Введение к работе
Актуальность работы. ДНК живых организмов постоянно подвергается модификациям, возникающим в результате воздействия различных факторов. Для предотвращения их накопления и защиты генетической информации существует несколько путей репарации ДНК. Одним из важнейших путей репарации является эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER). NER удаляет из ДНК широкий спектр объемных повреждений, дестабилизирующих регулярную структуру ДНК.
Актуальность исследования механизмов репарации объемных повреждений обусловлена расширением спектра негативных факторов, воздействующих на клеточную ДНК. Кроме того, некоторые противоопухолевые препараты реализуют свою цитотоксичность за счет повреждения ДНК. Однако вследствие высокой адаптивности, характерной для репаративной машины NER, ферменты репарации препятствуют сохранению повреждений, а, следовательно, и лечебному действию препаратов. Мониторинг активности системы NER может позволить не только выбрать оптимальную стратегию лечения онкологических заболеваний, но оценить его перспективность.
Несмотря на то, что общая схема NER уже описана, многие детали этого процесса до сих пор остаются невыясненными. Так, например, значительные усилия исследователей направлены на выявление белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий, приводящих к образованию функционального предрасщепляющего комплекса и скоординированной работе специфических эндонулеаз. Кроме того, остаются невыясненными последовательность связывания с повреждением некоторых белковых факторов, а также композиция репаративного комплекса на разных стадиях NER.
Многие биохимические подходы к изучению системы NER основываются на использовании синтетических ДНК-аналогов субстратов, содержащих объемную модификацию в заданной позиции молекулы. Такие ДНК-аналоги могут быть использованы как для детекции каталитической активности системы NER, так и в качестве зондов для фотоаффинной модификации при условии наличия в их структуре соответствующих фотоактивируемых групп.
Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось создание модельных ДНК - аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов - и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов. В ходе работы планировалось решить следующие задачи:
-
Синтезировать серию протяженных линейных ДНК-аналогов субстратов эксцизионной репарации нуклеотидов и проанализировать свойства полученных модельных ДНК как субстратов реакции эксцизии объемного повреждения.
-
Проанализировать свойства двухцепочечнои структуры модельных ДНК и охарактеризовать изменения регулярной структуры ДНК-дуплексов, возникающие при введении в их состав объемных повреждений.
-
Исследовать взаимодействие синтезированных фотоактивируемых модельных ДНК с белками различных клеточных экстрактов с помощью метода фотоаффинной модификации.
-
Разработать метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro, применимый на уровне экстрактов клеток и тканей.
Научная новизна и практическая значимость работы. Представленная работа является детальным и систематическим исследованием модельных ДНК-дуплексов — аналогов субстратов системы NER.
Данные, полученные в работе, позволили выявить новые, ранее неизученные аспекты функционирования системы эксцизионной репарации нуклеотидов. Исследованы субстратные свойства модельных ДНК, содержащих различные объемные адцукты, в реакции NER in vitro. Показано, что взаимное расположение объемного повреждения и индуцированного его введением участка дестабилизации регулярной двухцепочечнои структуры ДНК может влиять на эффективность удаления такого повреждения в процессе NER, а более высокое сродство ХРС не может служить однозначным критерием эффективности ДНК-лиганда как субстрата реакции эксцизии. Показано, что PARP1 способна взаимодействовать с объемными аддуктами в ДНК, однако не влияет на эксцизию повреждения в процессе NER. Кроме того, разработан применимый на уровне экстрактов клеток и тканей метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro.
Полученные в данной работе результаты позволяют охарактеризовать систему «ДНК субстрат - NER компетентый экстракт» как перспективную экспериментальную платформу, которую можно использовать для создания технологий определения эффективности работы NER в различных системах.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях и 9 тезисах конференций, также получен патент на изобретение. Результаты работы были представлены на российских и международных научных конференциях, в том числе: Regulation of genome stability by DNA replication and repair (Санкт-Петербург,
Россия, 2010), 11th biannual DGDR Meeting of German Society on DNA Repair (Йена, Германия, 2010), Early Events in Human Pathologies (Листвянка, Россия, 2012), 13th FEBS Young scientists forum (Санкт-Петербург, Россия, 2013), 38th FEBS Congress " (Санкт-Петербург, Россия, 2013), Cooperation between Europe and Siberia in science and higher education: records, milestones, foresight (Кемерово и Барнаул, Россия, 2014).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 37 рисунков, 3 таблицы. Библиография включает 217 литературных источников.
