Введение к работе
Актуальность темы Протеомика - одна из современных молекулярно- биологических научных дисциплин, которая занимает особое место среди постгеномных наук, так как протеомика в основном занимается идентификацией белков (протеомов) - участников конечной стадии передачи информации в клетке. Доступные данные по аннотированным геномам организмов в настоящее время поставляют базовую информацию для изучения биологических систем с помощью протеомики. Но это только инвентаризация белков, так называемый «белковый конспект» (protein compendium) изучаемой клетки. Однако для понимания процессов, происходящих в клетке, необходим анализ экспрессии мРНК, количественного содержания и взаимодействия белков, их локализации. Протеомика в своем широком смысле предполагает изучение белкового состава, структуры, функции и взаимодействий белковых молекул. Поскольку эукариотическая клетка слишком сложна для прямого протеомного анализа, возрос интерес к расшифровке протеомов органелл.
Митохондрии являются удобным объектом для протеомного исследования, в связи с большой важностью выполняемых функций и относительной простотой организации. Каждая митохондрия млекопитающих содержит от 2 до 10 кольцевых копий мтДНК, которые кодируют у человека 13 белков, 22 тРНК и 2 рРНК [Anderson et al.,1981]. Основное количество белков, которые находятся в митохондриях млекопитающих, кодируется ядерным геномом. Они синтезируются на рибосомах цитоплазмы в виде белков-предшественников, которые затем попадают в митохондрии, используя митохондриальный аппарат импорта. Состав этих белков специфичен для каждой ткани. [Johnson et al, 2007].
Митохондрии являются клеточными «силовыми станциями», синтезирующими основное количество АТФ, используемого эукариотическими клетками. Кроме того, они играют чрезвычайно важную роль в метаболизме аминокислот и липидов, биосинтезах гема и железо-серных кластеров, передаче
Используемые сокращения и обозначения:
MudPIT- Multidimensional Protein Identification Technology, офВЭЖХ- обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, СМЧ— субмитохондриальные частицы, ЖХ- МС/МС— тандемная жидкостная хромато-масс-спектрометрия
сигналов в клетке и в апоптозе. Все эти функции в митохондриях осуществляются и контролируются митохондриальным протеомом, который является динамичным образованием. [Meisinger et al., 2008]. Для понимания этих механизмов на молекулярном уровне необходимо знать белковый состав этих органелл.
Изменения в митохондриальном протеоме оказывают различное влияние на митохондриальный гомеостаз, что, в свою очередь, ведет к появлению различных патологий. Митохондриальные дисфункции играют значительную роль в патогенезе широкого круга болезней (более 50 у человека), которые связаны с нарушением состава или функций белков митохондрий [Calvo et al., 2010].
Протеом митохондрии состоит примерно из 1500 белков (по крайней мере, в митохондрии сердечной мышцы человека) [Meisinger et al, 2008]. Около 1/3 белков, закодированных в генах млекопитающих, геномы которых расшифрованы, являются гидрофобными мембранными белками, следовательно, не менее 1/3 митохондриальных белков также должны быть мембранными белками. Масс- спектрометрический анализ этих белков пока остается технически трудновыполнимым, поэтому можно предположить, что довольно значительное число мембранных белков, даже для наиболее полно установленных митохондриальных протеомов млекопитающих, до сих пор не идентифицировано.
Таким образом, исходя из вышеизложенного, актуальность работы определяется незаконченностью исследований протеома быка. Знания о протеоме необходимы для понимания белкового обеспечения биохимических процессов в митохондриях в норме и при патологии.
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы было исследование белков, составляющих протеом митохондрий из сердечной мышцы Bos taurus, с помощью различных методов, включающих идентификацию белков, определение их локализации и выполняемых функций, а также разработку новых подходов к анализу митохондриального протеома. Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1. Получить белковые фракции из митохондрий сердца Bos taurus, пригодные для протеомных исследований.
-
Провести независимый анализ каждой полученной фракции, включающий расщепление белков на пептиды, разделение пептидного гидролизата, идентификация белкового состава с помощью технологии многомерной идентификации белков MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology).
-
Разработать протеомную методику для анализа гидрофобных фрагментов мембранных белков митохондрий.
-
Провести компьютерный анализ для идентификации белков и определения их внутриклеточной локализации и сублокализации, выполняемых функций и степени гидрофобности.
Научная новизна работы
Проведен независимый анализ двух белковых фракций, полученных из митохондрий сердца Bos taurus, позволивший расширить список идентифицированных белков. Впервые осуществлена идентификация 407 белков, в том числе были определены ферменты, обеспечивающие процессы Р-окисления жирных кислот, белки цикла Кребса, белки, входящие в состав комплексов I-IV, которые обеспечивают тканевое окисление, белки теплового шока, АТФ-синтаза и др. Для 68 белков с ранее неустановленной локализацией были получены данные об их возможной локализации в митохондриях. Среди идентифицированных оказались гипотетические белки, о существовании которых ранее ничего не было известно, кроме информации о кодирующих их генах.
Разработана схема анализа фракции «белков СМЧ», которая включает: 1) обработку фракции трипсином и разделение суммарных триптических пептидов на две подфракции: растворимые «экстрамембранные 1» фрагменты белков и так называемые «бритые СМЧ»; 2) выделение белковых фрагментов подфракции «бритые СМЧ», расщепление их бромцианом и последующая модификация этилендиамином; 3) трипсинолиз модифицированных фрагментов и получение фракции «экстрамембранные 2 + трансмембранные» пептиды; 4) независимый анализ фракций «экстрамембранные 1» и «экстрамембранные 2 + трансмембранные» триптических пептидов с помощью технологии MudPIT. Идентификация белков проводилась с учетом не только триптического, но и возможного неспецифического расщепления.
Научно-практическая значимость работы
Разработан новый подход к протеомной идентификации трансмембранных фрагментов белков митохондрий. Для расширения возможности протеомной идентификации белков была предложена методика, предполагающая, помимо использования традиционного метода MudPIT, проведение разделения общего триптического гидролизата на две подфракции: пептиды, содержащие остатки цистеина, и пептиды, не содержащие цистеиновых остатков, независимый анализ каждой подфракции методом MudPIT и идентификация соответствующих белков.
Среди идентифицированных белков могут присутствовать потенциальные биомаркеры различных заболеваний, например, белок ацетил-CoA ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.9). У человека мутации в гене, кодирующем данный белок, приводят к нарушению его функции, что вызывает наследственные заболевания.
Полученные данные по исследованию белкового состава митохондрий могут быть использованы для изучения патогенеза различных заболеваний крупного рогатого скота и других млекопитающих.
Апробация работы Результаты работ были представлены на XX и ХХІ Зимней Международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009), XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (Москва, 2010), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011).
Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, включая 2 статьи в рецензируемом журнале и 8 тезисов сообщений. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит 16 рисунков, 3 таблицы в основном тексте и 2 таблицы в приложениях. Список литературы включает 204 источника.
