Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Полимеризация актина и его организация в немышечных клетках 7
2. Явление образования геля в клеточном экстракте . 11
3. Актин-связывающие гелеобразуодие белки 14
4. Сокращение гелей в клеточных экстрактах 32
Материалы и методы 35
Результаты исследований . 44
1. Гелеобразование в клеточном экстракте селезенки . 44
2. Фракционирование компонентов геля 55
3. Доказательства того, что высокомолекулярный компонент геля является миозином 70
4. Доказательство роли миозина в образовании геля в экстракте селезенки. Реконструкция геля из очищенных компонентов 79
Обсуждение 86
Выводы 92
Список литературы 94
- Полимеризация актина и его организация в немышечных клетках
- Актин-связывающие гелеобразуодие белки
- Гелеобразование в клеточном экстракте селезенки
- Доказательство роли миозина в образовании геля в экстракте селезенки. Реконструкция геля из очищенных компонентов
Введение к работе
Актуальность работы, Актиновые филаменты (микрофиламенты) являются одной из основных частей цитоскелета эукариотической клетки. Функции гликрофиламентов разнообразны: они участвуют в процессах клеточной подвижности, в делении клеток, в движении внутриклеточных органелл, а также в поддержании внутренней организации клетки. Многие из этих функций: амебоидное движение клеток, цитокинез, образование филоподий, фагоцитоз, секреция - сопровождаются, как считается, локальными изменениями консистенции кортикальной цитоплазмы. Открытое не так давно явление образования геля в экстрактах многих немышечных клеток показало, что изменение консистенции цитоплазмы может происходить за счет объединения отдельных филаментов в трехмерные сети. Такие сети действительно обнаружены in vivo в кортексе ряда немышечных клеток. С другой стороны, гель в клеточном 'экстракте способен сокращаться, что дает основание связывать с сетями микрофиламентов и сократительные свойства цитоплазмы.
Гелеобразование в клеточном экстракте является удобной бесклеточной системой, пригодной для. исследования вопроса о том, как регулируется консистенция и осуществляется движение цитоплазмы в клетках. В настоящее время ведется интенсивное изучение состава актиновых гелей, условий их образования и роли отдельных компонентов в формировании и сокращении геля.
Благодаря феномену гелеобразования был обнаружен особый класс белков, связывающих актиновые филаменты в трехмерные сети. Показано также, что сокращение гелей, образованных с участием таких белков, основано на взаимодействии актиновых филаментов с миозином, то есть трехмерная сеть микрофиламен-
тов в сущности является актошозиновой сократительной системой. Молекулярные механизмы образования, геля, и его сокращения пока неясны. Особую трудность представляет объяснение перехода от образования геля к сокращению, потому что, хотя, теоретически миозин должен сшивать актиновые филаменты, до сих пор нет экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что он может включаться в гель уже при его образовании.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование компонентов стабильного геля, образующегося в экстракте селезенки.
Экспериментальные задачи работы состояли в следующем: - I. Определить условия образования, геля в экстракте селезенки;
Идентифицировать компоненты геля и выделить их в очищенном виде;
Воспроизвести явление гелеобразования с использованием очищенных компонентов;
Исследовать роль каждого из компонентов в реакции образования геля в экстракте.
Научная новизна работы. В результате настоящей работы впервые определены условия образования стабильного геля в экстракте селезенки. Показано, что основными компонентами такого геля являются актин и белок высокого молекулярного веса. Разработан метод диссоциации компонентов геля в растворе, содержащем высокую концентрацию АТФ. С помощью фракционирования солюбилизированного в АТФ геля хроматографией на гидроксиапа-тите получен в высокоочищенном виде высокомолекулярный компонент геля. Изучение свойств очищенного высокомолекулярного белка позволило идентифицировать его как миозин селезенки.
Получены моноспецифические антитела против миозина селезенки. Найдено, что эти антитела ингибируют образование геля, в экстракте селезенки. Таким образом, впервые было показано, что немышечный миозин может являться сущеетвенным структурным компонентом актинового геля.
Научно-практическая ценность "работы. Разработанные в настоящем исследовании экспериментальные подходы могут быть использованы для изучения, роли миозина в изменении вязкости цитоплазмы в других системах, а также для исследования вопроса о том, как этот процесс регулируется. Разработанный метод выделения, шюзина из селезенки является, быстрым и удобным л позволяет получить высокоочищенный препарат, обладающий высокой АТФазной и гелеобразующей активностью. Поэтому он может применяться для выделения немышечного миозина с целью исследования его свойств, получения антител и т.д. Результаты настоящей работы открывают новые подходы для решения вопроса о механизмах регуляции вязкости цитоплазмы в немышечных клетках и возможной роли этого процесса в подвижности и поддержании формы немышечных клеток.
Полимеризация актина и его организация в немышечных клетках
Для немышечных клеток характерны три состояния актина: мономерный актин, отдельные микрофиламенты и структуры более высокого порядка - пучки и сети микрофиламентов. in vitro в растворе низкой ионной силы актин существует в виде мономерного глобулярного белка (G-актин) с молекулярным весом 42 кД. Добавлением соли - KCI до 50-100 мМ и(или) Mgci2 до 0,5-2,0 мМ - можно индуцировать его полимеризацию, если концентрация G-актина превышает некое критическое значение. Эта критическая концентрация невысока, но различна для актинов, выделенных из разных клеток, и зависит от условий полимеризации. Для актина из Acanthamoeba , например, она составляет 0,1 мг/мл при +25С в ОД М KCI /67/.
Процесс полимеризации актина in vitro сопровождается ростом вязкости, который во времени описывается сигмоидной кривой. Полимеризация начинается с нуклеации - образования коротких затравок. Ее сменяет стадия элонгации, на которой к затравкам с обоих концов присоединяются мономеры актина. Увеличение длины филаментов прекращается, когда концентрация G--актина снизится до критического значения - наступает стадия равновесия /135/. Полимеризацию актина можно заметно ускорить добавлением готовых затравок - например, филаментов актина, разрушенных ультразвуком /122/.
Филаменты могут спонтанно ломаться в растворе, увеличивая число центров полимеризации /177/, причем степень фрагментации зависит от экспериментальных условий /178/, и, наоборот, отдельные филаменты могут соединяться конец в конец /122/. G -актин содержит I моль связанного АТФ на моль белка; при полимеризации актина происходит гидролиз связанного АТФ /154/. Раствор полимеризованного актина CF-актин) содержит, как можно видеть под электронным микроскопом, длинные, до 3 мкм, нити диаметром 60-70 А. Каждый филамент актина по внешнему виду напоминает двойную спираль с периодом 36 нм /67/. Филаменты актина обладают большой гибкостью и легко перепутываются, образуя сеть /ИЗ/. Раствор актина является, тиксотропним /20/; Актиновые филаменты полярны, что хорошо видно на фила-ментах, декорированных тяжелым меромиозином /82/. Один из концов декорированного филамента выглядит под электронным микроскопом как наконечник стрелы, другой - как ее оперение. На стадии элонгации к разным концам филамента мономеры актина присоединяются с разной скоростью, эта скорость заметно выше для "оперенного" конца /136/. Поэтому после наступления равновесия, то есть когда уже не происходит увеличения длины фи-ламентов, на "оперенном" конце идет, по-видимому, преимущественно полимеризация, а на "остром" - деполимеризация актина /176/. Актин содержится в любой эукариотической клетке, причем в довольно высокой концентрации: для подвижных клеток его содержание может составлять до 10-15$ общего белка клетки /92/. Условия, существующие внутри клетки, и высокая концентрация актина должны были бы способствовать его полимеризации. Тем не менее в цитоплазме немышечных клеток значительная часть актина (до 50%), как правило, содержится в неполимерном виде /14/. Существуют специальные белки, удерживающие актин от полимеризации. Один из них - профилин, белок с молекулярным весом 16 кД. Он образует очень прочный комплекс с G -актином, стабилизируя его в форме мономера /29/. Этот комплекс настолько прочен, что in vitro он диссоциирует только при денатурации актина в 2 М мочевине /109/. in vivo диссоциация комплекса актина с профилином должна, по-видимому, происходить при быстрой полимеризации актина, например, при активации тромбоцитов /103/. Эта диссоциация, вероятно, происходить при участии специальных белков; во всяком случае, для ос-актинина показана способность вызывать полимеризацию актина из комплекса с профилином in vitro /ІЗ/. Что касается полимерного актина, то есть микрофиламентов, их организация в немышечных клетках лабильна и разнообразна. Но в сущности, все это разнообразие можно свести к двум типам структур - пучкам и сетям из микрофиламентов. В клетках, выращенных в культуре, микрофиламенты часто выявляются в виде высокоорганихованных пучков - волокон натяжения /139, 65/. Такой тип окрашивания характерен для хорошо распластанных клеток. В делящихся клетках микрофиламенты концентрируются в области веретена между полюсами и хромосомами /5/, а при цитокинезе образуют сократительное кольцо /151/. Некоторые клетки имеют особые, только им свойственные структуры, состоящие из микрофиламентов. Примером могут служить клетки кишечного эпителия, имеющие множество микроворсинок; основой каждой микроворсинки служит пучок микрофиламен-тов /132/. Пучки микрофиламентов обнаружены также в филоподиях тромбоцитов /120/, фагоцитирующих макрофагов /158/, целомоцитов морских ежей /153/.
Актин-связывающие гелеобразуодие белки
В этой главе рассмотрены свойства белков, способных связывать актиновые филаменты в трехмерные сети. Одни из них образуют с актином гели в клеточных экстрактах; благодаря этому обстоятельству они были обнаружены и выделены прямо из геля. Другие были очищены просто как актин-связывающие и в очищенном виде оказались гелеобразующими белками. Интересный пример в этом отношении представляет собой винкулин. Это белок с молекулярным весом 130 кД, выделенный из гладких мышц /58/ и немышечных клеток /26, 95/. Долгое время считалось, что винкулин уменьшает вязкость Р-актина /183/. Однако совсем недавно было показано, что в этих препаратах белок был недостаточно очищен и что высокоочищенный винкулин, напротив, резко увеличивает вязкость Р -актина /52/.
Гелеобразующие белки разнообразны как по своим физическим свойствам, так и по условиям, необходимым для проявления их активности. Некоторые из них близки по строению молекул и антигенным свойствам, поэтому их можно объединить в группы. а) АВР и подобные ему белки
Первым из гелеобразующих белков был обнаружен белок легочных макрофагов кролика, названный "асtin-binding protein", сокращенно АВР /69/. Молекулы АВР являются гомодимерами, состоящими из полипептидов с молекулярным весом 270 кД /158,73/. АВР был выделен в чистом виде из геля, который образуется в экстракте макрофагов /74/. Очищенный АВР взаимодействует как с Р -актином макрофагов, так и с мышечным р -актином; это взаимодействие не зависит от температуры, концентрации MgCLg, СаСІ2 и АТФ, но подавляется при повышении ионной силы среды /20/.
Гелеобразующая активность АВР чрезвычайно высока: для. образования геля в растворе Р -актина с концентрацией I мг/мл достаточно присутствия I молекулы АВР на 740 протомеров актина /20/. Насыщение связывания. АВР с актином наступает примолярном соотношении АВР:актин, равном 1:14. При такой высокой концентрации АВР вместо геля образуются пучки актиновых филаментов, в структуре которых заметен четкий период, соответствующий 14 протомерам актина /73/.
На электронных микрофотографиях, полученных с использованием напыления платины по кругу под мальм утлом, молекулы АВР выглядят как длинные гибкие нити, которые случайным образом закручиваются и образуют петли. Каждая такая нить имеет 162 нм в длину и 3 нм в толщину и, по-видимому, соответствует димеру АВР. Предполагается, что мономеры в молекуле связаны "голова к голове". В смеси АВР и р -актина можно видеть, как эти гибкие нити одним или обоими концами связываются с фила-ментами актина, причем концы филамента остаются свободными. Иногда одна молекула АВР оказывается связанной с двумя разными филаментами, образуя как бы мостик между ними /73/. Эти данные свидетельствуют о наличии двух мест связывания актина на концах молекулы АВР.
Изучение влияния АВР на процесс полимеризации актина по изменению двойного лучепреломления в потоке показало, что АВР ускоряет начальный этап полимеризации и вызывает образование более коротких по сравнению с контрольными филаментов актина /75/. По мнению авторов, АВР образует с актином затравки, служащие дополнительными центрами полимеризации, а уменьшение длины филаментов является следствием увеличения их числа /75/.
В растворе актина, полимеризовавшегося в присутствии АВР, под электронным микроскопом выявляются филаменты, имеющие Т-, Г- и Х-образную конфигурацию. Угол пересечения в этих структурах близок к 90. На Т-образных филаментах, декорированных тяжелым меромиозином, видно, что в углу находится "острый" конец филамента /75/.
Если концентрация АВР достаточно высока, полимеризация актина вызывает образование геля. Электронномикроскопическое исследование такого геля показало, что в нем актиновые филаменты пересекаются чаще и под углом, более близким к 90, чем в чистом Р-актине /123/.
Гелеобразование в клеточном экстракте селезенки
Целью нашей работы было изучение явления гелеобразования в экстракте селезенки. Для получения экстракта мы гомогенизировали пульпу селезенки крупного рогатого скота в растворе, содержащем 0,45 М сахарозу, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 4 мМ АТФ, 2 мМ 2-меркаптоэтанол и 50 мМ имидазол-HCI, рН 8,0, при соотношении 100 мл буфера на 100 г ткани. Гомогенат осветляли в течение 45 минут при 100 000 g и температуре +4С.
Полученный таким способом экстракт селезенки через некоторое время переходил в гелеобразное состояние. Об этом можно было судить хотя бы по тому, что экстракт не выливался из перевернутого стакана. Кроме того, в экстракте появлялся материал, который можно было осадить низкоскоростным центрифугированием. Наконец, резко возрастала вязкость экстракта.
При измерении вязкости экстракта мы использовали вискозиметр с падающим шариком /105/, определяя кажущуюся относительную вязкость как отношение времени падения шарика в экстракте ко времени его падения в соответствующем буферном растворе. Знак "оо", которым на рисунке обозначен гель, означает, что в течение 2-3 минут шарик не двигался с начальной отметки, то есть ему требовалось не менее 40 минут для преодоления пути в I см. Используя вискозиметр с падающим шариком, мы изучили некоторые черты процесса гелеобразования в экстракте селезенки и влияние на него различных факторов.
Судя по росту вязкости образование геля в экстракте происходило очень быстро. Результат, представленный на рисунке I, показывает, что в течение нескольких минут вязкость экстракта возрастала минимум в 100 раз.
Рост вязкости сильно зависел от разбавления экстракта (исходная, концентрация, белка в экстракте варьировала от опыта к опыту в пределах 43-52 мг/мл). На рисунке 2 приведены результаты одного из опытов по изучению влияния разбавления экстракта на его вязкость. Видно, что при изменении концентрации белка экстракта с 46 мг/мл до 43 мг/мл, то есть всего на 7%, конечный уровень вязкости экстракта уменьшался по меньшей мере в 60 раз. Это свидетельствует о существовании резкой зависимости гелеобразования от концентрации одного или нескольких белков экстракта селезенки.
Как указывалось в обзоре литературы, для получения геля экстракты немышечных клеток необходимо нагревать до +18-40С. Гелеобразование в экстракте селезенки также быстро происходило при +18-20С и, особенно, при +30С. Однако, в отличие от экстрактов других немышечных клеток, экстракт селезенки переходил в гелеобразное состояние даже при +4С, хотя лишь в результате длительной - до 24 часов - инкубации. Для получения геля в препаративных количествах мы инкубировали экстракт селезенки в течение I часа при +30С. Аналитические эксперименты по изучению гелеобразования были проведены при комнатной температуре (+18-20С).
Гель в экстракте селезенки отличался от описанных в литературе гелей в экстрактах немышечных клеток своей стабильностью. Он был стабилен - не разжижался и не сокращался -в течение по меньшей мере 24 часов. С другой стороны, гель мгновенно и необратимо разрушался при встряхивании. Нельзя. исключить, что при этом происходило не разрушение, а инициированное встряхиванием сокращение геля.
Мы изучили, как влияют на гелеобразование в экстракте селезенки различные факторы: ионные условия, АТФ, цитохалазин В. Эти эксперименты проводились по следующей схеме: вещество добавляли в холодный экстракт, который затем инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации с помощью вискозиметра с падающим шариком определяли вязкость экстракта.
Экстракт селезенки содержал I мМ ЭДТА и I мМ ЭГТА, сле-довательно, гелеобразование в нем могло происходить в отсутствие ионов Mg и Са . Добавление MgCi2 до конечной концентра ции 3 мМ не влияло на гелеобразование. Что касается ионов Са они сильно подавляли возрастание вязкости. Результат исследования влияния СаСІ2 на образование геля в экстракте селезенки показан на рисунке 3. Можно видеть, что ингибирующее действие CaCIg проявлялось в довольно низкой концентрации - 10"% на фоне I мМ ЭДТА и I мМ ЭГТА. Таким образом, процесс гелеобра-зования в экстракте селезенки, так же как в экстрактах большинства немышечных клеток, был чрезвычайно чувствителен к Са2+.
Гелеобразование в экстракте селезенки подавлялось также при увеличении ионной силы раствора. Мы изменяли ионную силу добавлением KCI. Результат, представленный на рисунке 4, показывает, что KCI ингибировал образование геля в концентрации, превышающей 150 мМ.
Доказательство роли миозина в образовании геля в экстракте селезенки. Реконструкция геля из очищенных компонентов
Наша работа посвящена изучению гелеобразования в экстракте немышечных клеток. Эта проблема сейчас вызывает большой интерес. Уже очень давно явления клеточной подвижности описываются в терминах гель-золь-перехода /18/. Электронно-микроскопические исследования показали, что кортекс немышечных клеток лишен органелл и заполнен густой сетью микрофиламентов, которая, по-видимому, обеспечивает гелеобразное состояние кортикальной цитоплазмы /159, 132/. Гелеобразование в клеточном экстракте является удобной системой для исследования молекулярных основ изменения консистенции цитоплазмы,, дающей возможность идентифицировать участвующие в этом процессе белки и определить роль каждого из них путем реконструкции из очищенных компонентов системы с заданными свойствами.
Экстракт селезенки, подобно экстрактам целого ряда немышечных клеток, легко переходит в гелеобразное состояние. Гель, осажденный из экстракта центрифугированием, обогащается в основном двумя компонентами. Один из них был идентифицирован нами как актин: по молекулярному весу и одномерным пептидным картам он не отличается от мышечного актина; кроме того, гелеобразование в экстракте селезенки подавляется цитохалази-ном В, что подтверждает участие актина в образовании геля. Таким образом, подобно всем изученным до сих пор гелям, гель в экстракте селезенки в качестве одного из основных компонентов содержит актин.
Второй компонент геля, выделенный в чистом виде, по всем изученным свойствам оказался похожим на миозин немышечных клеток: он содержит тяжелые цепи с молекулярным весом 200 кД и легкие цепи с молекулярным весом 21 и 16 кД, имеет коэффициент седиментации около 6 s , обладает Са2+- и К /ЭДТА-АТФаз-ной активностью, образует биполярные филаменты; кроме того, киназа из экстракта селезенки фосфорилирует его по легкой цепи с молекулярным весом 21 кД. На основании этих признаков мы считаем второй компонент геля миозином. Следовательно, основную массу геля, образующегося в экстракте селезенки, составляют актин и миозин.
Но является ли миозин существенным компонентом геля? Можно было бы предположить, например, что миозин декорирует акти-новые филаменты в составе геля и потому соосаждается с ним. Два рода данных свидетельствуют об активном участии миозина в формировании геля: во-первых, антитела против миозина селезенки ингибируют гелеобразование в клеточном экстракте; во-вторых, очищенный миозин селезенки образует гель с актином.
Вообще говоря, для миозина естественно образовывать гель с актином, потому что каждая молекула миозина на двух своих головках имеет два места связывания р -актина. Для мышечного миозина гелеобразующая активность уже давно была показана: и мышечный миозин /20,1/ и его фрагмент - тяжелый меромиозин /163/ резко увеличивают вязкость Р-актина, а, по данным электронной микроскопии, две головки тяжелого меромиозина могут в растворе связываться с разными филаментами актина /163/.
Эффективность мышечного миозина как гелеобразугощего белка несколько ниже, чем эффективность, например, актин-связываю-щего белка (АВР) макрофагов, но сравнима с эффективностью фи-ламина: если молекулярный вес каждого из трех белков округлить до 500 кД, то при концентрации актина I мг/мл минимальное молярное соотношение с актином, при котором уже происходит образование геля, для АВР составит 1:740, для филамина - 1:190, для мышечного миозина - 1:100 /20/. Что касается немышечных миозинов, наблюдать гелеобразование в смеси немышечного миозина и актина до сих лор не удавалось. Попытки получить акто-миозиновый гель предпринимались с очищенными миозинами макрофагов /158/, лолиморфноядерных лейкоцитов /16/ и яйцеклеток морского ежа /89/. Во всех случаях миозин взаимодействовал с актином с образованием белого мелкодисперсного осадка. Наши данные являются первым экспериментальным доказательством того, что и немышечный миозин может обладать гелеобразующей активностью. Очищенный миозин селезенки вызывал резкое возрастание вязкости у-актина, которому соответствовало появление трехмерной сети филаментов, видимой под электронным микроскопом. Данные о том, что миозин является необходимым компонентом геля в экстракте селезенки, не исключают, разумеется, участия в образовании этого геля других актин-связывающих белков. Электрофорез экстракта и геля, осажденного из него центрифугированием, показал, что в них иногда присутствовал лолипептид с электрофоретической подвижностью АВР. Однако количество этого компонента было мало и варьировало от опыта к опыту. Кроме того, гель, образующийся в экстракте селезенки, по трем важным свойствам отличался от геля, состоящего из актина и ІШР. Как известно, гель из актина и АВР разжижается при охлаждении и растворяется в среде с 0,6 М KCI /158, 16/, а антитела против миозина не влияют на его образование /16/. Гель же, образующийся в экстракте селезенки, не только не разжижался при охлаждении, но даже образовывался на холоду, хотя и в результате длительной инкубации. Кроме того, он не растворялся в 0,6 М KCI. Наконец, его образование полностью подавлялось антителами против миозина. Поэтому, хотя участие АВР (а может быть, и каких-нибудь еще актин-связывающих белков) в образовании нашего геля исключить нельзя, в данном случае он не являлся существенным функциональным компонентом геля.
