоченные и аморфные агрегаты белков, и большое количество работ было посвящено именно влиянию детергентов на процессы агрегации (McMeekin et al., 1949; Ghosh & Banerjee, 2002; Considine et al., 2005a; Sun et al., 2005). И только в последние годы, в значительной мере вследствие вновь возникших потребностей фармакологии, в изучение этой проблемы включились по настоящему сильные коллективы, что привело к существенному повышению качества публикуемых материалов. Одним из проявлений этого процесса стало, например, формирование Центра фармацевтической биотехнологии (Center for Pharmaceutical Biotechnology - СРВ) в Университете Колорадо (США), возглавляемого одновременно тремя знаменитыми учёными: John Carpenter, Mark Manning и Theodore Randolph.
Второй причиной усиления интереса к проблеме взаимодействия детергентов с белками стало появление нескольких работ, в которых сообщалось об ускорении образования белками амилоидных фибрилл под действием мембранных фосфолипидов (Zhu &. Fink, 2003; Knight & Miranker, 2004) (см. Обзор литературы). И хотя аналогия между детергентами и мембранами нам представляется небезупречной, в последние годы появился ряд работ, в которых сообщалось об индукции амилоидогенеза под действием детергентов (Perinhez et al., 2002; Chirita et al., 2003; Necula & Kurel, 2004; Bisaglia et al, 2005).
Наш интерес к проблеме влияния детергентов па агрегацию БО ВТМ первоначально был связан с извечной задачей предотвращения аморфной агрегации. Быстро выяснилось, что ДСН, как и можно было ожидать, предотвращает и реверсирует термоиндуцированнуто аморфную агрегацию нашего белка (Рафикова и др., 2004). Однако потом оказалось, что катионный детергент ЦТАБ в очень низких концентрациях (15-300 мкМ) не только не ингибирует, но, наоборот, эффективно индуцирует агрегацию БО ВТМ, причём при комнатной температуре и в нейтральном фосфатном буфере (Панюков и др., 2005). В дальнейшем обнаружилось, что аморфной агрегации под действием ЦТАБ подвергаются нативмые (или почти нативные) молекулы белка, что поставило в порядок дня вопрос о механизмах такой агрегации (Panyukovetal.,2006).
Однако прежде чем перейти к обсуждению полученных нами результатов мы считаем необходимым дать определение некоторых используемых нами терминов, относящихся к взаимодействию детергентов с белками, тем более, что в литературе имеет место существенная неопределённость по этому вопросу.
Известно, что в растворе при достижении определённой концентрации происходит самоассоциация молекул детергента с образованием надмолекулярных структур. Образующиеся структуры состоят из определённого числа молекул детергента (обычно от 10 до 100), ориентированных таким образом, что их иепояяриые «хвосты» формируют внутреннее гидрофобное ядро, а гидрофильные полярные «головки» находятся на поверхности. Ещё в 1913 г. Мак-Бен предложил называть такие ассоциаты мицеллами (Фридрихсберг, 1984; Щукин и др., 2004).
Два детергента (особенно, несущие противоположные заряды) при совместной инкубации могут формировать ассоциаты, в состав которых входяг оба детергента. Такие структуры принято называть смешанными мицеллами, и мы будем пользоваться этим термином именно в применении к таким ассоциатам.
Дело в том, что ряд авторов (Tandon & Horowitz, 1986, 1990; Rozcma & Gellman. 1996a, 1996b; Daugherty ct a!., 1998) использует термин смешанные мицеллы в применении к объектам нашего исследования - различного рода комплексам белков с детергентами. Причём этот термин используется, как в отношении высоких концентраций детергента (выше его ККМ), так и в отношении структур, состоящих из небольшого числа молекул детергента и одной или нескольких молекул белка. Мы будем пользоваться термином компчекс белка с детергентом, когда, по нашему мнению, нет оснований предполагать формирования мицелл детергента и термином комплекс белка с мицеллами, когда можно предположить формирование мицелл детергента.
