Исследование актин-связывающих белков мозга крупного рогатого скота Верховский Александр Борисович

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы 8

1. Общие представления об актиношх микроштаментах и их функциях в метке 8

2. Структура и свойства мономера актина 10

3. Структура и свойства р -актива 12

4. Полимеризация актина 19

4.1. Значение полимеризации и общая характеристика реакции 19

4.2. Стадии полимеризащш актина 20

4.3. Влияние цитохалазинов и фаллоидина на полимеризацию актина 37

5. Взаимодействующие с актином белки ншлішшх kietok 41

5.1. Белки, взаимодействующие с G-актином и ингиби-рующие его полимеризацию 41

5.2. Белки, сшивающие актиновые филаменты между собой 45

5.3. Белки, укорачивающие актиновые филаменты 50

5.4. Возможные биологические функции актин-связывающих белков 60

5.5. Направления дальнейших исследований биохимии актин-связывающих белков 68

2 Материалы и методы 71

1. Материалы 71

2. Методы 72

2.1. Получение ацетонового порошка из скелетных мышц кролика 72

2.2. Получение актина 73

2.3. Получение тубулина 75

2.4. Получение экстракта мозга для аффинной хроматографии и для получения фактора, понижающего вязкость актина 77

2.5. Иммобилизация актина на сефарозе, активированной Вгси 78

2.6. Подготовка ионообменников 78

2.7. Определение кажущейся вязкости актина с помощью вискозиметра с падающим шариком 79

2.8. Определение удельной активности фактора, понижающего вязкость актина 80

2.9. Определение ДНКазной активности 81

2.10. Определение полимеризации актина оптическим методом 81

2.11. Аналитическое ультрацентрифугирование 81

2.12. Электронная микроскопия 81

2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле 82

2.14. Получение одномерных пептидных карт 84

2.15. Определение концентрации белка 85

2.16. Перевивка асцитной карциномы Эрлиха и получение экстракта клеток карциномы 85

3. Исследование влияния белков экстракта мозга на состояние актина 86

1.1. Отсутствие у экстракта мозга способности образовывать актиновый гель 86

1.2. Обнаружение в экстракте мозга белка, понижающего вязкость актина 88

4. Ввделение актин-связыващих белков мозга методом аффинной хроматографии и исследование их активности 90

2.1. Тубулин - основной актин-связывающий белок мозга 90

2.2. Тубулин не обладает способностью понижать вязкость F -актина 97

2.3. Влияние тубулина на седиментационные свойства актина 105

2.4. Выделение белкового фактора, ответственного за понижение вязкости актина экстрактом мозга 111

2.5. Фактор, понижающий вязкость актина, представляет собой комплекс актина и белка с молекулярным весом 90 кД 124

5. Исследование механизма действия комшіжса актина и белка с молекулярным весом 90 кД 138

3.1. Понижение вязкости актина комплексом обусловлено уменьшением длины актиновых филаментов 138

3.2. Комплекс из мозга ингибирует элонгацию актиновых филаментов на предпочтительном для полимеризации конце 147

3.3. Влияние ионов Са на активность белкового комплекса из мозга 151

3.4. Комплекс из мозга отличается по механизму действия от цитохалазина D - он способен укорачивать актиновые филаменты, стабилизированные фаллоидином и тропомиозином 156

Обсуждение результатов 164

Выводы 186

• Структура и свойства мономера актина
• Взаимодействующие с актином белки ншлішшх kietok
• Иммобилизация актина на сефарозе, активированной Вгси
• Влияние тубулина на седиментационные свойства актина

Введение к работе

Актуальность проблемы. Один из основных сократительных белков - актин - обнаружен во всех эукариотических клетках. В мышечных клетках актин является одним из основных компонентов миофибрилл и обеспечивает вместе с миозином выполнение специализированной двигательной функции - мышечного сокращения. В других типах клеток актин образует систему микрофилаїлентов, которые вместе с другими фибриллярными структурами (микротрубочками и промежуточными филаментами) составляют цитоскелет и выполняют разнообразные функции - участвуют выдвижении, изменении формы клеток, цитокинезе, экзо- и эндоцитозе, перераспределении поверхностных рецепторов и других процессах. Организация актиновых микрофиламентов в немышечных клетках характеризуется разнообразием и способностью к быстрым перестройкам. В последнее время накапливаются данные о том, что конкретные способы организации и функционирования актина в различных клетках определяются взаимодействующими с актином белками. Изучение актин-связывающих белков и механизмов их взаимодействия с актином необходимо для понимания организации и функционирования актинового цитоскелета.

Головной мозг млекопитающих характеризуется высоким содержанием актина. В культуре нервных клеток наблюдаются типичные актин-зависимые процессы - прикрепление к субстрату, образование и рост отростков и т.п. Вместе с тем об актин-связывающих белках головного мозга до начала нашей работы почти ничего не было известно. Поэтому выделение и исследование этих белков представлялось актуальной задачей.

Поскольку белки микротрубочек и промежуточных филаментов

мозга хорошо изучены, мозг представляется наиболее удачным объектом для поиска белков, обеспечивающих взаимодействие актиновых микрофиламентов с другими цитоскелетными структурами. Это делает задачу исследования актин-связывающих белков мозга особенно интересной.

Цель работы и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании взаимодействующих с актином белков мозга. При этом были поставлены следующие основные задачи: I) обнаружить актин-связывагащие белки мозга; 2) выделить их в очищенном виде; 3) исследовать механизм действия очищенных белков на полимеризадшо и состояние актина; 4) выяснить, какие белки могут обеспечивать взаимодействие актиновых микрофиламентов с другими цитоскелетными структурами.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы. В работе впервые показано, что основным (по количеству) актин-свя-зывающим белком мозга является белок микротрубочек тубулин. Таким образом, получено свидетельство в пользу непосредственного взаимодействия белков различных фибриллярных структур клетки, что имеет важное значение для дальнейших исследований в этой области.

В мозге обнаружен фактор, понижающий вязкость р-актина. Этот фактор впервые выделен и идентифицирован как комплекс актина и белка с молекулярным весом 90 кД. Было показано, что выделенный комплекс ускоряет полимеризацию актина, блокирует элонгацию филаментов на предпочтительном для полимеризации конце и укорачивает актиновые филаменты. Применив новый экспериментальный подход - использование факторов, стабилизирующих F-актин, мы получили данные в пользу того, что уменьшение длины актино-

вых филаментов под действием комплекса происходит путем непосредственной фрагментации филаментов.

Поскольку полученный комплекс является эффективным фактором, фрагментирующим актиновые филаменты, он может быть использован для экспериментальных исследований цитоскелета различных типов клеток. Примененный в работе критерий фрагментирущей активности - способность укорачивать стабилизированные актиновые филаменты -имеет важное значение для исследования и классификации других укорачивающих актиновые филаменты белков.

Список принятых сокращений

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

ДЦФ - аденозин-б'-дифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГТФ - гуанозин-б'-трифосфат

ДЦС-її а - додецилсульфат натрия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза I - дезоксирибонуклеаза I

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза

ЭГТА - этиленгликоль-бис/2-аминоэтиловый зфир/-їі,іг-

тетраацетат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ АКГИНОВЫХ ШКРОФШМЕНТАХ И ИХ ФУНКЦИЯХ В КЛЕТКЕ

Ыикрофиламенты толщиной 5-8 нм обнаружены во всех эукариоти-ческих клетках. Вместе с другими фибриллярными структурами - микротрубочками (диаметр 25 шл) и промежуточными филаментами (диаметр 10-13 нм) - они составляют цитоскелет. Основншл компонентом микрофиламентов является белок актин. Об этом сввдетельствуїот данные иммунофлуоресцентной и шлмуноэлектронной микроскопии с применением антител К актину ( Lazarides, Weber, 1974; Hendersson, We-Ъег,1979; Weihing, 1976 ), способность обнаруживаемых в клетке ' микрофиламентов взашлодейстзовать с тяжелым меромиозином (isiiikawa, 1969 ), а также то, что очищенный актин при полимеризации in vitro образует филаменты, морфологически неотличимые от тлеющихся в клетке.

Актиновые микрофиламенты образуют в клетках структуры нескольких типов. Во многих клетках обнаруживаются пучки микрофиламентов, которые проходят в цитоплазме параллельно длинной оси клетки (см. обзор Byers et ai., 1984 ) Эти пучки обычно начинаются в местах тесного контакта клетки с субстратом - так называемых фокальных контактах. Пучки микрофиламентов (отличающиеся по структуре от цитоплазматических) образуют цитоскелет различных выростов клеточной поверхности - микроворсинок, стерео-цилий, акросомальных отростков (см. обзор DeRosier, Tilney, 1984 ). Другой тип организации микрофиламентов представляют собой сети, которые обнаруживаются преимущественно в примембранной цитоплазме ( Goldman et al.,1976;Small et al.I98$. Актин, нахо-

дящийся в форме коротких олигомеров, также может участвовать в построении цитоскелета. Это имеет место, по-видимому, в примемб-ранном цитоскелете эритроцитов (см. обзор Goodman, Sniffer, 1983 ).

Кроме того, в немышечных клетках обнаруживается значительное

Количество НеПОЛИМерНОГО, растворимого актина (Bray, Thomas, 197 6; Кот 1978 ).

Функция актина хорошо изучена в специализированных клетках -мышечных волокнах, где актин участвует в процессе сокращения. По аналогии актину приписывают двигательную функцию и в других типах клеток. Для исследования функций актина используют также эксперименты, в которых систему актинонах микрофиламентов в клетке нарушают при помощи специфических ядов (цитохалазинов, фаллоидина) или путем микроинъекции некоторых взаимодействующих с актином белков. Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что актин участвует в поддержании и изменении формы клеток, клеточном движении, цитокинезе, экзо- и эндоцитозе, перераспределении рецепторов клеточной поверхности и др. процессах ( Tanenbaum,I978;Wehland et al.,I977;Gawlitta et al. ,I980;WehiLand,Weber, 1979 ). Выполнение столь разнообразных функций обеспечивается благодаря взаимодействию актина с различными белками, которые определяют взаимопревращения мономера, полимера и агрегатов полимерного актина.

В настоящем обзоре литературы рассмотрены биохимические аспекты организации и функционирования клеточного актина: структура и свойства мономера актина и актинонах филаментов и реакция по-лимеризации. Описаны также актин-связывающие белки немышечных клеток, регулирующие образование актиновых филаментов и надфила-ментных структур. В заключительных разделах обсуждается, каким

образом взаимодействие актина с актин-связывавдими белками может определять организацию и функционирование цитоскелета, и намечены направления дальнейшего исследования актин-связывающих белков.

2. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МОНОМЕРА АКТИНА

Актин из мышц млекопитающих содержит 375 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 42 000 ( Elzinga et ai.,1973 ) Во многих немышечных актинах и-концевой остаток аспарагиновой кислоты мышечного актина отсутствует, и они содержат 374 аминокислотных остатка (Vandekerckhove,Weber, 1978 ). Аминокислотный состав актина не отличается шшакими особенностями, кроме кислого характера и-концевого пептида и необычной аминокислоты -3-метилгистидина, находящегося в положении 73 как у мышечных, так и у немышечных актинов ( Vandekerckhove, Weber,1978а ). Аминокислотная последовательность актинов отличается исключительной консервативностью - актин из миксомицета Physarum только на Q% аминокислотной последовательности отличается от актина из мышц млекопитающих и только на 5% - от немышечного актина млекопитающих ( Vandekerckhove, Weber, 1978а ). Различия между актинами из различных тканей одного и того же вида (6% между мышечным и немышечным актинаг.ш быка) так же велики, как и между актинами неродственных видов ( Vandekerckhove, Weber, 1978 ). Наибольшую вариабельность обнаруживает ж-концевая последовательность актинов, в особенности N-концевой тетрапептид, хотя у всех актинов он имеет КИСЛОТНЫЙ характер ( Vandekerckhove,Weber, 1978b ). Различия В

кислотности ж -концевого тетрапептида служат основой для разделения актинов методом изоэлектрогоокусирования ( zechel,Weber,1978 Garreis, 1976 ). В тканях одного организма обнаруживается нес-

- II -

колько различных актинов. Так, у быка обнаружено 6 .форм актина: один актин в скелетной мускулатуре, один в сердечной мышце и по две формы в гладкомышечных и немышечных клетках ( Vandekerckhove, Weber, 1978Ъ ). Такое же число форм актина обнаружено в тканях цыпленка (Cleveland et aU980). Актин из скелетной мускулатуры при изоэлектрофокусировании оказывается самым кислым - он получил название Ы-актина. Два изоэлектрических варианта актина из немышечных клеток называются В - и f-актинами. Эти же наименования применяются и для гладкомышечных форм актина, хотя по первичной структуре гладкомышечные актины отличаются от немышечных того же организма.

Молекула актина содержит один центр связывания нуклеотида и один центр высокоаффинного связывания двухвалентного иона ( Heidi,Engel, 1979; Kasai,Oosawa, 1968 ). В G-актине ИЗ мышц, выделенном обычным способом, центр связывания нуклеотида занят АТФ ( straub,Peuer,i950 ), а центр связывания двухвалентного иона - ионом Са (Martonosi et ai.1964). Кроме АТФ, в нуклеотид-

связывающем центре могут связываться также АДФ и аналоги АТФ.

7 —Т Константа связывашш для АДФ (4,5 х ЮМ ) в 150 раз меньше константы связывания АТФ (7,5 х ю\гЪ( Neidl,Engel, 1979 ), что означает, что при физиологических концентрациях АТФ и АДФ центр связывания нуклеотидов в G-актине занят практически полностью АТФ. Центр связывания двухвалентного иона в физиологических уело-виях, по-видимому, занят ионом Mg . Кроме Mg ⁺ и Са в этом центре могут связываться и другие двухвалентные ионы, но не одновалентные ( Kasai,0osawa,I968; Prieden et al.,I980 ). Нуклео-тид из актина может быть удален путем продолжительного диализа или обработки активированным углем ( Barany et ai.,1961 ), но

быстрее всего удаляется после связывания двухвалентного иона

ЭДТА ( Strzelecka-Golaszewska, 1974 ), ХОТЯ нуклеотидсвязы-вающий центр и центр связывания иона и находятся в разных участках молекулы белка ( jacobson, Rosenbusch, 1976 ). После удаления нуклеотида и двухвалентного иона актин быстро денатурирует и теряет способность к полимеризации ( Jacobson, Rosenbusch,1976; Strzelecka-Golaszewska,1974; Engel et al.,I977 )

Рентгеноструктурные исследования кристаллов комплекса актина с ДНКазой I, а также анализ изображений кристаллических слоев актина, образующихся в присутствии ионов Gcr⁺ , показали, что молекула актина имеет вытянутую, возмогло, даже гантелеобразную форму (suck et ai.,1981; Aebi et ai., 1981 ). Размеры молекулы (5-7)x 4x3 нгл³.

По данным кругового дихроизма актин в мономерном состоянии содержит 26$ rf-спирали и 26$ ^-структуры (Murphy, 1971 ).

3. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА F-АКТИНА

Структура шиламентов актина была изучена путем прямого измерения электронных микрофотографий, а также путем обработки методом оптической дифракции изображений упорядоченных слоев фила-ментов ( Huxley, 1963, Moore et al.,I970; Wakabaiashi et al., 1975; Egelman, DeRosier, 1983 )

Эту структуру обычно описывают одним из двух способов (см. схему I). Согласно первому способу актиновыи филамент представляет собой стержень, состоящий из двух спирально закрученных друг относительно друга тяжей субъединиц примерно глобулярной формы. Такая структура легко выявляется на микрофотографиях негативно контрастированных образцов без всякой дополнительной обработки.

- ІЗ -

Схема І. Схема спиральной упаковки протомеров в актиновом филаменте. 1,2 - правозакрученные спиральные тяжи с шагом 74 нм; 3 - левозакрученная спираль с шагом 5,9 нм; 4 - центры протомеров актина.

Характерной особенностью структуры F-актина является периодическое изменение видимого диаметра филамента: в терминах двухтяжевой модели филамента сечения с наименьшим видимым диаметром соответствуют местам, где спиральные тяжи проходят друг под другом (скрещиваются); области увеличенного диаметра соответствуют отрезкам, где тяжи лежат бок о бок. Кажущееся пересечение тяжей наблюдается через каждые 37 нм. Поскольку тяжи пересекаются дважды за полный оборот спиралей, шаг спиралей составляет ~74 нм. Исследование образцов, напыленных металлом под фиксированным утлом показало, что двойная спираль актина закручена вправо ( Depue, Rice, 1965 ). На полный оборот в каждом из тяжей обычно приходится 13 актиновых протомеров. Степень закрученности тяжей и, следовательно, шаг спиралей и число протомеров на оборот могут несколько варьировать даже в пределах одного препарата актина и, по-видимому, одного филамента. Такая вариабельность структуры имеет важное биологическое значение, поскольку обеспечивает гибкость филаментов и образование из них пучков с различными типами упаковки (см. обзор DeRosier, Tilney, 1984 )

Другой способ описания структуры актинового филамента состоит в том, что протомеры представляют лежащими на одной левоза-крученной очень крутой спирали с шагом 5,9 нм. Зта спираль выявляется при исследовании микрофотографий методом оптической дифракции, а также непосредственно на образцах, напыленных металлом,

В ВІЗДЄ КОСОЙ ИерИОДИЧеСКОЙ ИСЧерЧеННОСТИ (Heuser,KirschnerI98o).

На один оборот левой спирали приходится примерно 2,16 субъединиц, каждая субъединица смещена относительно предыдущей вдоль оси спирали на 2,73 нм и повернута относительно оси спирали на угол 166 + 10 (Egelman,DeRosier, 1982 ). От ЭТОГО утла СИЛЬНО зави-

сят парметры спирали. Так его изменение на 1 приводит к изменению расстояния между калящимися пересечениями правозакрученных тяжей на 2,7 нм.

Поскольку молекула актина асимметрична, существенным является вопрос об ориентации протомеров актина в филаменте. По вопросу об ориентации протомеров относительно оси филамента до сих пор имеются разногласия. Существуют две модели упаковки протомеров с совершенно различной ориентацией (см. схему 2): в одной из них ( Smith et ai., 1983 ) длинная ось протомера почти параллельна оси филамента, в другой (Egeiman, DeRosier, 1983 ) - отклоняется от перпендикуляра к длинной оси филамента на 10-30. Обе модели дают "правильные" параметры актиновой спирали и позволяют объяснить дифракционные картины от изображений слоев филаментов. Возможность сосуществования столь различных моделей обусловлена тем, что при анализе дифракционных картин от слоев филаментов»которым получена большая часть информации о структуре актина, имеется неоднозначная процедура выделения индивидуальных филаментов. Две модели принципиально различаются по характеру предполагаемых контактов между протомерами и по предсказываемому шли диаметру филамента. В модели с "параллельной" ориентацией субъединиц предполагается, что каждый актиновыи протомер в филаменте контактирует с четырьмя соседями: с двумя в "своем" тяже и с двумя в "чужом". Таким образом, тлеется непрерывная система контактов между протомерами как вдоль правых "пологих" спиралей, так и вдоль левой "крутой". Напротив, в модели с "перпендикулярной" ориентацией каждый протомер контактирует лишь с двумя соседями и контакты располагаются только вдоль левой спирали. Следовательно, традиционное выделение в филаменте двух ігравозакрученшх тяжей по этой модели не имеет

I '

Схема 2, Две модели структуры актинового филамента с различной ориентацией протомеров относительно оси филамента.

А - модель с "продольной" ориентацией протомеров. Б - модель с "поперечной" ориентацией протомеров. I - правозакрученные спиральные тяжи (для простоты филшлент представлен плоским), 2 - левозакрученная спираль, 3 - центры протомеров.

физического смысла. Характер контактов между протомерами имеет, как будет видно ниже, важное значение при обсуждении механизма полимеризации актина, что делает вопрос о выборе между моделями еще более острым. В модели с "параллельной" ориентацией субъединиц диаметр филамента должен составлять 6-8 нм, что совпадает с традиционно цитируемой в литературе величиной, определенной на негативно контрастированных образцах (Hanson, Lowy, 1963 ). В модели с "перпендикулярной" ориентацией диаметр филамента значительно больше - по крайней мере 9,5 нм. Однако обычное определение диаметра филаментов с помощью измерения микрофотографий негативно контрастированных образцов не является корректным, поскольку кон-трастер может "замазывать" истинные края филаментов. Корректное определение истинного внешнего диаметра филамента могло бы разрешить спор между моделями, но до настоящего времени такие определения проводились лишь различными косвенными методами, причем были получены данные как в пользу "толстых", так и в пользу "тонких" филаментов (Heuser,Kirschner,i980;Powier,Aebi, 1983 ) Следует, однако, заметить, что некоторые данные рентгеноструктурного анализа мышц лучше объясняются с помощью модели "толстого" (9,5 шл) актинового филамента (Egelman,Padron,i984 ) Модель с перпендикулярной ориентацией хорошо объясняет гибкость филаментов (ясно, что структура с меньшим числом контактов между субъединицами должна быть более гибкой) и некоторые особенности организации пучков филаментов (см. обзор DeRosier, Tilney, 1984 ) В целом модели с перпендикулярной ориентацией в настоящее время, по-видимому, следует отдать предпочтение.

Данные оптической дифракции электронномикроскопических изображений свидетельствуют о том, что актиновый филамент обла-

дает свойством полярности, т.е. его концы структурно неэквивалентны ( Wakabayashi et ai.,1975 ) Иными словами, филамент тлеет направление (например, обозначив концы как "а" и "в", можно определить направление филамента как направление от "а" к "в"). Это обстоятельство, как будет видно ниже, имеет очень важное значение для полимеризации актина. Направленность актиновых филаментов легко выявляется при декорировании их тяжелым меромиозином или фрагментом миозина Sj ( Moore et ai., 1975 ).

Что касается структуры самих актиновых протомеров, то она в филагленте почти такая же, как и у глобулярного актина ( Murphy et ai.,1972 ): F-актин содержит 29$ ot-спирали и 23$ -структуры, a G-актин, как рее упоминалось - 26$ о(-спирали и 26$ -структуры. Увеличение поглощения при 220-237 нм при полимеризации актина отражает, вероятно, изменение окружения ацильных боковых группировок аминокислот ( Higashi,Ooaawa, 1965 ).

Кроме одного центра высокоаффинного связывания двухвалентного катиона (К_а = ЮМ~ ) протомер актина содержит еще порядка пяти центров более слабого связывания двухвалентных катионов (1С, = 5-6 Юг11Г¹)( Strzelecka-Golaszewska et al.,I978). АКТИН полшеризуется, если порядка четырех из этих центров заняты ( Barany et ai.,1962). Обмен катиона, связанного в центре прочного связывания, в F-актине происходит значительно медленнее, чем в G-актине ( Kasai,Oosawa, 1969 ). F-актин содержит I моль АДФ на моль субъединиц актина ( Kasai,Oosawa, 1969 ), поскольку АТФ при полимеризации гидролизуется. Обмен нуклеотида в F-актине ТШСЖе ПРОИСХОДИТ намНОГО Медленнее, ЧЄМ В G-аКТИНе ( Murphy, 1971; Kasai,Oosawa, 1963 ).

4. ПОЖЖїЗіЩШ АКТИНА

4.1. Значение полимеризации и общая характеристика "реакции Полимеризация актина является биологически важным процессом, поскольку приводит к образованию актиновых микрофиламентов, составляющих часть скелета и двигательного аппарата любой эукариотп-ческой клетки. Кроме того, полимеризация актина представляет интерес просто как пример самосборки биологических структур из макромолекул. Особый интерес к полимеризации актина возник, когда началось интенсивное изучение цитоскелета и подвижности немышечных клеток. Дело в том, что в немышечных клетках постоянно наблюдаются перестройки актинового цитоскелета, которые включают, по-видимому, процессы полимеризации и деполимеризации актина ( подробнее см. раздел 5.4 настоящего обзора). Полагают, что полимеризация и деполимеризация актина в немышечных клетках является способом не только образования и распада, но и функционирования цито-скелетных структур.

Актин существует в мономерной форме при низкой концентрации, низкой температуре, низкой ионной силе, щелочном рН. При повышении концентрации Ы31 или Касі до 50-100 мМ или MgCi₂ до 0,5--2 мМ происходит полимеризация. Актины из разных источников(мышечные и немышечные)почти не различаются по способности к полимеризации ( Gordon et al.,I977 ).

При полимеризации актина АТФ, связанный с мономером, гидро-лизуется. Образовавшийся АДФ остается связанным с F-актином, а неорганический фосфат выделяется в раствор. Однако гидролиз АТФ не является обязательным событием для полимеризации: g-актин со связанным АДФ или негидролизуемым аналогом АТФ также может поли-меризоваться, хотя и медленнее, чем g-актин со связанным АТФ

( Cooke, 1975; Mannherz et al., 1975 ).

За образованием F-актина можно следить по увеличению вязкости, светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, поглощения при 232 нм, путем прямого наблюдения филаментов в электронный микроскоп, по уменьшению количества неседиментирующего белка и увеличению количества белка, осаждаемого при центрифугировании, по уменьшению способности ингибировать ДНКазу I, по сорбции на нитроцеллюлозные фильтры и по увеличению интенсивности флуоресценции меток, привязанных к лизину 373 или цистеину 374 (см. обзор Cooper,Pollard,1982 ) .

Изучение полимеризации показало, что она является сложной высококооперативной реакцией, в которой можно выделить несколько стадий.

4.2. Стадии полимеризации актина Для объяснения кинетики полимеризации Оозава и Казай в 1962г. ПреДЛОЯШШ модель нуклеаПИИ-ЭЛОНГаЦИИ ( Oosawa,Kasai, 1962 )

Согласно этой модели в полимеризации актина имеются две стадии с различными кинетическими параметрами: стадия образования коротких олигомеров из мономеров (нуклеация) и стадия достройки олиго-меров до длинных филаментов (элонгация). То, что законы нуклеащш и элонгации должны быть различными, представляется естественным, если рассматривать структуру актинового филамента в рамках традиционной двухтяжевой модели ( модели с параллельной ориентацией субъединиц). Действительно, по этой модели, при образовании, например, димера актина, каждый -.вступающий в реакцию протомер может образовать связи лишь с однім соседом, в то время как при присоединении протомера к концу филамента (или олигомера) образуются связи с двумя соседями. Реакции, различающиеся по числу образую-

щихся в них связей, должны иметь и различные константы скорости и равновесия. По другой модели организации филаментов - модели с "перпендикулярной" ориентацией субъединиц - число устанавливающихся контактов при образовании дшлера и при ассоциации мономера с концом филамента одинаково и для объяснения сложной кинетики полимеризации следует, по-видимому, сделать предположение о разно-качественности этих контактов.

При исследовании кинетики полимеризации актина методом двойного лучепреломления в потоке было обнаружено ( Kasai et al., Ї962), что угол экстишщии в начале реакции полимеризации падает значительно быстрее, чем растет величина двойного лучепреломления. Это означало, что удлинение отдельных филаментов (элонгация) происходит быстрее, чем увеличение весовой концентрации полимера. Был сделан вывод, что общая скорость реаіщии полимеризации определяется не скоростью удлинения филаментов (элонгации), а скоростью образования новых филаментов (или олигомеров, способных достраиваться до филаментов), т.е. скоростью нуклеации. Иными словами, нуклеация является лимитирующей стадией полимеризации. Предполагается, что до некоторого критического размера олигомера (размера минимальной стабильной- затравки) скорость распада олигомеров при реальных концентрациях актина значительно выше, чем скорость их образования и скорость ассоциации с ними следующих мономеров. Поэтому коротких олигомеров образуется очень мало. Однако начиная с размера минимальной стабильной .. затравки скорость ассоциации с затравкой следующего мономера становится выше, чем скорость распада затравки. При дальнейшем увеличении размера олигомера (и фи-ламента) скорость ассоциации мономера остается высокой и уже не зависит от длины олигомера (филамента). Таким образом, неболь-

шое количество затравок, раз образовавшись, сравнительно быстро достраивается до длинных филаментов. При этом из мономера образуются новые затравки, благодаря чему число растущих филаментов в ходе реакции постепенно увеличивается.

Математически полимеризация актина по такому механизму может быть описана следующим образом. Допустим, что короткие олигомеры находятся в состоянии равновесия с мономером. Тогда для концентрации олигомера на один протомер меньшего, чем минимальная стабильная затравка, a^__i , можно записать

где К - константа равновесия, А - концентрация мономера. Олыгомер размером n-i может с константой скорости к присоединить следующий мономер. После этого он становится минимальной стабильной затравкой и уже не распадается, а дает начало новому филаменту. Поэтому скорость увеличения численной концентрации филаментов (N) будет составлять:

X^v (і)

где k_n -кажущаяся константа скорости нуклеации.

Каждый филамент может обратимо присоединять мономер с константами скорости к₊ и к_ для реакции ассоциации и диссоциации соответственно. Скорость увеличения весовой концентрации полимера, Р , при численной концентрации филаментов N будет составлять

||=k₊NA-k_N=k₊N(A-^:) (2)

Описанная модель, возможно, является упрощенном, поскольку в действительности меззду нуклеациеіі и элонгацией может и не быть резкой границы и сродство мономера к олигомеру может постепенно увеличиваться по мере увеличения размера олигомера.

Тем не менее модель позволяет объяснить некоторые существенные особенности процесса полимеризации актина. При определениях всеми имеющимися методами в полимеризации актина обнаруживается лаг-период. Кривые роста концентрации полимера во времени имеют s-образную форму, т.е. наблюдается сначала увеличение, а затем уменьшение скорости полимеризации. Наличие лаг-периода и постепенное увеличение скорости полимеризации легко объясняются с точки зрения модели нуклеации-элонгации, поскольку согласно этой модели скорость полимеризации определяется числом растущих филаментов, а это число постепенно увеличивается в ходе нуклеапии. При добавлении затравок для полимеризации - например, фрагментов F-актина, полученных обработкой ультразвуком, лаг-период в полимеризации исчезает ( Kasai et ai.,i962a), что свидетельствует о том, что он действительно обусловлен нуклеацией.

В конце реакции скорость полимеризации падает вследствие уменьшения концентрации свободного мономера. В конце концов концентрация полимера перестает увеличиваться и устанавливается стационарное состояние. Показано, что концентрация мономерного актина в стационарном состоянии, называемая критической концентрацией, не зависит от общей концентрации актина и всегда равна концентрации, необходимой для начала полимеризации в данных условиях (Kasai et al.,I962a;Oosawa et al., 1971 ). Модель нуклеации-ЭЛОН-гации позволяет объяснить и этот факт. Действительно, согласно этой модели к изменению концентрации мономера и полимера может

приводить лишь реакция элонгации. Нуклеация в отсутствие элонгации практически не меняет концентрацию мономера, поскольку затравок образуется мало и они быстро распадаются. Поэтому условие стационарности, т.е. неизменности концентраций полимера и мономера, означает, что скорость элонгации равна нулю. В этом случае, как следует из уравнения (2), концентрация мономера -

^А~ ⁼ Ч т.е. не зависит от концентрации полшлера, и, следовательно, общей

концентрации актина. Из уравнения (2) следует также, что при А < к^ скорость элонгации отрицательна, и полимера не образуется. Напротив, при А > А_ю полимеризация возможна, т.к. скорость элонгации положительна. Таким образом, концентрация мономера в стационарном состоянии (критическая концентрация) равна минимальной концентрации актина, которая необходшла для полимеризации.

Как видно из вышеизложенного, важные особенности полимеризации актина объясняются с помощью модели, постулирующей существование двух различных реакций - нуклеации и элонгации. Исследования последних лет показали, что, по крайней мере в некоторых условиях, существенную роль в полимеризации актина играют и другие реакции, а іменно, активация, т.е. мономолекулярная реакция, в результате которой мономеры становятся компетентными к полимеризации, а также фрагментация филаментов и, возможно, воссоединение ажяаментов концами.

В макроскопическмо образце актина все названные реакции могут происходить одновременно. Большая часть методов изучения полимеризации позволяет следить лишь за общей скоростью образования полшлера, а эта скорость зависит от скоростей протекания всех

стадий полимеризации - активации, нуклеации, элонгации и фрагментации. Этим обусловлены трудности изучения отдельных стадий полимеризации. Только стадию элонгации можно экспериментально отделить от других стадий. Существует и метод определения абсолютного значения скорости элонгации отдельных филаментов - электронная микроскопия, Методов определения скорости других стадий не разработано и об их кинетических параметрах судят по косвенным данным.

Далее будут более подробно рассмотрены отдельные реакции полимеризации актина, а также события, происходящие в состоянии равновесия.

I. Активация мономера. При добавлении KCI к актину, находящемуся в концентрации ниже критической, происходят изменения спектра поглощения (Rouyarens, Travers, 1981 ) и изменения чувствительности к протеолизу ( Rich, Estes, 1976 ). Полагают, что эти изменения отражают переход G-актина в особое активированное состояние, компетентное к полімеризации. На то, что активация действительно является необходимой стадией в полимеризации актина, указывают следующие данные. Обнаружено, что концентрация активированной формы актина, определяемая спектрофотометрически, и критическая концентрация актина одинаковым образом зависят от концентрации КСІ (Rouyarens, Travers, 1981 ). ЭТОТ факт МОЖЄТ быть объяснен тем, что в полимеризацию вступает лишь активированная форма актина, причем критическая концентрация активированной формы не зависит от концентрации KCI, а критическая концентрация суммарного G -актина становится зависимой от концентрации ИЗІ благодаря тому, что от концентрации KCI зависит концентрация активированной формы.

Купер и Поллард, моделируя кинетику полимеризации актина с

помощью компьютера, обнаружили, что введение в программу мономолекулярной реакции активации существенно улучшает совпадение теоретических и экспериментальных кинетик полимеризации в случае, если полимеризация G -актина инициируется добавлением ионов Mg ⁺. Предположение о лимитирущей скорость мономолекулярной стадии активации помогало также объяснить наблюдавшийся в этой работе низкий (1-1,5) порядок зависимости продолжительности лаг-периода от

концентрации актина ( Cooper et ai.,1983). При полимеризации,

2+

инициируемои ионагли Са _{} во} введении стадии активации не было

необходимости, однаїю из кинетических данных нельзя было заключить, отсутствует ли активация в этом случае или просто является слишком быстрой по сравнению с нуклеацией и потому не обнаруживается. Кинетическими параметрами активации, как мономолекулярной реакции, являются константы скорости прямой и обратной реакции. Б работе Купера и Полларда сделана попытка оценить величины констант активации методом математического моделирования полимеризации ( Cooper et ai.,1983, однако полученные для двух препаратов актина значения констант различались почти на два порядка. Зто свидетельствует, по-видимому, о ненадежности использованного метода оценки.

2. Нуклеация. Как видно из уравнения (I), основными параметрами нуклеации являются число мономеров з минимальной стабильной затравке, n , и константа скорости, k_n . В случае, если минимальная затравка больше дшлера, нуклеация сама является многостадийной реакцией, и поэтому ее полное описание дожгло включать такие определение констант скорости прямых и обратных, реакций образования и распада всех олигомеров до размера затравки включительно. Определение этих параметров довольно сложно, поскольку,

как уже отмечалось, не существует методов гіршого определения скорости нуклеации. Имеется несколько методов приближенного определения n , основанных на том, что при рассмотрении только начальной кинетики полимеризации возможны допущения, упрощающие обработку экспериментальных данных.

Кроме того, для определения п может быть использовано моделирование реакции полимеризации с учетом всех ее стадий при помощи компьютера. Несколько групп исследователей определяли п этими способами, регистрируя полимеризацию актина по возрастанию ВЯЗКОСТИ ( Kasai et al.,I962a), по светорассеянию (Wegner,Engel,

1975 ), по поглощению при 237 нм (Nishida,Sakai, 1983 ), по увеличению флуоресценции привязанных к актину меток ( Cooper et al.,I983; Tobacman,Korn, 1983 ). В ЭТИХ работах были получены значения п 2-3 для полимеризации в присутствии ионов Mg²⁺ и 3 - 4 - для полимеризации в присутствии ионов Са .

Абсолютные значения константы скорости нуклеации не определялись. В работе ( Tobacman, Кот, 1983 ) показано, что скорости нуклеации в разных ионных условиях различаются чрезвычайно сильно (в тысячи раз); при этом в присутствии ионов Mg²⁺ нукле-ация происходит быстрее, чем в присутствии ионов Са или в присутствии KCI.

3. Элонгация и перемещение протомеров вдоль шиламента в состоянии равновесия. Элонгация описывается уравнением (2); ее параметрами являются, таким образом, константы скорости прямой и обратной реакции, к₊ и k_ . Стадию элонгации мошю экспериментально отделить от других стадий полимеризации актина путем исследования роста актиновых филаментов на каких-либо затравках, добавленных к раствору G -актина. Однако концентрацию затравок трудно

определить и, кроме того, она может меняться в ходе реакции вследствие нуклеации или фрагментации. Поэтому по суммарной скорости образования полимера на затравках невозможно определить константы элонгации. Эти константы удалось определить с помощью электронной микроскопии, которая позволяет измерить скорость элонгации отдельного филамента. Электронная микроскопия дает возможность также определять отдельно скорости удлинения разных концов филамента, что очень важно, т.к. позволило обнаружить полярность элонгации. Для электронномикроскопических исследовании элонгации необходимы затравки, морфологически отличающиеся от выросших на них филаментов. В качестве таких затравок сначала использовались фрагменты актино-вых филаментов, декорированные тяжелым меромиозином или фрагментом МИОЗИна Sj ( Woоdrum et al.,I975; Kondo, Ishiwata, 1976 ). Фрагменты шюзина при декорировании располагаются под остршя углом к оси актинового филамента, так что негативно контрастированные комплексы актина с фрагментами миозина имеют вид, который можно передать сравнениями с зазубренным наконечником стрелы, с "елочкой" или с рыбьим позвоночником. Соответственно, у этих комплексов имеются "острый" и "тупой" концы. Таким образом, при декорировании фрагментами шюзина, как уже упоминалось, выявляется полярность актиновых филаментов. В дальнейшем определениями "острый" и "тупой" мы будем пользоваться для обозначения декорируемых соответствующим образом концов актинового филамента, независимо от того, идентифицированы ли эти концы в рассматриваемом случае методом декорирования, или каким-либо иным способом (вводимые русские обозначения эквивалентны широко используемым в литературе английским терминала "pointed" И "barbed" ).

Хотя декорирование тяжелым меромиозином позволяло получать

морфологически идентифицируетее затравки с различающимися конца-ми, у этого метода в его первоначальном варианте был важный недостаток, обусловленный свойством комплексов актина с фрагментами миозина диссоциировать в присутствии АТФ. Элонгацию на этих затравках необходимо было проводить в отсутствие АТФ. В дальнейшем указанного неудобства удалось избежать двумя способами. Во-первых, стали цршленять мягкую фиксацию декорированных фрагментов глутаровым альдегидом, что делало их устойчивыми к АТФ ( Cooper, Pollard, 1982 ). Во-вторых, стали использовать другие затравки, стабильные в присутствии АТФ, а именно - естественные пучки микрофиламентов из двух объектов, характеризующиеся параллельной ориентацией филаментов. Пучки микрофиламентов, кроме стабильности, обладали еще и тем достоинством, что на калдом пучке наблюдался рост сразу многих филаментов. Это облегчало сбор данных и увеличивало их статистическую достоверность. Сначала использовали пучки мшфофиламентов из микроворсинок кишечного эпителия курицы (Pollard, Mooseker, 1981 ). Недостатками этого объекта были нестабиль-ность в присутствии ионов Са , а также то, что концы пучков из микроворсинок неразличимы - для их идентификации необходимо было проводить декорирование фрагментами миозина.

Недавно Бондер И др. ( Bonder,Mooseker, 1983 ) НШПЛИ практически идеальную затравку для электронномикроскопических исследований элонгации - пучок актиновых филаментов из акросомального отростка мечехвоста Limuius . Этот пучок отличается высокой стабильностью и, кроме того, имеет морфологически различающиеся концы - конец пучка со свободными "тупыми" концами филаментов более тонкий.

Рассмотрим теперь результаты исследования элонгации на за-

_{- зо -}

травках. Прежде всего отметим, что скорость удлинения филаментов при постоянной концентрации мономера оказалась постоянной во времени и НЄ зависела ОТ ДЛИНЫ филамента ( Pollard, Mooseker, 1981). Это означает, что филаменты удлиняются путем добавления мономеров только на концах. Если бы мономеры могли встраиваться в середину филамента, скорость элонгации при увеличении длины филамента должна была бы увеличиваться. Предположение о том, что мономеры добавляются к филаментам только на концах в действительности было сделано в неявном виде при написании уравнения (2). Исследование элонгации подтвердило, таким образом, справедливость этого предположения.

Было показано, что элонгация происходит на обоих концах ак-тинового филамента, но с различной скоростью - на "тупом" конце В 4-7 раз быстрее, чем на "остром" ( Wodrum et al.,I975;Pollard, Mooseker,i98i;Cooper,1983). По зависимости скорости элонгации от концентрации мономера были определены константы скорости прямой

и обратной реакции элонгации для каждого из концов филамента.

—I -I Для "тупого" конца были получены значения К₊ ^ 6-Ю мкїл с

-ї- -т*

иК_~ 2-6 с , а для "острого" конца - значения К₊~1-2 мкгл^_1с~ И К_~1-2 с"¹ (Pollard,Mooseker,I98I;Bonder et а1.І983;СоорегІ983)-

При этом К практически в пределах ошибки измерений не зависели

2+

от ионных условий, а К_ в присутствии КСІ или КСІ и Са были

больше, чем в присутствии KGI и Mg²⁺ . Полученные значения констант означают, что при концентрации мономера 10 мкМ (0,42 мг/мл) каждый филамент присоединяет в секунду около сотни мономеров, причем большую часть - на "тупом" конце. Поскольку среднее количество протомеров в филаменте составляет примерно 1000 ( Kawamu-ra, Maruyama, 1970 )₉ время роста каждого филамента должно сое-

- ЗІ -

тавлять ^ 10 с. Однако в действительности полимеризация актина обычно занимает значительно больше времени (десятки минут). Это еще раз показывает, что общая скорость полимеризации определяется не скоростью роста отдельных филаментов, а скоростью увеличения числа филаментов.

Т'*

Как было показано выше, отношение -g- равняется критичес-

+ кой концентрации полимеризации актина. Поэтому, зная константы элонгации для каждого из концов филамента, можно рассчитать критические концентрации отдельно для каждого из концов. Такие расчеты, однако, являются весьма неточными, т.к. ошибки в определении констант элонгации (особенно констант диссоциации) очень велики. Поэтому наряду с определением по константам элонгации были проведены также прямые определения критических концентраций полимеризации актина на кшкдом из концов филамента как минимальных концентрации, при которых еще возможен рост филамента на данном конце. Для измерения роста на каждом из концов при этом пользовались электронной микроскопией, а также определением полимеризации флуорес- . цеитным методом в макроскопическом образце с применением белков,

СПеЦИфИЧеСКИ бЛОКИруЮЩЕХ "ТУПОЙ" КОНеЦ филамента ( Bonder et al.,

1983; Wegner, isenberg, 1983 ). Оказалось, что если полимеризация g-актина, содержащего связанный АТФ, проводится в присут-

2+

ствии ионов Mg , то критические концентрации для двух концов отличаются, по данным разных авторов, в 5-12 раз ( для"острого" конца были получены значения критической концентрации 0,5-1,2 мкМ, а для "тупого" - 0,1-0,2 мкМ). Б отсутствие ионов Mg²⁺ критические концентрации для двух концов примерно совпадали. Ясно, что в случае, когда критические концентрации для разных кондов филамента различаются, удлинение филаментов должно происходить до тех

пор, пока концентрация мономера не достигнет такого промежуточного между двумя критическими концентрациями значения, что процесс сборки на "тупом" конце будет уравновешен разборкой на "остром". Легко показать, что эта концентрация мономера ("результирующая" критическая концентрация) составляет

^к-о ^{+ К}-т
А«р =

^л+о ^{+ л}+т где К₊ и К__т - константы сборки и разборки на "тупом" конце, а К₊₀ И'К_₀ - константы сборки и разборки на " остром" конце. После достижения мономером концентрации А & общие концентрации мономера и полімера меняться не будут, однако процессы сборки на "тупых" концах шиламентов и "разборки" на "острых" долины продолжаться и, следовательно, субъединицы актина должны постоянно перемещаться вдоль гаиламента "входя" с "тупого" и "выходя" на "остром" конце ( Wegner, 1976 ). Таком процесс в англоязычной научной литературе получил название treadmiiiing (от treadmill-устройство, приводішое в движение лошадью, ходящей по кругу). Как показывают элементарные термодинамические соображения для тред-миллинга абсолютно необходим гидролиз АТФ. Действительно, реакция тредмиллинга без гидролиза АТФ представляла бы собой реакцию, продукты которой ничем не отличаются от исходных веществ и, следовательно, в ходе которой не происходит изменения свободной энергии системы. Такая реакция должна с одинаковой вероятностью протекать как в прямом, так и в обратном направлении и, следовательно, не может приводить к направленному перемещению субъединиц вдоль филамента. Отсюда ясно, что критические концентрации на двух концах йаламента могут различаться лишь для мономера со связанным АТФ, но должны быть одинаковыми для мономеров со

связанным AM, хотя скорости ассоциации таких мономеров на разных концах филамента могут быть различными. В замкнутой системе, содержащей полимерный и мономерный актин, тредмиллинг будет происходить не бесконечно ( иначе такая система была бы "вечным двигателем") , а лишь пока не будет гидролизован весь АТФ.

Заманчиво думать, что тредмиллинг может играть роль в явлениях клеточной подвижности. В принципе можно представить себе два типа устройств, использующих явление тредмиллинга для производства механической работы. Если каким-то образом закрепить в пространстве отдельные субъединицы актинового филамента, то тредмиллинг будет приводить к перемещению филамента в целом без перемещения его субъединиц. В принципе при таком перемещении могла бы совершаться полезная работа, например, конец филамента мог бы толкать транспортируемую клеточную органеллу. Если, напротив, зафиксировать концы филамента, то тредмиллинг будет приводить к перемещению субъединиц без перемещения филамента в целом. Вместе с субъединицами, как на конвейере или эскалаторе, также в принципе могли бы транспортироваться полезные грузы. Из факта различия критических концентраций актина на разных концах филамента с необходимостью следует, что тредмиллинг должен происходить. Однако вопрос состоит в том, достаточно ли велика скорость тредапшлинга в реальных условиях. Для определения этой скорости проводились измерения кинетики обмена свободного мономера с субъединицами ПОЛИМера В СОСТОЯНИИ раВНОВеСИЯ (Wegner,Neuhaus,I98I ). Выяснилось, что в отсутствие двухвалентных катионов скорость обмена мономера с полимером чрезвычайно мала. В присутствии Са ⁺ или Mg²⁺ обмен происходит: с заметной скоростью, однако, по мнению некоторых авторов ( Brenner, Korn, 1983 ) кинетика обмена

лучше согласуется с предположением о том, что он происходит не путем тредшшлинга, а путем полимеризации и деполимеризации на обоих концах филамента. Вероятно, лишь незначительная часть про-томеров актина, ассоциирующих с тупым концом филамента в стационарном состоянии, продвигается вглубь филамента, а большая часть диссоциирует на этом же конце. Скорость тредмиллинга оценивали также методом электронной микроскопии по скорости разборки фила-ментов с "острого" конца в стационарных условиях. Эта скорость оказалась очень маленькой ( сотые доли микрометра в час)( Coiu-ccio, Tilney, 1983 ). К этому можно еще добавить, что в клетке ассоциация мономеров с одним или даже с обоими концами актикового филамента может быть блокирована специфическими белками (см. шше), что делает тредмиллинг вообще невозможным. Таким образом, в настоящее время предположение о том, что тредмиллинг выполняет какую-то функцию в подвижности клеток, кажется маловероятным.

4. Фрагментация и ассоциация ожламентов. Актиновые филаменты представляют собой довольно хрупкие образования. Показано, что они ломаются, напрішер, при пропускании раствора р -актина через пастеровскую ПИПеТКу ( Wang, Taylor, I981 ). Фрагментация филамен-тов, по-видимому, может происходить и в отсутствие внешних механических воздействий. Один непрерывно растущий актиновый фила-мент при концентрации мономера 10 мкМ мог бы за 10 глин достичь длины ~ 150 шсм. Такой длинный филамент, вероятно, должен быть фрагментирован в результате броуновского движения. Однако такую "самопроизвольную" фрагментацию невозможно прягло обнаружить экспериментально, поскольку любой способ измерения длины филамен-тов (двойное лучепреломление, электронная микроскопия) связан с механическим воздействием на образец и, следовательно, нельзя

исключить, что фрагментация была результатом этого воздействия.

Тем не менее, поскольку фрагментация приводит к образованию новых шиламентов и должна, такім образом, влиять на кинетику полимеризации, она может быть обнаружена косвенным методом - путем исследования кинетики полимеризации. В работах ( wegner, Savko, 1982; Cooper et ai., 1983 ) показано, что введение стадии Фрагментации в модель полимеризации актина приводит к существенному улучшению совпадения теоретических и экспериментальных кынетик полимеризации. В частности, путем введения стадии фрагментации удалось смоделировать резкий излом кривой полимеризации в конце реакции, перед выходом на плато, который обычно наблюдается на реальных кривых. Вклад фрагментации в кинетику полимеризации больше при невысоких концентрациях актина и в присутствии ионов Са . Согласно оценке, приводимой в работе ( Wegner,Savko, 1982 ) в при-сутствии ионов Са в результате фрагментации монет быть образовано более половины всех образующихся в ходе полимеризации акти-новых шиламентов (остальные филаменты образуются за счет нуклеа-ции). Возможен и обратный фрагментации процесс - ассоциация фи-ламентов концами. Возможность ассоциации прямо показана методом электронной микроскопии (наблюдалось объединение декорированных и недекорированных фрагментов актиновых филаментов ( Kondo,ishi-wata,i976 ). Ассоциация филаментов может, по-видимому, играть существенную роль в ситуациях, когда имеется большое число коротких актиновых шиламентов, например, при восстановлении актина, фрагментированного ультразвуком ( Nakaoka,Kasai, 1969). Однако в процессе полимеризации фрагментация филаментов, по-видимому, преобладает на их ассоциацией. В принципе не исключена возможность, что актиновые филаменты постоянно претерпевают процесс самопроизвольной фрагментации с быстрой последующей ассоциацией,

так что обе реакции остаются практически без явных последствий и могут быть обнаружены лишь при блокировании одной из них, например, ассоциации, специфическими белками (см. ниже). Однако, как было отмечено в работе ( Bonder, Mooseker, 1983 ) следовало бы ожидать, что в местах самопроизвольных разрывов актиновых юи-ламентов будет происходить встраивание новых мономеров. В результате реакций фрагментации, присоединения мономера и ассоциации наблюдался бы рост филаментов в середине, а не только на концах. Скорость элонгации тогда должна была бы зависеть от длины фила-мента, чего на самом деле не наблюдается. Поэтому предположение о том, что актиновые филаменты постоянно "дышат", ломаясь и вновь ассоциируя, кажется маловероятным.

Таким образом, очищенный актин может претерпевать весьма разнообразные и сложные превращения: мономеры актина могут активироваться и ассоциировать в олигомеры, олигомеры - удлиняться до филаментов, филаменты - обменивать свои субъединицы на свободные мономеры, ломаться и объединяться между собой. Механизмы и кинетические параметры этих превращений еще недостаточно исследованы. В клетках, однако, актин существует не изолированно, а взаимодействует со множеством белков, которые влияют на его состояние и на ход реакций, в которые он вступает. Прежде чем перейти к описанию взаимодействия актина с этими белками, рассмотрим, как влияют на полимеризацию и состояние актина некоторые низкомолекулярные вещества, используемые для изучения актина и его роли в клеточной подвижности.

4.3. Влияние цитохалазинов и фаллоидина на полимеризацию

актина

Грибные метаболиты цитохалазины вызывают драматические нарушения клеточной морфологии и подвижности, а также ингибируют цитокинез, экзо- и эндоцитоз и агрегацию рецепторов клеточной поверхности ( см. обзор Tanenbaum, 1978 ). Кроме того, некоторые из них блокируют транспорт Сахаров в клетки, однако показано, что этот последний эффект никак не связан с нарушениями' клеточной подвижности ( Atlas, Lin, 1978 ). В опытах in ^vivo было показано, что цитохалазины нарушают систему актиновых Ш'Жрофиламентов в клетке. Тем не менее до недавнего времени не удавалось обнаружить никаких значительных эффектов цитохалазинов на актин in vitro и поэтому механизм действия этих веществ был совершенно непонятен. Механизм взаимодействия цитохалазинов с актином прояснился только тогда, когда начали исследовать влияние цитохалазинов отдельно на стадию элонгации. Было показано, что цитохалазины блокируют ассоциацию мономеров актина с "тупым", т.е. предпочтительным для полимеризации концом филамента (MacLean--Fietcher,Poiiar

Таким образом, можно было заключить, что блокирование ассоциации мономера с концом филамента обусловлено связыванием цитохалазина с этим концом.

Кроме блокирования элонгации на "тупом" конце филамента, цитохалазины вызывают еще несколько эффектов. Так, они увеличивают начальную скорость полимеризации актина, что, по-видимому,

обсуловлено увеличением в их присутствии числа растущих актиновых филаментов (Low, Dancker, 1976 ). Точно не известно, чем вызывается увеличение числа филаментов - тем, что цитохалазины увеличивают число затравок, т.е. стшлулируют нуклеацшо, тем, что они фрагментируют филаменты, либо тем, что, не обладая фрагменти-рующей активностью, они блокируют ассоциацию спонтаїшо фрагменти-ровавпшх филаментов. Увеличение числа филаментов в присутствии цитохалазинов приводит к тому, что даже при полном блокировании цитохалазинами элонгации на "тупом" конце филамента, общая скорость полшлеризации не уменьшается. Поэтому и не удавалось обнаружить значительных эффектов цитохалазинов на актин in vitro до тех пор, пока не стали исследовать стацию элонгации в чистом виде.

Ингибируя элонгацию филаментов на тупом конце, цитохалазины, естественно, повышают критическую концентрацию актина - она становится равной критической концентрации для "острого" конца. Таким образом, цитохалазины обладают некоторым деполимеризующим эффектом ( Brown,Spudich,1979 ). Однако если общая концентрация актина существенно выше критической концентрации для "острого" конца, добавление цитохалазинов должно приводить лишь к незначительному уменьшению концентрации F-актина.

Цитохалазины вызывают резкое уменьшение вязкости f-актина,

ИЗМеряеМОЙ В ВИСКОЗИМеТре С НИЗКИМ уСИЛИеМ СДВИГа (MacLean-FlatCher, Pollard,1980). Наиболее просто эффект уменьшения вязкости актина молено объяснить тем, что цитохалазины уменьшают среднюю длину актинговых филаментов. Уменьшение длины филаментов хорошо согласуется с увеличением их числа, которое, как уже упоминалось выше, обнаруживается по увеличеншо начальной скорости полимериза-

ции. Кроме того, уменьшение длины филаментов в присутствии цитохалазинов прямо обнаружено методом электронной микроскопии (Hart-Wig, Stossel, 1979 ). Однако некоторые aBTOpH(MacLean-Pletcher,

PoiiardJ980) полагают, что наблюдаемое в присутствии цитохалазинов уменьшение длины филаментов недостаточно, чтобы объяснить эффект уменьшения вязкости актина. По мнению этих авторов, вязкость раствора F-актина при низких усилиях сдвига определяется не только средней концентрацией полимера и средней длиной филаментов, но и некоторыми спещіфическими взаимодействиями между филамента-ми, которые могут нарушаться под действием цитохалазина. Поскольку цитохалазины связываются с концами филаментов, они, по мнению Пол-ларда и др., могут нарушать так называемые Т-образные контакты филаментов, т.е. контакты конца одного филамента с боковой стороной другого. Такое предположение выглядит несколько искусственным, однако имеющиеся данные не позволяют его отбросить. К сожалению, в настоящее время нет методов, которые позволяли бы обнаружить Т-образные контакты филаментов и оценить их вклад в вязкость -Р-актина.

Фаллоидин - бициклический пептидный токсин бледной поганки -

действует противоположным по отношению к цитохалазпнам образом

цитохалазины вызывают разрушение пучков актиновых филаментов

в клетках, фаллоидин, напротив, вызывает образование таких пучков в клетках печени ( в другие клетки он не проникает)( Wehiand et ai., 1977 ). in vitro фаллоидин понижает критическую концентрацию актина и стабилизирует Р -актин против деполимеризации kj, низкой ионной силой, против тепловой денатурации и протеоли-за (Wieland,i977;DeVries,Wieiand, 1978 ). Исследования полимеризации актина в присутствии фаллоидина показали, что

фаллоиднн не влияет на скорость ассоциации мономера с филаментом, но уїленьшает скорость диссоциации мономеров от филамента ( Estes et ai., 1981 ). Тем самым фаллоидин мало влияет на полимеризацию, но блокирует деполимеризацию актина. В саглое последнее время показано, что эффект ингибирования деполимеризации фаллоиди-ном имеет место главным образом на "остром" конце актинового фи-ламента (Coiuccio,Tiiney,i983). Получены также данные в пользу того, что фаллоидин способен увеличивать среднюю длину актиновых филаментов ( Belkin et ai.,1983 ). При добавлении к актину до полимеризации фаллоидин связывается затем с Р-актином в соотношении 1:1 с протомером актина ( Wieiand et ai., 1975 ).

При микроинъекции в клетки фаллоидин вызывает нарушения клеточной морфологии и блокирует подвижность клеток ( stockem, Weber, Wehiand, 1978 ). Как было видно выше, действие фаллоидина на актин in vitro можно считать противоположным действию питохалазинов - питохалазины блокируют элонгацию филаментов, фаллоидин - их разборку. Тем не менее и фаллоидин, и цитохалазины нарушают морфологию и подвижность немышечных клеток. Отсюда можно сделать вывод, что для нормального функционирования актина в немышечных клетках валены процессы полимеризации и деполимеризации актина, физиологическими регуляторами которых являются актин-связывающие белки. Эти белки будут рассмотрены в следующем разделе.

5, ВЗАИМОДШСТВУЮЩИЕ С АКТИНОМ БЕЯМ НЕМЫШЕНБЫХ КЛЕТОК По типу функциональной активности актин-связывающие белки

НеМЫШеЧНЫХ КЛетОК МОЖНО разделить На ТрИ ГРУППЫ (Craig,Pollard,

1982 ). Это белки, ингибируюшде полимеризацию актина; белки, образующие гели с у -актином; а также так называемые фрагментиру-ющие или кепирувщие белки, которые укорачивают актиноше филаменты. Все эти типы активностей впервые обнаружены и исследованы именно у белков немышечных клеток. Описанное деление белков до некоторой степени условно, поскольку имеются белки, обладающие активностями нескольких типов. Механизмы действия многих актин-связывающих белков еще недостаточно исследованы. Поэтому не исключена возможность, что белки, относимые теперь к одной и той же группе, окажутся различными по механизму действия и что обнаружатся белки с новыми типами активностей. Тем не менее описанная классификация очень удобна и рассматриваемые ниже отдельные белки будут сгруппированы таким образом.

5.1. Белки, взаимодействующие с G-актином и ингибируюнше

его полимеризацию Белки этого типа ингибируют полимеризацию актина благодаря тому, что образуют с мономером актина прочные комплексы, которые не могут включаться в состав полимера. Это приводит к уменьшению концентрации участвующего в полимеризации мономера и, следовательно, к уменьшению скорости полимеризации, особенно нуклеации, которая наиболее сильно зависит от концентрации мономера. При добавлении к полимеризованному актину, находящемуся в равновесии с мономером, эти белки вызывают деполимеризацию, поскольку кон-

центрация свободного мономера вследствие взаимодействия с белками становится ниже критической. Кроме того, не исключена возможность, что некоторые из описываемых здесь белков могут каким-то образом взаимодействовать с F-актином, ускоряя его деполимеризацию. Основные данные о белках этого типа приведены в табл. I. Профилин выделен в виде комплекса с актином (в соотношении 1:1) из селезенки, тимуса, мозга и тромбоцитов млекопитающих

( Carisson et al.,I977;Blikstad et al.,I980;Markey et al.,I98I).

Комплекс может быть диссоциирован 2 М мочевиной, что приводит к

Денатурации аКТИНа, НО Не ПрофиЛИНа ( Carisson et al., 1977)-

Диссоциация комплекса возможна также в присутствии 5 мМ ЭГТА в буфере для полимеризации актина; в этом случае актин полимеризу-

ЄТСЯ ( Kendrick-Jones et al.I978). ОчиЩЄНШЙ ПрофИЛИН ИЗ ТКанеЙ МЛеКОПИТаЮЩИХ Имеет МОЛекуЛЯрНЫЙ ВЄС 15 220 ( Kystrom et al.,I972 ).

Известна его аминокислотная последовательность ( KystrSm et ai., 1972 ).

Из Простейшего Acanthamoeba В свободном ВИДЄ ВНДЄЛЄН 6ЄЛ0К,

похожий по свойствам на профилин млекопитающих, но отличающийся от него по аминокислотному составу и молекулярному весу (всего

12 500)( Reihcstein, Korn, 1979 ). Из ТромбоЦИТОВ И ЩИТОВИДНОЙ

железы млекопитающих также возможно выделение свободного, не находящегося В комплексе С аКТИНОМ ПрофИЛИНа ( Grumet, Lin, 1980; Fattoum et al., 1981 ). Как ВЫДелеННЫЙ В СВОбОДНОМ ВИДЄ, ТЭК И

полученный из комплекса с актином, профилин способен уменьшать скорость полимеризации и количество образующегося F-актина при

СООТНОШеНИИ ПрофИЛИН:аКТИН 0,3-1:1 ( Carisson et al., I977;Reich-

stein,Korn, 1979). Константа диссоциации комплекса профшшна из

Acanthamoeba С аКТИНОМ составляет 5-Ю X 10^ (Reichstein,

Таблица I. Белки, взаимодействующие с G-актином и ингибиру-ющие его полшлеризацию.

Kom,i979 ). Расчеты с использованием этой величины и допущения,

ЧТО В КЛеТКах Acanthamoeba ИМЄЄТСЯ Двухкратный И30ЫТ0К ПрофИЛИ-

на по отношению к актину приводят к результату, что около трети актина в клетках должно быть не в полимерном состоянии вследствие

образования КбМПЛеКСа С ПрофИЛИНОМ. ПрофИЛИН ИЗ Acanthamoeba

стимулирует обмен связанного с актином АТФ и ингибирует АТФазу

МОНОМерНОГО аКТИНа ( Mockrin, Кот, 1980).

Еще более прочный, чем профшшн, комплекс (K_d= 2 X 10""%) с мономерным актином образует ДНКаза I - фермент секрета поджелудочной яелеЗЫ С МОЛекуЛЯрНЫМ ВеСОМ 31 КД ( Lazarides,Lindberg,

l974;Mannherz, 1980 ). Сродства ДНКазы I к G-актину оказывается достаточно даже для деполимеризации F-актина, стабилизированного взаимодействием с тропомиозином или субфрагментом I миозина

(Mannherz et al.,I975), НО НЄ фалЛОИДИНОМ (Schafer et al.,I975 )

He известно, деполимеризует ли ДНКаза I актин путем взаимодействия с протомерами в составе полимера или только сдвигает равновесие реакции деполимеризации путем связывания G-актина. Комплекс актина с ДНКазой I содержит I моль связанного АТФ, но скорость его обмена на свободный АТФ ниже, чем у G-актина в 20 раз (Hitchcock, 1980 ). Физиологическая роль взаимодействия актина с ДНКазой I неясна. Известно, однако, что ДНКаза I секретируется в

ПОДЖелудоЧНЫЙ СОК В ВИДЄ Комплекса С акТИНОМ ( Rohr,Mannherz,

1978 ). Внутриклеточные ДНКазы тканей крысы не взаимодействуют С аКТИНОМ ( Lacks, 1981 ).

Деполимеризацию актина способен вызывать также белок сыворотки, связывающий витамин D (молекулярный вес 52-56 кД)( van Baeien et aii980). Он образует прочный эквимолярный комплекс с G -актином и прочный тройной комплекс с актином и ДНКазой I.

Разборку актина вызывает и белок с молекулярным весом 19 кД из

МОЗГа ЦЫПЛеНКа ( Bamburg et al. ,І980).СВ0ЙСТВа ПОСЛЄДНИХ Двух бел-

ков детально не исследованы. Неизвестно, ускоряют ли они разборку F-актина, или только сдвигают равновесие между мономером и полимером.

5.2. Белки, сшивающие актиновые Филаменты между собой Белки этой группы могут связывать между собой актиновые фила-менты благодаря тому, что каждая молекула белка имеет по крайней мере два центра связывания с F-актином. Сшивание актиновых фила-ментов между собой приводит к увеличению вязкости растворов р-ак-тина. При увеличении концентрации белка выше некоторой критической происходит скачкообразный переход раствора F-актина в состояние геля, характеризующегося, в отличие от жидкости (или золя), жесткостью, т.е. способностью противостоять усилию сдвига. Для количественного анализа процесса образования актиновых гелей применяется теория Флори ( Fiory, 1953 ), разработанная для гелей, образующихся при химических реакциях полимеризации с разветвлением цепи. Согласно этой теории гель образуется в том случае, когда линейные молекулы полимера оказываются связанными сшивками в трехмерную сеть, непрерывную во всем объеме раствора полимера. Ясно, что необходимая для этого концентрация сшивки зависит от длины молекул полимера - чем короче молекулы, тем больше требуется сшивающего агента, чтобы связать их в непрерывную сеть. Показано, что выполняется соотношение

где Р_с - критическая точка гелеобразования, определяемая как отношение концентрации сшивки У₀ к концентрации мономера в составе полимера N₀ , а х^ - средневесовое число мономеров в полимере.

Отсюда видно, что гель-золь переходы могут осуществляться по крайней мере двумя способами: путем изменения концентрации или активности сшивающего агента, или путем изменения средневесовой длины молекул полимера.

Если концентрация сшивающего белка достаточно высока, чтобы сшить одни и те же филаменты много раз, то вместо гелей могут образоваться пучки филаментов.

Белки, сшивающие актиновые филаменты, по-видимому, участвуют в гель-золь переходах в цитоплазме живых клеток. Хотя важность гель-золь переходов для процессов клеточной подвижности понимали уже очень давно ( bewis, 1939;Frey-Wyssling,194$) ,лишь около десяти лет назад удалось осуществить эти превращения в бесклеточной системе - белковых экстрактах немышечных клеток. Выяснилось, что гели, образующиеся при нагревании в экстрактах немышечных клеток, состоят из актина и белков, сшивающих актиновые филаменты. В настоящее время выделено большое число таких белков (см. табл. 2). Подробное описание их всех заняло бы слишком много места, поэтому мы рассмотрим лишь некоторые из них.

Одним из первых подобных белков был очищен и охарактеризован так называемый актин-связывающий белок из макрофагов кролика ( Hartwig, Stossel, 1975, 1981 ). С ним очень сходен филамин ( waiiach et ai.1978) из гладких мышц желудка курицы. Актин-связывающий белок и филамин имеют молекулярные веса полипептидных цепей соответственно 270 и 250 кД ( Hartwig, Stossel, I98I;Shizuta

Таблица 2. Белки, сшивающие актиновые филаменты между собой

et аі.і97б); аминокислотные составы их очень сходны ( Shizuta et al.,1976; Wallach et ai.,1978 ), и ониперафесЕИО реагируют с антителами ( VJallach et ai.,1978). И актин-связывающий белок, и фи-

ЛаМИН В НаТИВНОМ СОСТОЯНИИ ЯВЛЯЮТСЯ ГОМОДИМерамИ ( Hartwig, stos-

sei,i98i;Shizuta, 1976 ). При электронной микроскопии субъедини-цы актин-связыващего белка и филамина выглядят как длинные гибкие стержни длиной 80 нм и толщиной 3 нм; субъединицы соединены друг с другом только на одном из концов и принимают разнообразные кон-формации ОТ ПОЛНОСТЬЮ ВЫТЯНУТОЙ ДО ПЛОТНО СВернуТОЙ ( Hartwig,Stos-

sei,i98i; Tyler et ai.,1980 ). При молярном соотношении с актином порядка 1:100 актин-связывающий белок вызывает образование геля, а в более высоких концентрациях - пучков филаментов. При этом удалось непосредственно наблюдать в электронный микроскоп филаменты актина, сшитые димерами актин-связыващего белка (Hartwig,stossei,i98i). Филамин по сравнению с актин-связывающим белком несколько менее эффективен как фактор гелеобразования ( Brotschi et al.I978).

Димеру актин-связывающего белка функционально аналогичен тетрамер спектрина - белка цитоскелета эритроцитов. Спектрин состоит из двух различных полипептидов с молекулярными весами 220 и 240 кД, которые отличаются иммунологически как друг от друга, так И ОТ филамина ( Fairbanks et al.,1971» Hiller,Weber, 1977 Kirkpatrick, 1978).

Гетеродимер спектрина представляет собой длинный (ПО нм) гибкий стержень, образованный двумя уложенными бок о бок и перевитыми пептидными цепями. Гетеродимеры могут ассоциировать концами, образуя тетрамер длиной 220 нм ( Ungewickeli, 1978 )_# Места связывания актина расположены на концах гетеродимеров,

противоположных по отношению к тем, которые ответственны за ассоциацию димеров в тетрамер ( Calvert et аі.,і985)« Димер спектрина связывается с р -актином, но не сшивает филаменты, тетрамер способен образовывать гели С актином in vitro ( Brenner,Korn, 1979 )

В последнее время во многих тканях обнаружены сходные со спектрином белки. Это фодрин, выделенный из мозга и других объектов и имеющий субъединицы с молекулярными весами 240 и 235 кД (bevine,V.^Tillard, 1981; Glenney et al. 1983, а также белок терминальной сети клеток кишечного эпителия, молекулярные веса субъединиц КОТОРОГО СОСТаВЛЯЮТ 240 И 260 КД ( Glenney et al., 1982а,b ).

Субъединицы с молекулярными весами 240 кД сходны у этих двух белков и спектрина, а другие субъединицы - различаются.

Все вышеописанные белки взаимодействуют с актином и в при-сутствии ионов Са . В то же время образование гелей в экстрак-тах немышечных клеток обычно ингибируется ионами Са . Это может осуществляться при участии кальций-зависимых регуляторов длины филаментов, которые будут рассмотрены в следующем разделе. Существуют однако и гелеобразующие белки, активность которых непосред-

2+ ственно регулируется ионами Са . К ним относятся немышечные

ot-актинины, представляющие собой гомодимеры с молекулярными весами субъеДИНИЦ ОКОЛО 100 КД ( Rosenberg et al.,I98I;Burridge

et ai.i98i). Обнаружен один белок, сочетающий в себе свойства кальций-чувствительного фактора гелеобразования и кальций-зависимого регулятора длины филаментов. Это виллин из микроворсинок кишечного эпителия, который будет более подробно описан в следующем разделе.

5.3. Белки, укорачивающие актиновые Филаменты

Белки этой группы проявляют активности нескольких типов, которые весьма сходны с активностями описанных ранее цитохалазинов. Эти белки уменьшают среднюю длину актиновых филаментов, увеличивают начальную скорость полимеризации актина и блокируют ассоциацию мономеров с одним из концов актиновых филаментов и ассоциацию филаментов между собой. За способность укорачивать филаменты (как бы разделять их на фрагменты) эти белки часто называют фрагменти-рующими, за способность блокировать элонгацию, образуя, по-видимому, что-то вроде затычки на одном из концов филамента их называют

КеПИруЮЩИМИ (ОТ аНГЛИЙСКОГО^псар" - ЗаТЫЧКа)(Craig,Pollard, 1982 )

В дальнейшем мы для краткости также будем пользоваться этими обозначениями.

Рассмотрим подробнее различные активности фрагментирующих белков и возможные связи между этими активностями. При добавлении до начала полимеризации актина фрагментирующие белки увеличивают начальную скорость полимеризации, что, по-видимому, обусловлено увеличением числа растущих актиновых филаментов. Как и в случае с цитохалазинами, неизвестно, чем именно вызвано увеличение числа филаментов: увеличением числа затравок вследствие их стабилизации, фрагментацией существующих филаментов, образовавшихся в начале реакции, или блокированием ассоциации спонтанно фрагменти-рующихся филаментов. Увеличение числа филаментов при неизменной общей концентрации актина должно привести к уменьшению средней длины филаментов. Сдвинутое в короткую сторону распределение длин филаментов поддерживается в состоянии равновесия, что может быть обусловлено либо блокированием ассоциации филаментов, либо постоянной фрагментацией, находящейся в равновесии с ассоциацией.

Таким образом, способность укорачивать филаменты связана со способностью ускорять полимеризацию, однако неизвестно, что является причиной, а что - следствием.

При добавлении фрагментирующих белков к полимеризованному актину также происходит уменьшение длин филаментов. И в этом слу-.чае имеется по крайней мере два объяснения эффекта. Фрагментирую-щие белки могут либо активно ломать филаменты, либо лишь блокировать ассоциацию филаментов, сломавшихся самопроизвольно или вследствие механического воздействия в процессе добавления фрагментирую-щего белка и перемешивания раствора. Уменьшение длины филаментов приводит к резкому уменьшению вязкости растворов р-актина, особенно ВЯЗКОСТИ, Измеряемой При НИЗКИХ УСИЛИЯХ СДВИГа (Macbean-Plet-

cher,1980а ). Укорачивание филаментов может приводить также к ин-гибированию образования актиновых гелей, поскольку концентрация сшивающего белка может быть выше критической для длинных филаментов, но оказаться ниже критической для укороченных (Yin et ai., 1980; Nunnally et al., 1981)

Увеличивая число филаментов и начальную скорость спонтанной полимеризации актина, фрагментирующие белки в то же время уменьшают скорость полимеризации на добавленных затравках. Для многих из этих белков методом электронной микроскопии показано, что они блокируют ассоциацию мономеров с одним из концов филамента. С другой стороны, известно, что фрагментирующие белки действуют (например, понижают вязкость F-актина) при субстехиометрических по отношению к протомеру актина концентрациях - порядка одной молекулы на несколько сотен протомеров или порядка одной молекулы на филамент. Все это заставляет предполагать, что фрагментирующие белки (они же кепирующие) связываются с одним из концов актиново-

го филамента, блокируя элонгацию на этом конце и ассоциацию фила-ментов концами. Для одного из кодирующих белков - виллина - прямо показано, что эффект блокирования элонгации обусловлен связыванием небольшого количества виллина с F-актином. Пучки актиновых филаментов из акросомальных отростков Limuius обрабатывали вил-лином, а затем отмывали несвязавшийся белок. После этого проводили полимеризацию актина на пучках. Элонгации филаментов на "тупом" конце не происходило, несмотря на то, что в смеси отсутствовал свободный виллин (Bonder, Mooseker, 1983 )

В принципе связыванием с концами актиновых филаментов могут быть объяснены все эффекты фрагментирующих белков - блокирование элонгации, а также увеличение числа и уменьшение длины филаментов вследствие блокирования ассоциации. Стабилизация затравок при полимеризации также может быть объяснена связыванием белков с концами затравок. Однако не исключена и возможность, что стабилизация затравок является независимым эффектом фрагментирующих белков, никак не связанным с эффектом кепирования филаментов. Кроме того, непонятно, обладают ли копирующие белки самостоятельной фрагмен-тирующей активностью в точном смысле этого слова, т.е. способны ли они ломать филаменты, взаимодействуя с "внутренними" протомерами актина, или они связываются только со свободными концами филаментов.

Из сказанного видно, что в вопросе о механизме действия белков рассматриваемой группы имеется много неясного. Кроме того, неизвестно, одинаковы ли механизмы действия всех белков этой группы. Как мы видели, можно представить себе различные взаимоотношения между многообразными активностями фрагментирующих белков. Возможно, что все типы этих взаимоотношений реализуются у различ-

ных белков группы.

Ниже будут рассмотрены отдельные фрагментирующие белки (см. табл. 3) и данные о механизмах их действия. Одним из первых фраг-ментируодих белков был описан гельзолин (молекулярный вес 91 кД) из легочных макрофагов кролика, названный так за его способность ингибировать в присутствии свободного Са²⁺ образование геля из актина и актин-связыващего белка ( Yin, stossei, 1979 ) Гельзолин имеет два одинаковых места связывания Са²⁺ с к = Ю~%

(Yin, stossei, 1980 ). В присутствии микромолярных концентраций

2+

Са гельзолин блокирует элонгацию филаментов на "тупом" конце,

ускоряет полимеризацию и уменьшает вязкость актина в состоянии равновесия ( Yin et ai,i98i). При добавлении гельзолина к поли-меризованному актину наблюдается падение вязкости до того же уровня, который достигается при полимеризации в присутствии гельзолина. Показано, что падение вязкости обусловлено укорачиванием филаментов. Определены средние длины филаментов в присутствии различных концентраций гельзолина и показано,что укорачивание филаментов при добавлении гельзолина происходит очень быстро - за десятки секунд (Yin et ai.,1980). Это можно рассматривать как свидетельство в пользу того, что гельзолин активно ломает фила-менты, хотя не исключена и возможность того, что он блокирует восстановление филаментов после ломки при перемешивании (в этом случае нужно предполагать, что такое восстановление происходит очень быстро). Гельзолин вызывает увеличение критической концентрации актина, что естественно, т.к. он блокирует конец филамен-та с более низкой критической концентрацией ( Yin et al.I98l). Антитела к гельзолину реагируют со многими тканями, а также с плазмой крови, что свидетельствует о том, что там имеются род-

Таблица S,

Белки, укорачивающие и кепирующие актиновые филаменты

Белок

Источник : Молекулярный : Литература : вес /кД/ :

ственные белки ( Yin et аі.і98і). Недавно опубликовано сообщение о том, что в клетках печени синтезируются две очень сходные между собой, но все же различающиеся формы гельзолина. Одна из них является внутриклеточной формой, а другая секретируется в кровь ( Yin et ai., 1984 ). Родственный гельзолину белок из плазмы крови был описан под названием бревин (молекулярный вес 90 кД). Бревин, так же как и гельзолин, блокирует элонгацию актина на тупом конце, ускоряет полимеризацию и укорачивает актиноше филамен-

ты ( Wilkins et ai., 1985 ). Однако, в отличие от гельзолина,

р. бревин укорачивает актиновые филаменты независимо от ионов Са .

Способность ускорять полимеризацию актина бревин, тем не менее,

проявляет лишь в присутствии ионов Са . Таким образом, эти две

аКТИВНОСТИ у бревина оказываются независимыми ( Harris, Weeds, 1983 ).

Сходный иммунологически и по пептидным картам с бревином и, вероятно, с гельзолином белок с молекулярным весом 90 кД выделен из тромбоцитов в виде прочного комплекса с актином. Этот комплекс стимулирует нуклеацию и понижает вязкость актина, причем оба эф-

2+

фекта усиливаются в присутствии Са , но имеются также и в отсутствие Са ( Markey et al.,1982 ). Другой группой исследователей из тромбоцитов выделен препарат, активным компонентом которого также, по-видимому, является белок с молекулярным весом 90 кД. Для этого препарата показано, что он блокирует элонгацию актина на "тупом" конце филамента ( Wang, Bryan, 1981 ) и конкурирует с цитохалазином за связывание с этим концом ( Grumet, bin

1980 ).

Из других фрагментирующих актин белков наиболее изучен вил-лин (молекулярный вес 95 кД). Виллин отличается иммунологически

и по пептидным картам от белков семейства гельзолина ( Yin et al. I98ia ). Как уже упоминалось,виллин является одним из основных компонентов микроворсинок клеток кишечного эпителия, В при-сутствии Са виллин кепирует "тупой" конец актиновых филаментов

И уменьшает ДЛИНУ фИЛамеНТОВ ( Glenney et al., 1983а). При ВЫСОКИХ

концентрациях виллина образуется комплекс, содержащий I молекулу виллина и 2 протомера актина (Glenney et аі.,і98іа). В отсутствие ионов Са виллин, как уже отмечалось в предыдущем разделе,

Проявляет аКТИВНОСТЬ белка, СШИВащеГО аКТИНОВЫе фИЛамеНТЫ (Glen
ney, VJeber, 1981 ).

Недавно были получены данные в пользу того, что виллин способен ломать актиновые филаменты, а не только блокировать их сращивание (Bonder,Mooseker, 1983 ). Исследовали действие виллина на актиновые филаменты, предварительно полимеризованные на акро-сомальных отростках спермиев bimulus . Добавление виллина приводило к быстрому укорачиванию филаментов на обоих концах отростка. При этом добавление буфера не влияло на число и длину филаментов, из чего можно заключить, что механическая фрагментация филаментов в условиях опыта была незначительна. Правда, нельзя исключить, что в отсутствие виллина филаменты быстро разрываются и вновь ассоциируют, а виллин лишь блокирует ассоциацию. Однако предположение о том, что в обычных условиях имеет место процесс быстрой фрагментации и ассоциации филаментов кажется маловероятным по причинам, которые были изложены в разделе, посвященном роли фрагментации в полимеризации актина. Виллин содержит 3 различных места

связывания Gar Л Hesterberg, Weber, 1983 ).

Имеются указания на то, что кепирующая и фрагментирующая актив-

НОСТИ ВИЛЛИНа Имеют различные ПОРОГИ активации Са^( Hesterberg,

Weber,1983; Bonder, Mooseker, 1983 ).

В отличие от гельзолина и вшшина, кепирующий белок, выделенный ИЗ Простейшего Acanthamoeba , В Концентрациях, реЗКО

понижающих вязкость актина, не вызывает, по данным электронной микроскопии, значительного изменения длины актиновых филаментов ( isenberg et ai.i980). Возможно, что понижение вязкости актина этим белком обусловлено небольшими изменениями длины филаментов, не определяемыми методами электронной микроскопии, или, как предполагают выделившие его авторы, ингибированием контактов между концами и боковыми сторонами филаментов. Препарат кепирующего

белка ИЗ Acanthamoeba СОСТОИТ ИЗ ПОЛИЛЄПТИДОВ, ИМЄЮЩИХ МОЛеку-

лярные веса 29 и 31 кД, а нативный молекулярный вес белка по данным гельфильтрации равен 160 кД. Белок из Acanthamoeba , как и

виллин и гельзолин, блокирует "тупой" конец филамента. Активность

р.

белка ИЗ Acanthamoeba НЄ ЗаВИСИТ ОТ ИОНОВ Са .

Целое семейство фрагментирующих и кепирующих белков обнаружено в миксомицете Physarum . Первым из этих белков выделен так называемый фрагмин ( Hasegawa et ai., 1980 ). Фрагмин имеет молекулярный вес 42 кД и при электрофорезе в присутствии ДЦС-Ка комигирует с актином. Однако он отличается от актина меньшей подвижностью при электрофорезе в присутствии мочевины и отсутствием пистеина в молекуле ( Hinssen, 1981 ). В присутствии микромолярных концентраций Са фрагмин укорачивает актиновые филаменты, ускоряет полимеризацию и кепирует быстрорастущий конец филаментов ( Hinssen, 1981а ). В высоких концентрациях фрагмин также деполимеризует актин благодаря тому, что он образует с актином прочный эквимолярный комплекс. Этот комплекс, как и описанный ранее комплекс из тромбоцитов, также является кепирующим

агентом. Однако способность фрагментировать актин у комплекса выражена слабее, чем у индивидуального фрагмина ( Hinssen, 1981а ).

Недавно из Physarum выделен другой кепирущий белок, состоящий из двух различных субъединиц ("а" и "в"), каждая из которых, как и актин и фрагмин, имеет молекулярный вес 42 кД ( Maru-ta et ai.,i985;Maruta,isenberg» 1985 ). Субъединица "а" обладает кепирующей активностью, а субъединица "в" может быть обратимо фосфорилирована. Если субъединица "в" фосфорилирована, гетери. родимер "а+в" проявляет Са -зависимую кепирующую активность;

если "в" дефосфорилирована, кепирующая активность гетеродимера

QjL.

становится независимой от ионов Са . Индивидуальная субъедини-

2+

ца "а" проявляет Са -зависимую кепирующую активность. Фрагмен-

тирующая активность белка "а+в" выражена слабее, чем у фрагмина.

Недавно появилось сообщение о том, что молекулы фрагмина и субъединицы кепирующего белка "а" и "в" родственны актину иммуно-логически и по пептидным картам. Таким образом, эти три белка представляют собой как бы минорные варианты актина, регулирующие полимеризацию основного варианта ( Maruta et ai., 1985а )

В настоящее время известен только один белок, кепирущий "острый" конец актиновых филаментов. Это выделенный из макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов акументин (от греческого аку-

МЄН - ОСТрие) (молекулярный ВЄС 65 ^)(Southwick,Hartv/ig,I982 .

Акументин является одним из основных белков макрофагов: его содержание СОСТаВЛЯеТ 6% ОТ ВСеГО белка КЛеТКИ ( Southwick et al.,

1982). Акументин обладает способностью понижать вязкость актина и стимулировать нуклеадию полимеризации, как и белки, взаимодействующие С "тупым" КОНЦОМ филамента ( Southwick et al.I98^.

Активность акументина не зависит от ионов Са , но ингибируется 0,3 М KCI. Как белок, блокирующий конец филамента с более высокой критической концентрацией, акументин должен, в отличие от белков, блокирующих "тупой" конец, понижать критическую концентрацию актина. Однако ожидаемое изменение критической концентрации очень мало и в действительности не было обнаружено методом вискозиметрии. Интересно отметить, что первоначально акументин был описан как ингибитор полимеризации актина (southwick,stossei, 1981) .

Недавно был описан укорачивающий актиновые филаменты белок, который, по-видимому, не кепирует концов актиновых филаментов, поскольку он не влияет на скорость элонгации на затравках. Этот белок, выделенный из ооцитов морской звезды и названный депактином ( Mabuchi, 1985 )(молекулярный вес 17 кД), деполимеризует актин, действуя в сравнительно высоких по отношению к актину концентрациях, и образует эквимолярныи комплекс с актином. Однако при добавлении к актину в процессе полимеризации в сравнительно невысоких концентрациях он увеличивает максимальную скорость полимеризации, не влияя на начальную скорость, и вызывает появление резкого излома на конечном участке кривых полимеризации. Такое изменение кинетики полимеризации свидетельствует о фрагментации актиновых филаментов ( vfegner,Savko, 1982.). Фрагментация под действием депактина была показана и с помощью электронной микроскопии. Авторы предполагают, что депактин взаимодействует с "внутренними" протомерами актина, и как бы вырывает их из филамента, образуя с ними комплекс и фрагментируя при этом филаменты. Таким образом, депактин, с одной стороны, по механизму действия близок к таким деполимеризующим актин белкам, как ДНКаза I, а с другой стороны, способность фрагментировать филаменты сближает его с кепирующими

белками.

5.4. Возможные биологические йункшш актин-связываюпшх белков

О конкретных функциях актин-связывающих белков в клетке известно еще очень мало. Лишь некоторые общие черты организации и функционирования актинового цитоскелета в немышечных клетках можно связать со свойствами и функциями определенных актин-связывающих белков.

Характерной особенностью немышечных клеток является лабильность системы актиновых микрофиламентов. Все изменения состояния клетки сопровождаются изменениями распределения актиновых цито-скелетных структур, исчезновением одних структур и появлением других. Так, при прикреплении и движении клеток образуются и исчезают содержащие актин складки ламеллы, фокальные контакты и пучки актиновых микрофиламентов ( Васильев, Гельфанд, 1981 ). В митозе вся система пучков микрофиламентов разрушается и образуется один кольцевой пучок в области перетяжки дробления. После разделения дочерних клеток в них восстанавливается интерфазная система

ПУЧКОВ МИКрофИЛамеНТОВ (Sanger, 1975jAubin et al.,1979). ОпуХОЛе-

вая трансформация клеток обычно сопровождается потерей большей части пучков МИКрофИЛамеНТОВ (Tucker et al.,I978; Boschek et al., 1981; Вернадский, 1984 ), что, вероятно, имеет важное значение в цепи событий, приводящих к экспрессии трансформированного фенотипа, в том числе таких особенностей опухолевых клеток, как способность к инвазии и метастазированию. Изменения организации цитоскелета происходят не только на уровне крупных актиновых структур, но и на уровне их строительных блоков. Инъецированный в клетки флуоресцентно меченый актин сравнительно быстро распределяется по всем цитоскелетным структурам. После обесцвечивания лучом лазера части светящегося пучка микрофиламентов флуоресценция в этой

области пучка полностью восстанавливается за несколько десятков минут ( Kreis^eigei^SchiessingeiyESSZ). Это означает, что за такое время происходит полная замена обесцвеченных протомеров актина на флуоресцирущие, пришедшие из других мест. Анализ кинетики восстановления флуоресценции в разных точках темного пятна показывает, что новые флуоресцирующие молекулы приходят не из соседних областей пучка, а из окружающего клеточного матрикса, где, по-видимому, имеется мономершй актин. Таким образом, за период, в течение которого пучок как целое не претерпевает существенных изменений, составляющие его филаменты подвергаются практически полному обновлению. В этом случае процессы деполимеризации и полимеризации идут как бы "вхолостую" на одном и том же месте. Вероятно, что перемещение цитоскелетных структур и замена одних структур другими также происходят путем сборки и разборки - только в этом случае сборка и разборка происходят в различных участках клетки.

О большей интенсивности процессов сборки и разборки актино-вого питоскелета говорит и тот факт, что в целых клетках цитохалазин В сравнительно быстро дезорганизует всю систему актиновых микрофиламентов. В то же время цитохалазин не нарушает цитоскелета клеточных моделей, из чего можно заключить, что сам по себе он не способен разрушать актиновые цитоскелетные структуры

( Schliwa, Van Blerkom, 1981 ). По-ВИДИМОМу, В ЖИВЫХ КЛеТКЭХ

цитохалазин ингибирует сборку актина, благодаря чему становится видимым процесс разборки, который в отсутствие цитохалазина уравновешивается сборкой.

В отдельных случаях сборка актина происходит в масштабах целой клетки, что приводит к заметному увеличению содержания

полимерного актина на клетку. Это происходит, например, при активации тромбоцитов (Markey,Persson,bindberg, 1981 ).

Таким образом, полимеризация и деполимеризация являются основными средствами, обеспечивающими лабильность актинового цито-скелета. Кроме того, процессы полимеризации могут непосредственно выполнять и двигательную функцию. Дринципиальная возможность совершения механической работы при полимеризации и деполимеризации актина показана термодинамическими расчетами (нііі,і98і; Hill,1982) По-видимому, полимеризация актина служит движущей силой образования различных клеточных выростов, цитоскелет которых образован акти-НОВЫМИ филаментами - МШфОВОрсинок (Begg,Rebhun,I979;Mooseker,Iilney, 1975 ), филоподий ( DeRosier, Edds, 1980 ), акросомальных отростков некоторых сперматозоидов ( Tilney, inoue, 1982 ).

Кроме полимеризации и деполимеризации актина, для динамики цитоскелета, очевидно, существенны процессы сборки актиновых фи-ламентов в надфиломентные структуры - пучки и сети. Рассмотрим, как все эти процессы в клетках могут регулироваться актин-свя-зывающими белками.

Для того, чтобы путем полимеризации в любом месте клетки могли образовываться цитоскелетные структуры, необходимо наличие пула мономерного растворимого актина. Однако концентрация свободного, способного непосредственно участвовать в полимеризации мономера в клетке не может постоянно поддерживаться на высоком уровне. Если эта концентрация превысит критическую для полимеризации концентрацию мономера (0,1-1 мкМ в физиологических ионных условиях), то произойдет полимеризация и концентрация мономера быстро упадет до уровня критической. В действительности же в немышечных клетках обнаружен растворимый, неполимерный актин в концентрациях, сущест-

ВЄННО Превышающих Критическую ДЛЯ ПОЛИМерИЗаЦТТИ ( Bray,Thomas, 1976;

Biikstad, 1978 ). Поддерживать пул такого актина помогают, по-видимому, белки типа профилина, образующие комплекс с мономерным актином и обнаруженные во многих объектах в концентрациях, сопоставимых с концентрацией самого актина ( Oarisson et ai. , 1977 ) Количество актина, находящегося в комплексе с профилином зависит от концентрации профилина, от константы диссоциации комплекса актина с профилином и от концентрации мономерного актина, которая в стационарных условиях равна критической концентрации для полимеризации. Изменяя эти три параметра, можно вызывать полимеризацию актина из комплекса с профилином, либо, наоборот, деполимеризацию актина и увеличение концентрации комплекса актина с профилином. О физиологической регуляции концентрации профилина и константы диссоциации его комплекса с актином ничего не известно. Критическая концентрация актина в принципе может меняться при изменении активности белков, кепирующих концы актиновых филаментов, от величины, равной критической концентрации для "тупого" конца фила-мента (при кепировании всех острых концов) до величины, равной критической концентрации для "острого" конца (при кепировании всех "тупых" концов). Диапазон этих изменений не очень велик, однако

Теоретические расчеты И ОПЫТЫ in vitro показывают ( Tobacman

et ai., 1985 ), что небольшие изменения критической концентрации актина в присутствии профилина могут приводить к значительным изменениям концентрации комплекса актина с профилином и, следовательно, количества полимера. Такая регуляция полимеризации актина обладает тем преимуществом, что она может быть локальной. Снятие кепов с "тупых" концов филаментов или кепирование "острых" концов филаментов в ограниченном участке клетки будет приводить к удли-

нению филаментов только в этом участке. В другом месте клетки в это же время может происходить разборка филаментов вследствие снятия кепов с "острых" концов или кепирования "тупых" концов. По этой схеме регуляции полимеризации концентрация свободного мономера все время остается в пределах между критическими концентрациями для "острого" и "тупого" концов и, следовательно, сборка филаментов должна происходить исключительно на "тупом" конце, а разборка - только на " остром". Проверить, так ли это в действительности для большинства клеток in situ пока невозможно. Однако, в одном специальном случае полимеризации актина in vivo абсолютная полярность сборки прямо показана. При акросомальной реакции у сперматозоидов голотурии Шпуопе образование акросомального отростка происходит благодаря чрезвычайно быстрой сборке пучка ак-тиновых филаментов, составляющего скелет отростка. Пучок образуется путем элонгации имеющихся в акросоме затравок, которые, как свидетельствует электронная микросокпия, надстраиваются только на ближайшем к клеточной периферии конце, который соответствует "тупому" концу филаментов. В этом случае абсолютная полярность сборки имеет совершенно ясный биологический смысл - если бы пучок удлинялся также и на другом конце, он проткнул бы тело клетки. В модельной бесклетной системе - при полимеризации актина из экстракта сперматозоидов на экзогенных затравках - сборка также происходит исключительно на ""тупом" конце затравок. Показано, что такая полярность сборки обусловлена присутствием в сперматозоидах белка с молекулярным весом 17 кД, сходного по свойствам с про-филином. Этот белок и поддерживает концентрацию мономерного актина на уровне ниже критической для полимеризации на "остром" конце. Вероятно, что путем такой же полярной сборки филаментов происходит

продвижение переднего края фибробластов. В пользу такого предположения свидетельствует то, что филаменты на переднем крае ориентированы одинаково - "тупыми" концами в сторону плазматической

мембраны ( Small,Isenberg,Celis, I97S)

Непонятным, однако, остается то, как при концентрации свободного мономера, не превышающей критическую для "острого" конца, обеспечивается высокая скорость сборки актиновых филаментов in vivo (20 мкм/с в случае акросомального отростка). Высказано предположение ( Tilney et al., 1985 )» что в полимеризации на "тупом" конце отростка может участвовать не только свободный мономер актина, но и его комплекс с белком, подобным црофшшну. Предполагается, что в комплексе с профилином свойства актина меняются таким образом, что он может ассоциировать только с "тупым" концом затравки. После связывания комплекса актина и профилина с концом филамента молекула профилина диссоциирует из комплекса.

Возможен и другой способ увеличения общей скорости полимеризации актина в клетке - увеличение числа растущих филаментов. Если происходит разборка филаментов, то увеличение их числа должно приводить к ускорению и этого процесса. Увеличение числа филаментов может быть достигнуто путем их фрагментации. Предполагают, что способностью фрагментировать филаменты обладают кепирующие белки, а также белки типа депактина.

Таким образом, при участии профилина создается необходимый для перестроек цитоскелета пул растворимого актина, а кепирующие и фрагментирующие белки играют роль локальных и быстродействующих регуляторов сборки и разборки филаментов. Актиновые филаменты при участии белков, сшивающих их между собой, могут собираться в надфиламентные структуры - пучки и сети. Сами процессы образования этих структур могут иметь биологические функции. Например,

образование пучков микрофиламентов у фибробластов, вероятно, связано с распластыванием клеток по субстрату. При разрушении пучков

клетки округляются ( VJestermark, Porter, 1982 ). В отсутствие морфогенетических процессов пучки и другие агрегаты филаментов могут выполнять питоскелетную функцию, способствуя сохранению клеточной формы. Кроме того, имеются данные, что пучки филаментов являются сократимыми структурами, подобными миофибриллам ( Kreis, Birchmeier, 1980 ). в составе пучков микрофиламентов и других цитоскелетных структур немышечных клеток обнаружен миозин, который, по-видимому, способен образовывать толстые филаменты и взаимодействовать с актином в принципе так же, как и в мышечных клетках. Взаимное скольжение актиновых и миозиновых филаментов является, наряду с полимеризацией актина, одним из способов движения немышечных клеток. Организация подвижности с участием актомио-зина в немышечных клетках имеет некоторые особенности.

В немышечных волокнах, буквально начиненных актомиозином, не возникает проблемы передачи движения, генерируемого при скольжении филаментов, отдаленным частям клетки. В немышечных клетках содержание миозина по отношению к актину существенно меньше, чем в мышечных, поэтому, очевидно, активное сокращение при скольжении филаментов может происходить лишь в ограниченных участках клетки, а протяженные участки протоплазмы должны перемещаться пассивно. Передача движения протяженным участкам клетки может происходить при участии сети актиновых филаментов, образующейся под действием белков, сшивающих филаменты. Некоторые участки цитоплазмы, возможно, представляют собой смешанный сократительный гель из актина, миозина и белков, сшивающих актиновые филаменты. Образование и сокращение такого геля наблюдалось в бесклеточных белковых

экстрактах ( Kane, 1976; IsHura,Okada,I979;HarrisI984>.) Сократимый гель может образовываться и из двух компонентов - актина и миозина. Однако в опытах in vitro показано, что добавление актин-связывающего белка из макрофагов уменьшает минимальную концентрацию миозина, необходимую для сокращения геля (Stendahl, Stossel 1980 ). Частичное растворение сократимого геля под действием белков, фрагментирующих актиновые филаменты, может приводить к тому, что сокращение будет происходить асимметрично, чем обеспечивается возможность поступательного движения клетки. In vitro было получено асимметричное сокращение геля из актина, миозина и актин-связывающего белка в капилляре при добавлении гельзолина

2+

и создании градиента ионов Са - гель как бы уползал в сторону

меньшей Концентрации Са ( Stendahl,Stossel, 1980 ).

Роль локального растворения геля в определении направления движения была показана и in vivo в опытах , проведенных на амебах. Если в гелеобразную примембранную эктоплазму амебы производили инъекцию какого-либо агента, нарушающего примембранный слой, например, капли масла или фрагментирующего актин белка, - в этом месте наблюдалось образование псевдоподии (Korohoda, stockem, 1975 Gawiitta et ai., 1980 ). Простейшая интерпретация этого результата состоит в том, что эктоплазма амебы представляет собой сократимый мешок, выталкивающий жидкую эндоплазму в сторону меньшего сопротивления. Таким образом направление "перетекания" амебы диктуется расположением "дырки" в актиновом питоскелете. В этом случае, как и во многих других, ясен только общий механизм регуляции подвижности, но неясно, ни какие именно актин-связываю-щие белки тут действуют, ни чем регулируется их активность.

Во многих случаях для актин-связывающих белков отмечена характерная внутриклеточная локализация, что стимулирует поиски

конкретных функций этих белков. Так, винкулин обнаруживается в фокальных контактах ( Geiger et al., 1979 ), <<-актинин - в фокальных контактах, а также в пучках микрофиламентов ( Feramis-co,Biose,i980 ), фимбрин - преимущественно на периферии клеток ( Bretscher, Weber, 1980 ), актин-связывающий белок из макрофагов - В ПСЄВДОПОДИЯХ фаГОЦИТИруЮЩИХ КЛеТОК ( Stendahl et al.,

1980) и т.д. Однако пока еще особенности локализации этих белков не удалось связать с их функциями и биохимическими свойствами.

5jS . Направления дальнейших исследований биохимии актин-

связывающих белков

Для дальнейшего выяснения роли актин-связывающих белков в клетке необходимы, конечно, тонкие исследования их внутриклеточного распределения и перераспределения и другие исследования на клеточном уровне. Однако имеется еще ж целый ряд биохимических вопросов, без ответа на которые невозможно понять организацию ак-тинового питоскелета. Во-первых, актин-связывающие белки сравнительно полно охарактеризованы лишь в небольшом числе немышечных объектов. К таким Объектам ОТНОСЯТСЯ простейшее Acanthamoeba МИКСОМИЦетЫ Dictyostelium nPhysarum , МИКроВОрсИНКИ КИШЄЧНОГО

эпителия птиц, макрофаги и тромбоциты млекопитающих. Вместе с тем сведения об актин-связывающих белках большинства тканей высших животных отличаются фрагментарностью.

Во-вторых, недостаточно исследованы механизмы действия многих актин-связывающих белков. Наименее исследованной группой являются, пожалуй, фрагментирующие и кепирующие белки.

Роль, которая выше приписывалась белкам этого типа - роль быстродействующих регуляторов сборки и разборки актина в клетке -

может быть выполнена ими, очевидно, лишь в том случае, если они действительно обладают способностью ломать филаменты. Однако наличие такой активности до сих пор не показано однозначно. Разнообразие кепирующих белков позволяет ставить вопрос об их возможной функциональной гетерогенности. Сообщалось, что некоторые белки этой группы способны разрушать актиновые цитоскелеты клеточных моделей, а некоторые лишены такой активности ( isenberg et ai., 1985 ). Интересно было бы понять, какие различия в механизме действия это отражает.

Наконец, необходимо отметить, что почти ничего не известно о взаимодействии актина и актин-связывающих белков с другими компонентами клетки. Однако очевидно, что система актиновых мик-рофиламентов существует в клетке не изолированно, а взаимодействует с другими цитоскелетными структурами и органеллами. Когда мы рассматривали, как актин-связывающие белки могут регулировать полимеризацию и деполимеризацию актина в клетке, обычно оставался открытым вопрос о том, что же регулирует активность самих актин-связывающих белков. О регуляции их активности почти ничего

не известно кроме того, что в некоторых случаях она может осу-

2+

ществляться путем изменения концентрации ионов Са . Вероятно,

что регуляция активности актинового цитоскелета происходит во взаимодействии его с другими клеточными компонентами, и такие вопросы, как вопрос о регуляции вообще, нельзя решить, если рассматривать систему актиновых микрофиламентов изолированно. В частности, имеются данные о том, что полярность системы микрофиламентов в клетке может определяться другой цитоскелетной системой - системой микротрубочек ( Васильев и др., 1972 ). Поэтому принципиальныгл является вопрос о том, как осуществляется

взаимодействие актиновых микрофиламентов с системой цитоплазма-тических микротрубочек и, в частности, с помощью каких белков осуществляется это взаимодействие.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I..Материалы

В работе были использованы следующие реактивы: трис (окси-метиламинометан) (" Sigma ", США), имидазол (" Sigma "» США и " Reanai", Венгрия), ксі ("Реахим" хч и осч), MgCb₂ и 0аС1₂ ("Serva ", ФРГ), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА)(" Serva ", ФРГ), этиленгликоль-бис/2-аминоэтшювый эфир/- N,ft'-тетрауксусная кислота (ЭГТА)(" Sigma ", США), 2-меркаптоэтанол ("Кэгск ", ФРГ), NaN^ ("Sigma ", США), аденозинтрифосфат ("Reanai ", Венгрия), глицерин ("Реахим" чда), сахароза ("Реахим" хч), глицин (" Reanai ", Венгрия), NaHCO^ ("Реахим" хч), ( NHb) ₂so^ ("Реахим" хч) , неї ("Реахим", хч), уксусная кислота ("Реахим", хч), ацетон ("Реахим", хч), гуанозинтрифосфат (" Serva ", ФРГ), дезоксирибонуклеиновая кислота (" Reanai ", Венгрия), цитохалазин (" Sigma ", США), фал-лоидин ("Boehringer ", ФРГ).

В работе использовались также следующие ферменты: -химо-трИПСИН (" Sigma", США) И протеаза V8 ИЗ Staphylococcus aureus ("Miles ", Англия) - для получения одномерных пептидных карт и панкреатическая ДБКаза I (" Whortington ", США.) - для определения полимеризации актина.

Для хроматографии использовались следующие носители: ДЭАЭ-целлюлоза DE52 , фосфоцеллюлоза PII, карбоксиметилцеллю-лоза СМ-52 ("VJhatman ", Англия), сефакрилы S-200 и S-300, се-фароза 4В, ДЭАЭ-сефароза, сь-бв , сефароза 4В, активированная BrCN , (" Pharmacia fine chemicals ", Швеция), гидроксилапа-ТИТ НТР ("BioRad ", США).

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле, фик-

сирования и окрашивания гелей были использованы: акриламид, метил енбисакриламид (" Fiuka ", Швейцария), аммоний надсернокис-лый ("serva ", ФРГ), тетраметилэтилендиамин ("Reanai ", Венгрия), трис ("Реахим, хч), додепилсульфат натрия ("Serva ", ФРГ), трихлоруксусная кислота ("Реахим", чда), краситель кумасси ярко-голубой R-250 ("Merck ", ФРГ).

Для электронной микроскопии использовались: формвар ("Serva" ФРГ), дихлорэтан ("Реахим"), дополнительно перегнанный и уранил-ацетат ("Реахим").

В работе были использованы следующие основные буферные растворы: буфер А - 2 мМ трис-НСІ рН 7,6, 0,5 мМ АТФ, 0,2 мМ CaCL?, 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол; буфер В - 10 мМ имидазол-НС1 рН 7,5, I мМ АТФ, 0,1 мМ СаСЪ,, 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол; буфер С - 20 мМ трис-НСІ рН 7,5, ОДм! CaGIg, 0,5 мМ 2-меркалтоэтанол, 0,02$ NaN₃ .

2. Методы

2.1. Получение ацетонового порошка из скелетных мышц кролика Ацетоновый порошок получали по методу ( straub, 194-2 ). Охлажденные мышцы ног и спины двух кроликов отделяли от жира и сухожилий, измельчали с помощью мясорубки и экстрагировали 30 мин на холоду в тройном объеме буфера Штрауба (0,1 М калий-фосфатный буфер рН 6,5 с 0,3 М KCI). Затем осаждали экстрагированные мышцы при 20 000 є в течение 10 мин, суспендировали осадок в десятикратном объеме холодной воды, отжимали через двойной слой марли и снова экстрагировали 0,4$ раствором NaHCO^ (5:1 по объему) в течение 30 мин на холоду. Снова отжимали через марлю, разводили равным объемом 10 мМ Na₂co^ и 10 мМ NaHCO^ перемешивали 10 мин при комнатной температуре, разводили деся-

тикратшм объемом воды и отжимали через марлю. Осадок экстрагировали 10 мин тройным объемом холодного ацетона, промывали ацетоном три раза, отжимали и высушивали на воздухе. Из мышц двух кроликов (600-1000 г) получалось 30-80 г ацетонового порошка.

2.2. Получение актина

Актин из ацетонового порошка мышц кролика получали по методу Спудича и Уатта ( Spudich, Watt, 1971 ) с небольшими модификациями. 3-5 г ацетонового порошка экстрагировали из расчета 20 мл на I г буфером А при 4С в течение I часа на магнитной мешалке, центрифугировали при 40 000 в течение 30 мин, суперна-тант фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, добавляли в него KCI до 50 мМ и MgCi₂ до 2 мМ и инкубировали 2 часа на холоду для полимеризации. Затем доводили концентрацию KCI в супернатанте до 0,6 М, ішкубировали на холоду в течение ночи и центрифугировали 3 часа при 100 000g и 4С. Осадок F -актина суспендировали с помощью стеклянного гомогенизатора в 10-20 мл буфера А и диализовали в течение двух суток против трех смен этого буфера (по 500 мл) для деполимеризации. После диализа раствор G- актина осветляли центрифугированием при 100 000 g в течение 2 часов на холоду. Полученный препарат G-актина с концентрацией 3-6 мг/мл использовали для иммобилизации на активированной вгск сефарозе.

Для опытов по полимеризации актин дополнительно очищали от

ПрИМеСИ, Понижающей ВЯЗКОСТЬ (MacLeaa-Pletcher,Pollard,I98Qla) ,

путем гельфильтрации на колонке с сефакрилом s-200. Профиль элюции с колонки представлен на рис. I. Актин из различных фракций после гельфильтрации разбавляли до концентрации 0,3 мг/мл, полимеризовали, добавляя MgCi_? до 2 м!1 1 КСІ до 100 мМ, и

I -

вязкость, сїї

номера фракций

Рис. І. Гельфильтрация актина на сефакриле 5-200.

На колонку размером 1,8x60 см, уравновешенную буфером А, наносили 3 мл раствора актина (Е2до=3,6) и элюировали буфером А со скоростью 12 мл/час, собирая фракции по 3 мл

—' - %90
--о кажущаяся вязкость актина после полимеризации

определяли кажущуюся вязкость через 2 часа после полимеризации, как это описано в разделе 2.7 (см. рис. I). 2-3 фракции с максимальной кажущейся вязкостью (время падения шарика 1-3 мин) использовали в опытах по полимеризации. Из электрофореграмм, представленных на рис. 2 видно, что и исходный, и полученный после гельфильтрации препараты представляли собой высокоочщенный актин, однако вязкость актина, полимеризованного после гельфильтрации, была существенно выше. Актин хранили при 4С, добавляя азид натрия до 0,02$ и использовали в течение 5 дней после получения.

2.3. Получение тубулина

Препарат тубулина получали из мозга крупного рогатого скота по методу Шеланского и др. ( Sheianski et aii973) с модификациями как в работе ( Родионов и др.,1978).

Свежий мозг немедленно после получения на мясокомбинате помещали в лед. Через 1,5-2 часа после забоя животных большие полушария мозга гомогенизировали при 4С в буферном растворе состава: 50 мМ имидазол, 50 мМ KDI, 0,5 мМ MgCi₂ , рН 7,2 из расчета I мл буферного раствора на I г ткани мозга. Значение рН буфера, использованного для гомогенизации, было подобрано с таким расчетом, чтобы рН гомогената составлял 6,7. Гомогенат центрифугировали при 20 000 g в течение 20 мин на холоду, в супернатант добавляли ГТФ до 0,1 мМ и снова центрифугировали при 100 000 g 40 мин на холоду. В супернатант добавляли равный объем буферного раствора состава: 50 мМ имидазол, 50 мМ КЯ, 0,5 мМ Mgd₂, 8 М глицерин рН 6,7, затем добавляли ЭГТА до I мМ и инкубировали при 37С в течение 1,5 часов для полимеризации тубулина. Микротрубочки собирали центрифугированием при 100 000 g

а о" Ь

Рис. 2. Электрофорез очищенных препаратов белков, использовавшихся в работе. Актин - а) до и б) после гельфильтращи, в) - тубулин

в течение часа при 20С. Осадки микротрубочек суспендировали в растворе, содержащем 50 мМ имидазол, 50 мМ НИ, 0,5 мМ Mgci 4 М глицерин, I мМ ЭГТА рН 6,7,из расчета I мл раствора на 4-6 г ткани мозга и хранили в течение 1-2 недель при 4С.

Для получения тубулина суспензию микротрубочек непосредственно перед опытами, в которых должен был использоваться тубулин, центрифугировали при 140 QOOg в течение 40 мин при 20С, осадки суспендировали в буферном растворе состава: 50 мМ имидазол, 50 мМ H3I, 0,5 мМ M_gci₂ , 0,1 мМ ЭДТА, I мМ 2-меркаптоэтанол рН 6,7 (буфер Д), содержащем 0,1 мМ ГТФ и инкубировали для деполимеризации микротрубочек при 0С в течение 30 мин. Раствор, содержащий тубулин и белки, ассоциированные с микротрубочками, осветляли от недополимеризовавпшхся белковых агрегатов центрифугированием при 140 000s в течение 40 мин при 2С.

Отделение тубулина от белков, ассоциированных с микротрубочками проводили с помощью ионообменной хроматографии на фосфо-целлюлозе ( Weingarten et ай.,1975 ). На колонку наносили препарат белков микротрубочек из расчета 2-3 мг белка на I мл ионо-обменника и элюировали буфером Д со скоростью 2 объема колонки в час. Если препарат тубулина должен был использоваться в опытах по косидементации с G -актином, элюцию с фосфоцеллюлозы проводили буфером А. Неадсорбирущаяся на фосфоцеллюлозе фракция содержала очищенный тубулин (рис. 2).

2.4. Получение экстракта мозга для аффинной хроматографии и для получения Факторов, понижающего вязкость актина

Экстракт мозга для этих целей получали в основном так же, как и для получения тубулина. Свежий охлажденный мозг гомогенизировали на холоду в буфере В или С (см. "Результаты") из рас-

чета I мл буфера на I г мозга и осветляли гомогенат сначала при 20 000 g в течение 10 мин при 2С, а затем при 100 OOOg в течение 40 мин при 2С. Для получения фактора, понижающего вязкость актина, рН осветленного гомогената доводили КОН до значения 7,7 при 4С.

2.5. Иммобилизация актина на сефарозе, активированной
Актин иммобилизовали на сефарозе как описано в ( im et ai.,

1982 ). 10-15 мл раствора актина с концентрацией 4-6 мг/мл ди-ализовали в течение 3 часов против I л 0,1 М раствора КансОо рН 8,3 (буфер Е). 6 г сефарозы 4В, активированной Brew , быстро промывали 0,5 л І мМ Н0І, а затем 0,5 л буфера Е, смешивали с отдиализованным актином и перемешивали в течение ночи при 4С. Затем промывали суспензию сефарозы 0,5 л 0,2 М глицерина (рН 8,0), суспендировали в растворе глицина и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого сефарозу промывали 200 мл 0,1 М уксусной кислоты (рН 4,0) и 200 мл буфера Е, причем повторяли последнюю процедуру 3 раза. Затем сефарозу с привязанным актином суспендировали в буфере А с 0,02$ азида натрия и хранили до месяца при 4С.

2.6. Подготовка ионообменников

Ионообменники регенерировали и заряжали как описано в инструкции, прилагаемой изготовителем. Перед употреблением ионообменники суспендировали в требуемом растворе и доводили рН суспензии фосфоцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы раствором ими-дазола, а рН суспензии ДЭАЭ-целлюлозы - HGI. В первых опытах по выделению фактора, понижающего вязкость актина, ДЭАЭ-целлю-лозу насыщали АТФ, добавляя концентрированный раствор АТФ до

тех пор, пока оптическая плотность фильтра суспензии ионообмен-ника при 280 нм не начинала увеличиваться.

2.7. Определение кажущейся вязкости актина с помощью

вискозиметра с падающим шариком Вязкость раствора Р -актина, являющегося неныотоновской

ЖИДКОСТЬЮ, ЗаВИСИТ ОТ веЛИЧИНЫ СДВИГа ( Graessley, 1967; Zaner, Stossel, 1982 ). Чтобы УМеНЬШТЬ РОЛЬ ЭТОЙ ЗаВИСИ-

мости при определении вязкости, Поллард и др. предложили использовать для измерения вязкости актина микрокапиллярный вискозиметр С падающим шариком ( MacLean-Fletcher,Pollard,I980a) , в котором

величина сдвига имеет более низкое значение и меньше колеблется, чем при измерении в вискозиметре Оствальда. При использовании вискозиметра с падающим шариком раствор актина не подвергается перемешиванию до самого момента измерения, что позволяет избежать деградации Р-актина ( Pollard, cooper, 1982 ). Благодаря этим особенностям вискозиметрия с низким сдвигом более чувствительна к параметрам актиновых филаментов (длина, наличие взаимодействия между ними), чем традиционная вискозиметрия в вискозиметре Оствальда.

Измерение вязкости F -актина проводили следующим образом. К 10-30 мкл раствора а -актина в буфере А добавляли 70-90 мкл буфера С, содержащего исследуемые факторы, влияющие на вязкость актина. Объемы раствора &-актина и буфера С подбирали таким образом, чтобы общий объем пробы составил 100 мкл, а конечная концентрация актина - 0,3 мг/мл. Для полимеризации актина к пробам добавляли ЖЯ из I М раствора и MgCl₂ из 50 мМ раствора до концентраций, указанных в каждом из опытов (обычно 2 мМ Шясі и 100 мМ НИ). Образцы перемешивали и немедленно набирали

в одинаковые капилляры объемом 200 мкл ж диаметром 1,1 мм. Нижнее отверстие капилляров закрывали и инкубировали реакционную смесь в капилляре в течение требуемого в данном опыте времени (обычно 2 часа до достижения стационарного состояния). После этого капилляры располагали в штативе под зтлом 45 и измеряли время прохождения в них стальным шариком с диаметром 0,8 мм расстояния в 6 см. Время падения шарика через капилляр с водой составляло 2 сек. через раствор F-актина с концентрацией 0,3 мг/мл - 60 -180 сек.

Чтобы выражать кажущуюся вязкость актина в пуазах, была проведена калибровка капиллярного вискозиметра по растворам глицерина. Выяснилось, что время падения шарика в капилляре линейно зависит от вязкости раствора глицерина в диапазоне вязкостен 5-1000 сП, причем время падения 100 с соответствует вязкости 130 сП. Поэтому для того, чтобы получить значение кажущейся вязкости раствора актина в сантипуазах, время падения шарика в секундах умножали на коэффициент 1,3.

2.8. Определение удельной активности фактора, понижающего вязкость актина

Мерой активности фактора, понижающего вязкость актина, считали степень разжижения актина, т.е. отношение кажущейся вязкости контрольного образца р-актина к кажущейся вязкости актина, полимеризованного в присутствии фактора. Из рис. 21 видно, что степень разжижения актина в интервале 5-40 примерно линейно зависит от концентрации фактора. Поэтому для определения удельной активности фактора концентрацию препарата фактора подбирали таким образом, чтобы степень разжижения актина составляла 5-40. Удельной активностью называли отношение степени разжижения к

концентрации белка, вызывающего это разжижение.

2.9. Определение ДНКазной активности

Для определения активности ДНКазы І в присутствии различных препаратов актина 5 мкл раствора ДНКазы I с концентрацией 100мкг/мл смешивали в полумикрокювете спектрофотометра с 5-50 мкл раствора актина. Затем добавляли I мл раствора ДНК концентрации 100 мкг/мл в буферном растворе состава: 25 мМ трис-НС1, 50 мМ Касі , 5 мМ MgCi₂ , І мМ СаСІ рН 7,5. Скорость ДНКазной реакции определяли по гиперхромному эффекту, регистрируя кинетику возрастания поглощения при 26о нм с помощью спектрофотометра "Gilford " модель 250 при 25С.

2.10. Определение полимеризации актина оптическим методом

ПоЛИМерИЗаЦШО регистрировали ОПТИЧеСКИМ МеТОДОМ (Higashi,

Oosawa, 1965 ) записывая кинетику роста поглощения образца актина при 237 нм. Измерения проводили в полумикрокюветах объем 0,7 мл спектрофотометра "Gilford " модель 250, термостатируемых при 25С. ИЛ и MgCi₂ для полимеризации актина добавляли непосредственно в кювету спектрофотометра.

2.11. Аналитическое ультрацентшйушрование
Аналитическое центрифугирование проводили в центрифуге

"Beckman Е " со шлирен-оптикой при скорости вращения ротора 56 000 об/мин, или со сканирующей оптикой при скорости вращения ротора 60 000 об/мин.

2.12. Электронная микроскопия

Для приготовления негативно контрастированных препаратов F-актина исследуемый раствор у-актина разводили до концентра-

ции 0,03-0,05 мг/мл буфером С, содержащим 2 мМ MgCi₂ и 100 мМ KCI, каплю раствора помещали на медную сетку, покрытую пленкой-лодложой из формвара, и окрашивали несколькими каплями 1-2$ водного раствора уранилацетата.

Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронных микроскопов "ни и" и "ни 12" ("Hitachi ") при ускоряющем напряжении 75 кв.

2.13. Электрофорез в полиакрззламидном геле Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия обычно проводили в пластинах прерывистого полиакриламидного геля по методу Леммли ( baemmii, 1970 ). Использовали буферные растворы, описанные в работе Леммли, и следующие концентрации гелей: 4$-ный концентрирующий гель с соотношением акриламид:метилеыбис-акриламид 30:0,8 и 15$-ный (или 20$-ный - для анализа продуктов цротеолиза) разделяющий гель с соотношением акриламид:метиленбис-акриламид 100:1. Для анализа состава актинового геля в экстракте клеток асцита Эрлиха электрофорез в присутствии ДДС- ка проводили

ПО методу Вебера-ОсбОрН ( Weber, Osborn, 1969 ) В ЦИЛИНДри-

ческих полиакриламидных гелях с градиентом концентрации полиак-риламида 4-10$ при соотношении акриламид:метиленбисакриламид 30:0,8.

Электрофорез в отсутствие денатурирующих агентов проводили в цилиндрических полиакриламидных гелях различных концентраций (6, 8, 10 и 12$) при соотношении акриламид:метиленбисакриламид 100:1. При этом использовали буферную систему Леммли, но без концентрирующего геля и в отсутствие МС-ка-Гели после электрофореза обычно фиксировали в течение ночи в 12,5$ растворе трихлоруксусной кислоты, окрашивали 0,05$ раст-

вором кумасси ярко-голубого R-250, приготовленного на 12,5$ трнхлоруксусной кислоте, и отмывали 7$ уксусной кислотой.

В некоторых случаях применяли другие способы окрашивания гелей. Если гель необходтю было использовать для вырезания белковых полос и рефореза белков, содержащихся в этих полосах, или получения их одномерных пептидных карт, то окрашивание проводилось раствором, содержащим 0,05$ кумасси ярко-голубого, 50$ этанола и 10$ уксусной кислоты, без предварительной фиксации. После окрашивания в течение 10-20 мин гели отмывали 7$-ной уксусной кислотой в течение не более чем I часа и вырезали проявившиеся белковые полосы.

Если пептидные карты получали путем протеолиза непосредственно в полиакриламидном геле (см. ниже), то для выявления продуктов протеолиза использовали более чувствительный, чем обычное окрашивание кумасси, метод - метод серебрения ( Wray

et ai., 1981 ). Для окрашивания по этому методу фиксированные гели помещали на I сутки в 50$-ный метанол, а затем заливали на 15 мин красителем, который готовили непосредственно перед употреблением следующим образом: 0,8 г нитрата серебра растворяли в 4 мл воды. Отдельно смешивали 21 мл 0,36$ Иаон _и 1,4 мл 14,8 М ын.он . Раствор нитрата серебра по каплям приливали к раствору щелочи и быстро доводили объем смеси до 100 мл. После обработки полученным раствором гели промывали водой и помещали в проявляющий раствор, содержащий 0,005$ лимонной кислоты и 0,019$ формальдегида. По окончании проявления гели переносили в 50$-ный метанол и хранили в темноте.

Денситограммы гелей получали с помощью спектрофотометра " Gilford" 250, оснащенного приставкой для сканирования, при

длине волны 550 нм.

2.14. Получение одномерных пептидных карт

ДЛЯ получения одномерных пеПТИДНЫХ Карт ( Cleveland et al., 1977 ) использовали 2 способа.

По первому способу протеолиз препаратов индивидуальных белков проводили в растворе. Исследуемые белки инкубировали в течение различных промежутков времени с с<-химотрипсином (50 мкг/мл) в присутствии 0,1$ додецилсульфата натрия. Протеолиз останавливали, помещая пробы в кипящую водяную баню. Продукты анализировали методом электрофореза в 30$ полиакриламидном геле в системе Леммли.

По второму способу протеолиз белков, разделенных методом электрофореза, проводили непосредственно в полиакрапамидном геле. Для этого вырезанные кусочки геля, содержащие белковые полосы, выявленные путем окрашивания без предварительной фиксации (см. выше), промывали водой и инкубировали 30 мин в растворе, содержащем 0,125 М трис-HCI (рН 6,8), 0,1$ ДЦС-йа _и і $ц ЭДТА. После этого кусочки геля помещали в карманы концентрирующего полиакрил-амидного геля, приготовленного по методу Леммли, заливали небольшим количеством раствора, используемого для приготовления концентрирующего геля и давали раствору заполимеризоваться. Затем в эти же карманы заливали по 5-15 мкл раствора протеазы V8 (0,05 мг/мл) или о(-химотрипсина (0,1 мг/мл) в буфере, содержащем 0,125 М трис-НСІ (рН 6,8), 0,1$ ДЦС-Ма , I мМ ЭДТА, 10$ глицерин и бромфеноловый синий, и проводили электрофорез до тех пор, пока белковые образцы и протеазы не оказывались сконцентрированными на границе концентрирующего и разделяющего геля. После этого напряжение отключали на 30 мин для того, чтобы прошел

протеолиз, а затем проводили электрофорез до конца, фиксировали полученный гель и окрашивали его методом серебрения.

2.15. Определение концентрации белка

Концентрацию белка определяли по методу Лоури, используя актин в качестве стандарта. Концентрацию белка также оценивали, измеряя оптическую плотность раствора при 280 или 290 нм. Концентрацию очищенного актина определяли, используя значение коэффициента экстинкции при 290 нм 0,56 ( Wegner, 1976 ).

2.16. Перевивка асцитной карциномы Эрлиха и получение
экстракта клеток карциномы

Асцитную карциному Эрлиха прививали белым лабораторным мы-

[Г

шам, вводя внутрибрюшинно по 0,5 мл суспензии клеток (или 10 клеток) на мышь. Через 7-Ю дней после прививки мышей забивали и отбирали асцит из брюшной полости. Клетки осаадали из асцита путем центрифугирования при I 000 об/мин в течение 10 мин в роторе 14 центрифуги "Beckman JA2IB " и дважды промывали раствором следующего состава: KCI - 200 мг/л, KHgPO^ - 200 мг/л, иасі -8 г/л, їїа^НРО, - 1,15 г/л.

Для получения экстракта осажденные клетки суспендировали в равном объеме буфера В, гомогенизировали путем обработки ультразвуком с частотой 22 кгц в течение 2 мин и осветляли полученный гомогенат путем центрифугирования при 100 000g в течение 40 мин на холоду. Осветленный гомогенат использовали для опытов по образованию геля.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Структура и свойства мономера актина

Актин из мышц млекопитающих содержит 375 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 42 000 ( Elzinga et ai.,1973 ) Во многих немышечных актинах и-концевой остаток аспарагиновой кислоты мышечного актина отсутствует, и они содержат 374 аминокислотных остатка (Vandekerckhove,Weber, 1978 ). Аминокислотный состав актина не отличается шшакими особенностями, кроме кислого характера и-концевого пептида и необычной аминокислоты -3-метилгистидина, находящегося в положении 73 как у мышечных, так и у немышечных актинов ( Vandekerckhove, Weber,1978а ). Аминокислотная последовательность актинов отличается исключительной консервативностью - актин из миксомицета Physarum только на Q% аминокислотной последовательности отличается от актина из мышц млекопитающих и только на 5% - от немышечного актина млекопитающих ( Vandekerckhove, Weber, 1978а ). Различия между актинами из различных тканей одного и того же вида (6% между мышечным и немышечным актинаг.ш быка) так же велики, как и между актинами неродственных видов ( Vandekerckhove, Weber, 1978 ). Наибольшую вариабельность обнаруживает ж-концевая последовательность актинов, в особенности N-концевой тетрапептид, хотя у всех актинов он имеет КИСЛОТНЫЙ характер ( Vandekerckhove,Weber, 1978b ). Различия В кислотности ж -концевого тетрапептида служат основой для разделения актинов методом изоэлектрогоокусирования ( zechel,Weber,1978 Garreis, 1976 ). В тканях одного организма обнаруживается несколько различных актинов. Так, у быка обнаружено 6 .форм актина: один актин в скелетной мускулатуре, один в сердечной мышце и по две формы в гладкомышечных и немышечных клетках ( Vandekerckhove, Weber, 1978Ъ ). Такое же число форм актина обнаружено в тканях цыпленка (Cleveland et aU980). Актин из скелетной мускулатуры при изоэлектрофокусировании оказывается самым кислым - он получил название Ы-актина. Два изоэлектрических варианта актина из немышечных клеток называются В - и f-актинами.

Эти же наименования применяются и для гладкомышечных форм актина, хотя по первичной структуре гладкомышечные актины отличаются от немышечных того же организма. Молекула актина содержит один центр связывания нуклеотида и один центр высокоаффинного связывания двухвалентного иона ( Heidi,Engel, 1979; Kasai,Oosawa, 1968 ). В G-актине ИЗ мышц, выделенном обычным способом, центр связывания нуклеотида занят АТФ ( straub,Peuer,i950 ), а центр связывания двухвалентного иона - ионом Са (Martonosi et ai.1964). Кроме АТФ, в нуклеотид- связывающем центре могут связываться также АДФ и аналоги АТФ. 7 —Т Константа связывашш для АДФ (4,5 х ЮМ ) в 150 раз меньше константы связывания АТФ (7,5 х ю\гЪ( Neidl,Engel, 1979 ), что означает, что при физиологических концентрациях АТФ и АДФ центр связывания нуклеотидов в G-актине занят практически полностью АТФ. Центр связывания двухвалентного иона в физиологических уело-виях, по-видимому, занят ионом Mg . Кроме Mg + и Са в этом центре могут связываться и другие двухвалентные ионы, но не одновалентные ( Kasai,0osawa,I968; Prieden et al.,I980 ). Нуклео-тид из актина может быть удален путем продолжительного диализа или обработки активированным углем ( Barany et ai.,1961 ), но быстрее всего удаляется после связывания двухвалентного иона ЭДТА ( Strzelecka-Golaszewska, 1974 ), ХОТЯ нуклеотидсвязы-вающий центр и центр связывания иона и находятся в разных участках молекулы белка ( jacobson, Rosenbusch, 1976 ). После удаления нуклеотида и двухвалентного иона актин быстро денатурирует и теряет способность к полимеризации ( Jacobson, Rosenbusch,1976; Strzelecka-Golaszewska,1974; Engel et al.,I977 ) Рентгеноструктурные исследования кристаллов комплекса актина с ДНКазой I, а также анализ изображений кристаллических слоев актина, образующихся в присутствии ионов Gcr+ , показали, что молекула актина имеет вытянутую, возмогло, даже гантелеобразную форму (suck et ai.,1981; Aebi et ai., 1981 ). Размеры молекулы (5-7)x 4x3 нгл3. По данным кругового дихроизма актин в мономерном состоянии содержит 26$ rf-спирали и 26$ -структуры (Murphy, 1971 ). 3. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА F-АКТИНА Структура шиламентов актина была изучена путем прямого измерения электронных микрофотографий, а также путем обработки методом оптической дифракции изображений упорядоченных слоев фила-ментов ( Huxley, 1963, Moore et al.,I970; Wakabaiashi et al., 1975; Egelman, DeRosier, 1983 ) Эту структуру обычно описывают одним из двух способов (см. схему I). Согласно первому способу актиновыи филамент представляет собой стержень, состоящий из двух спирально закрученных друг относительно друга тяжей субъединиц примерно глобулярной формы. Такая структура легко выявляется на микрофотографиях негативно контрастированных образцов без всякой дополнительной обработки. Характерной особенностью структуры F-актина является периодическое изменение видимого диаметра филамента: в терминах двухтяжевой модели филамента сечения с наименьшим видимым диаметром соответствуют местам, где спиральные тяжи проходят друг под другом (скрещиваются); области увеличенного диаметра соответствуют отрезкам, где тяжи лежат бок о бок. Кажущееся пересечение тяжей наблюдается через каждые 37 нм. Поскольку тяжи пересекаются дважды за полный оборот спиралей, шаг спиралей составляет 74 нм. Исследование образцов, напыленных металлом под фиксированным утлом показало, что двойная спираль актина закручена вправо ( Depue, Rice, 1965 ). На полный оборот в каждом из тяжей обычно приходится 13 актиновых протомеров.

Степень закрученности тяжей и, следовательно, шаг спиралей и число протомеров на оборот могут несколько варьировать даже в пределах одного препарата актина и, по-видимому, одного филамента. Такая вариабельность структуры имеет важное биологическое значение, поскольку обеспечивает гибкость филаментов и образование из них пучков с различными типами упаковки (см. обзор DeRosier, Tilney, 1984 ) Другой способ описания структуры актинового филамента состоит в том, что протомеры представляют лежащими на одной левоза-крученной очень крутой спирали с шагом 5,9 нм. Зта спираль выявляется при исследовании микрофотографий методом оптической дифракции, а также непосредственно на образцах, напыленных металлом, В ВІЗДЄ КОСОЙ ИерИОДИЧеСКОЙ ИСЧерЧеННОСТИ (Heuser,KirschnerI98o). На один оборот левой спирали приходится примерно 2,16 субъединиц, каждая субъединица смещена относительно предыдущей вдоль оси спирали на 2,73 нм и повернута относительно оси спирали на угол 166 + 10 (Egelman,DeRosier, 1982 ). От ЭТОГО утла СИЛЬНО зависят парметры спирали. Так его изменение на 1 приводит к изменению расстояния между калящимися пересечениями правозакрученных тяжей на 2,7 нм. Поскольку молекула актина асимметрична, существенным является вопрос об ориентации протомеров актина в филаменте. По вопросу об ориентации протомеров относительно оси филамента до сих пор имеются разногласия. Существуют две модели упаковки протомеров с совершенно различной ориентацией (см. схему 2): в одной из них ( Smith et ai., 1983 ) длинная ось протомера почти параллельна оси филамента, в другой (Egeiman, DeRosier, 1983 ) - отклоняется от перпендикуляра к длинной оси филамента на 10-30. Обе модели дают "правильные" параметры актиновой спирали и позволяют объяснить дифракционные картины от изображений слоев филаментов. Возможность сосуществования столь различных моделей обусловлена тем, что при анализе дифракционных картин от слоев филаментов»которым получена большая часть информации о структуре актина, имеется неоднозначная процедура выделения индивидуальных филаментов. Две модели принципиально различаются по характеру предполагаемых контактов между протомерами и по предсказываемому шли диаметру филамента. В модели с "параллельной" ориентацией субъединиц предполагается, что каждый актиновыи протомер в филаменте контактирует с четырьмя соседями: с двумя в "своем" тяже и с двумя в "чужом". Таким образом, тлеется непрерывная система контактов между протомерами как вдоль правых "пологих" спиралей, так и вдоль левой "крутой". Напротив, в модели с "перпендикулярной" ориентацией каждый протомер контактирует лишь с двумя соседями и контакты располагаются только вдоль левой спирали. Следовательно, традиционное выделение в филаменте двух ігравозакрученшх тяжей по этой модели не имеет

Взаимодействующие с актином белки ншлішшх kietok

По типу функциональной активности актин-связывающие белки НеМЫШеЧНЫХ КЛетОК МОЖНО разделить На ТрИ ГРУППЫ (Craig,Pollard, 1982 ). Это белки, ингибируюшде полимеризацию актина; белки, образующие гели с у -актином; а также так называемые фрагментиру-ющие или кепирувщие белки, которые укорачивают актиноше филаменты. Все эти типы активностей впервые обнаружены и исследованы именно у белков немышечных клеток. Описанное деление белков до некоторой степени условно, поскольку имеются белки, обладающие активностями нескольких типов. Механизмы действия многих актин-связывающих белков еще недостаточно исследованы. Поэтому не исключена возможность, что белки, относимые теперь к одной и той же группе, окажутся различными по механизму действия и что обнаружатся белки с новыми типами активностей. Тем не менее описанная классификация очень удобна и рассматриваемые ниже отдельные белки будут сгруппированы таким образом. 5.1. Белки, взаимодействующие с G-актином и ингибируюнше его полимеризацию Белки этого типа ингибируют полимеризацию актина благодаря тому, что образуют с мономером актина прочные комплексы, которые не могут включаться в состав полимера. Это приводит к уменьшению концентрации участвующего в полимеризации мономера и, следовательно, к уменьшению скорости полимеризации, особенно нуклеации, которая наиболее сильно зависит от концентрации мономера. При добавлении к полимеризованному актину, находящемуся в равновесии с мономером, эти белки вызывают деполимеризацию, поскольку концентрация свободного мономера вследствие взаимодействия с белками становится ниже критической. Кроме того, не исключена возможность, что некоторые из описываемых здесь белков могут каким-то образом взаимодействовать с F-актином, ускоряя его деполимеризацию. Основные данные о белках этого типа приведены в табл. I. Профилин выделен в виде комплекса с актином (в соотношении 1:1) из селезенки, тимуса, мозга и тромбоцитов млекопитающих ( Carisson et al.,I977;Blikstad et al.,I980;Markey et al.,I98I). Комплекс может быть диссоциирован 2 М мочевиной, что приводит к Денатурации аКТИНа, НО Не ПрофиЛИНа ( Carisson et al., 1977)- Диссоциация комплекса возможна также в присутствии 5 мМ ЭГТА в буфере для полимеризации актина; в этом случае актин полимеризу- ЄТСЯ ( Kendrick-Jones et al.I978). ОЧИЩЄНШЙ ПрофИЛИН ИЗ ТКанеЙ МЛеКОПИТаЮЩИХ Имеет МОЛекуЛЯрНЫЙ ВЄС 15 220 ( Kystrom et al.,I972 ).

Известна его аминокислотная последовательность ( KystrSm et ai., 1972 ). Из Простейшего Acanthamoeba В свободном ВИДЄ ВНДЄЛЄН 6ЄЛ0К, похожий по свойствам на профилин млекопитающих, но отличающийся от него по аминокислотному составу и молекулярному весу (всего 12 500)( Reihcstein, Korn, 1979 ). Из ТромбоЦИТОВ И ЩИТОВИДНОЙ железы млекопитающих также возможно выделение свободного, не находящегося В комплексе С аКТИНОМ ПрофИЛИНа ( Grumet, Lin, 1980; Fattoum et al., 1981 ). Как ВЫДелеННЫЙ В СВОбОДНОМ ВИДЄ, ТЭК И полученный из комплекса с актином, профилин способен уменьшать скорость полимеризации и количество образующегося F-актина при СООТНОШеНИИ ПрофИЛИН:аКТИН 0,3-1:1 ( Carisson et al., I977;Reich- stein,Korn, 1979). Константа диссоциации комплекса профшшна из Acanthamoeba С аКТИНОМ составляет 5-Ю X 10 (Reichstein, Kom,i979 ). Расчеты с использованием этой величины и допущения, ЧТО В КЛеТКах Acanthamoeba ИМЄЄТСЯ Двухкратный И30ЫТ0К ПрофИЛИ- на по отношению к актину приводят к результату, что около трети актина в клетках должно быть не в полимерном состоянии вследствие образования КбМПЛеКСа С ПрофИЛИНОМ. ПрофИЛИН ИЗ Acanthamoeba стимулирует обмен связанного с актином АТФ и ингибирует АТФазу МОНОМерНОГО аКТИНа ( Mockrin, Кот, 1980). Еще более прочный, чем профшшн, комплекс (Kd= 2 X 10""%) с мономерным актином образует ДНКаза I - фермент секрета поджелудочной яелеЗЫ С МОЛекуЛЯрНЫМ ВеСОМ 31 КД ( Lazarides,Lindberg, l974;Mannherz, 1980 ). Сродства ДНКазы I к G-актину оказывается достаточно даже для деполимеризации F-актина, стабилизированного взаимодействием с тропомиозином или субфрагментом I миозина (Mannherz et al.,I975), НО НЄ фалЛОИДИНОМ (Schafer et al.,I975 ) He известно, деполимеризует ли ДНКаза I актин путем взаимодействия с протомерами в составе полимера или только сдвигает равновесие реакции деполимеризации путем связывания G-актина. Комплекс актина с ДНКазой I содержит I моль связанного АТФ, но скорость его обмена на свободный АТФ ниже, чем у G-актина в 20 раз (Hitchcock, 1980 ). Физиологическая роль взаимодействия актина с ДНКазой I неясна. Известно, однако, что ДНКаза I секретируется в ПОДЖелудоЧНЫЙ СОК В ВИДЄ Комплекса С акТИНОМ ( Rohr,Mannherz, 1978 ). Внутриклеточные ДНКазы тканей крысы не взаимодействуют С аКТИНОМ ( Lacks, 1981 ). Деполимеризацию актина способен вызывать также белок сыворотки, связывающий витамин D (молекулярный вес 52-56 кД)( van Baeien et aii980). Он образует прочный эквимолярный комплекс с G -актином и прочный тройной комплекс с актином и ДНКазой I. Разборку актина вызывает и белок с молекулярным весом 19 кД из МОЗГа ЦЫПЛеНКа ( Bamburg et al. ,І980).СВ0ЙСТВа ПОСЛЄДНИХ Двух бел- ков детально не исследованы. Неизвестно, ускоряют ли они разборку F-актина, или только сдвигают равновесие между мономером и полимером. 5.2.

Белки, сшивающие актиновые Филаменты между собой Белки этой группы могут связывать между собой актиновые фила-менты благодаря тому, что каждая молекула белка имеет по крайней мере два центра связывания с F-актином. Сшивание актиновых фила-ментов между собой приводит к увеличению вязкости растворов р-ак-тина. При увеличении концентрации белка выше некоторой критической происходит скачкообразный переход раствора F-актина в состояние геля, характеризующегося, в отличие от жидкости (или золя), жесткостью, т.е. способностью противостоять усилию сдвига. Для количественного анализа процесса образования актиновых гелей применяется теория Флори ( Fiory, 1953 ), разработанная для гелей, образующихся при химических реакциях полимеризации с разветвлением цепи. Согласно этой теории гель образуется в том случае, когда линейные молекулы полимера оказываются связанными сшивками в трехмерную сеть, непрерывную во всем объеме раствора полимера. Ясно, что необходимая для этого концентрация сшивки зависит от длины молекул полимера - чем короче молекулы, тем больше требуется сшивающего агента, чтобы связать их в непрерывную сеть. Показано, что выполняется соотношение где Рс - критическая точка гелеобразования, определяемая как отношение концентрации сшивки У0 к концентрации мономера в составе полимера N0 , а х - средневесовое число мономеров в полимере. Отсюда видно, что гель-золь переходы могут осуществляться по крайней мере двумя способами: путем изменения концентрации или активности сшивающего агента, или путем изменения средневесовой длины молекул полимера. Если концентрация сшивающего белка достаточно высока, чтобы сшить одни и те же филаменты много раз, то вместо гелей могут образоваться пучки филаментов. Белки, сшивающие актиновые филаменты, по-видимому, участвуют в гель-золь переходах в цитоплазме живых клеток. Хотя важность гель-золь переходов для процессов клеточной подвижности понимали уже очень давно ( bewis, 1939;Frey-Wyssling,194$) ,лишь около десяти лет назад удалось осуществить эти превращения в бесклеточной системе - белковых экстрактах немышечных клеток. Выяснилось, что гели, образующиеся при нагревании в экстрактах немышечных клеток, состоят из актина и белков, сшивающих актиновые филаменты. В настоящее время выделено большое число таких белков (см. табл. 2). Подробное описание их всех заняло бы слишком много места, поэтому мы рассмотрим лишь некоторые из них.

Иммобилизация актина на сефарозе, активированной Вгси

Актин иммобилизовали на сефарозе как описано в ( im et ai., 1982 ). 10-15 мл раствора актина с концентрацией 4-6 мг/мл ди-ализовали в течение 3 часов против I л 0,1 М раствора КансОо рН 8,3 (буфер Е). 6 г сефарозы 4В, активированной Brew , быстро промывали 0,5 л І мМ Н0І, а затем 0,5 л буфера Е, смешивали с отдиализованным актином и перемешивали в течение ночи при 4С. Затем промывали суспензию сефарозы 0,5 л 0,2 М глицерина (рН 8,0), суспендировали в растворе глицина и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого сефарозу промывали 200 мл 0,1 М уксусной кислоты (рН 4,0) и 200 мл буфера Е, причем повторяли последнюю процедуру 3 раза. Затем сефарозу с привязанным актином суспендировали в буфере А с 0,02$ азида натрия и хранили до месяца при 4С. 2.6. Подготовка ионообменников Ионообменники регенерировали и заряжали как описано в инструкции, прилагаемой изготовителем. Перед употреблением ионообменники суспендировали в требуемом растворе и доводили рН суспензии фосфоцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы раствором ими-дазола, а рН суспензии ДЭАЭ-целлюлозы - HGI. В первых опытах по выделению фактора, понижающего вязкость актина, ДЭАЭ-целлю-лозу насыщали АТФ, добавляя концентрированный раствор АТФ до тех пор, пока оптическая плотность фильтра суспензии ионообмен-ника при 280 нм не начинала увеличиваться. 2.7. Определение кажущейся вязкости актина с помощью вискозиметра с падающим шариком Вязкость раствора Р -актина, являющегося неныотоновской ЖИДКОСТЬЮ, ЗаВИСИТ ОТ веЛИЧИНЫ СДВИГа ( Graessley, 1967; Zaner, Stossel, 1982 ). Чтобы УМеНЬШТЬ РОЛЬ ЭТОЙ ЗаВИСИ- мости при определении вязкости, Поллард и др. предложили использовать для измерения вязкости актина микрокапиллярный вискозиметр С падающим шариком ( MacLean-Fletcher,Pollard,I980a) , в котором величина сдвига имеет более низкое значение и меньше колеблется, чем при измерении в вискозиметре Оствальда. При использовании вискозиметра с падающим шариком раствор актина не подвергается перемешиванию до самого момента измерения, что позволяет избежать деградации Р-актина ( Pollard, cooper, 1982 ).

Благодаря этим особенностям вискозиметрия с низким сдвигом более чувствительна к параметрам актиновых филаментов (длина, наличие взаимодействия между ними), чем традиционная вискозиметрия в вискозиметре Оствальда. Измерение вязкости F -актина проводили следующим образом. К 10-30 мкл раствора а -актина в буфере А добавляли 70-90 мкл буфера С, содержащего исследуемые факторы, влияющие на вязкость актина. Объемы раствора &-актина и буфера С подбирали таким образом, чтобы общий объем пробы составил 100 мкл, а конечная концентрация актина - 0,3 мг/мл. Для полимеризации актина к пробам добавляли ЖЯ из I М раствора и MgCl2 из 50 мМ раствора до концентраций, указанных в каждом из опытов (обычно 2 мМ Шясі и 100 мМ НИ). Образцы перемешивали и немедленно набирали в одинаковые капилляры объемом 200 мкл ж диаметром 1,1 мм. Нижнее отверстие капилляров закрывали и инкубировали реакционную смесь в капилляре в течение требуемого в данном опыте времени (обычно 2 часа до достижения стационарного состояния). После этого капилляры располагали в штативе под зтлом 45 и измеряли время прохождения в них стальным шариком с диаметром 0,8 мм расстояния в 6 см. Время падения шарика через капилляр с водой составляло 2 сек. через раствор F-актина с концентрацией 0,3 мг/мл - 60 -180 сек. Чтобы выражать кажущуюся вязкость актина в пуазах, была проведена калибровка капиллярного вискозиметра по растворам глицерина. Выяснилось, что время падения шарика в капилляре линейно зависит от вязкости раствора глицерина в диапазоне вязкостен 5-1000 сП, причем время падения 100 с соответствует вязкости 130 сП. Поэтому для того, чтобы получить значение кажущейся вязкости раствора актина в сантипуазах, время падения шарика в секундах умножали на коэффициент 1,3. 2.8. Определение удельной активности фактора, понижающего вязкость актина Мерой активности фактора, понижающего вязкость актина, считали степень разжижения актина, т.е. отношение кажущейся вязкости контрольного образца Р-актина к кажущейся вязкости актина, полимеризованного в присутствии фактора. Из рис. 21 видно, что степень разжижения актина в интервале 5-40 примерно линейно зависит от концентрации фактора. Поэтому для определения удельной активности фактора концентрацию препарата фактора подбирали таким образом, чтобы степень разжижения актина составляла 5-40. Удельной активностью называли отношение степени разжижения к концентрации белка, вызывающего это разжижение. Для определения активности ДНКазы І в присутствии различных препаратов актина 5 мкл раствора ДНКазы I с концентрацией 100мкг/мл смешивали в полумикрокювете спектрофотометра с 5-50 мкл раствора актина. Затем добавляли I мл раствора ДНК концентрации 100 мкг/мл в буферном растворе состава: 25 мМ трис-НС1, 50 мМ Касі , 5 мМ MgCi2 , І мМ СаСІ рН 7,5. Скорость ДНКазной реакции определяли по гиперхромному эффекту, регистрируя кинетику возрастания поглощения при 26о нм с помощью спектрофотометра "Gilford " модель 250 при 25С. 2.10. Определение полимеризации актина оптическим методом ПоЛИМерИЗаЦШО регистрировали ОПТИЧеСКИМ МеТОДОМ (Higashi, Oosawa, 1965 ) записывая кинетику роста поглощения образца актина при 237 нм. Измерения проводили в полумикрокюветах объем 0,7 мл спектрофотометра "Gilford " модель 250, термостатируемых при 25С. ИЛ и MgCi2 для полимеризации актина добавляли непосредственно в кювету спектрофотометра. 2.11.

Аналитическое ультрацентшйушрование Аналитическое центрифугирование проводили в центрифуге "Beckman Е " со шлирен-оптикой при скорости вращения ротора 56 000 об/мин, или со сканирующей оптикой при скорости вращения ротора 60 000 об/мин. 2.12. Электронная микроскопия Для приготовления негативно контрастированных препаратов F-актина исследуемый раствор у-актина разводили до концентрации 0,03-0,05 мг/мл буфером С, содержащим 2 мМ MgCi2 и 100 мМ KCI, каплю раствора помещали на медную сетку, покрытую пленкой-лодложой из формвара, и окрашивали несколькими каплями 1-2$ водного раствора уранилацетата. Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронных микроскопов "ни и" и "ни 12" ("Hitachi ") при ускоряющем напряжении 75 кв. 2.13. Электрофорез в полиакрззламидном геле Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия обычно проводили в пластинах прерывистого полиакриламидного геля по методу Леммли ( baemmii, 1970 ). Использовали буферные растворы, описанные в работе Леммли, и следующие концентрации гелей: 4$-ный концентрирующий гель с соотношением акриламид:метилеыбис-акриламид 30:0,8 и 15$-ный (или 20$-ный - для анализа продуктов цротеолиза) разделяющий гель с соотношением акриламид:метиленбис-акриламид 100:1. Для анализа состава актинового геля в экстракте клеток асцита Эрлиха электрофорез в присутствии ДДС- ка проводили ПО методу Вебера-ОсбОрН ( Weber, Osborn, 1969 ) В ЦИЛИНДри- ческих полиакриламидных гелях с градиентом концентрации полиак-риламида 4-10$ при соотношении акриламид:метиленбисакриламид 30:0,8. Электрофорез в отсутствие денатурирующих агентов проводили в цилиндрических полиакриламидных гелях различных концентраций (6, 8, 10 и 12$) при соотношении акриламид:метиленбисакриламид 100:1. При этом использовали буферную систему Леммли, но без концентрирующего геля и в отсутствие МС-ка-Гели после электрофореза обычно фиксировали в течение ночи в 12,5$ растворе трихлоруксусной кислоты, окрашивали 0,05$ раствором кумасси ярко-голубого R-250, приготовленного на 12,5$ трнхлоруксусной кислоте, и отмывали 7$ уксусной кислотой. В некоторых случаях применяли другие способы окрашивания гелей.

Влияние тубулина на седиментационные свойства актина

Как показано выше, тубулин образует комплекс с иммобилизованным актином. По-видимому, тубулин должен взаимодействовать с актином и в растворе. Однако, по данным вискозиметрии, тубулин не взаимодействует в растворе с F-актином. Мы поставили вопрос, взаимодействует ли тубулин в растворе с G -актином, в частности, образует ли он с ним прочный комплекс, подобный образующемуся на колонке. Для выяснения этого вопроса использовался метод аналитического ультрацентрифугирования. Седиментацию смеси актина с тубулином и контрольных препаратов актина и тубулина исследовали в условиях низкой ионной силы(буфер А), в которых очищенный актин находится в мономерной форме и седиментирует, как будет видно ниже, в виде одного компонента. Напомним, что большая часть опытов по связыванию тубулина с иммобилизованным актином также проводилась в условиях низкой ионной силы. Тубулин для опытов по седиментации переводили в буфер А, проводя в этом буфере последнюю стадию очистки - хроматографию на фосфоцеллюлозе (см. "Материалы и методы"). Седименто-грамш актина, тубулина и их смеси представлены на рис. 13. Видно, что индивидуальные актин и тубулин седиментируют каждый в виде одного компонента, причем скорости их седиментации различаются, (коэффициенты седиментации актина и тубулина составляли 3 s и 6 s соответственно). Смесь актина и тубулина, как видно на рис. 13 при длительном центрифугировании разделяется на два компонента, положения которых совпадают с положениями индивидуальных актина и тубулина при соответствующем времени центрифугирования. Это означает, что в растворе в смеси актина с тубулином по крайней мере часть молекул каждого из белков находится в свободном виде и не взаимодействует с молекулами другого белка. Компонента, который мог бы соответствовать стехиометрическому комплексу актина с тубулином, на седиментограмме смеси актина с тубулином не обнаруживается. Однако, в начале центрифугирования в смеси актина с тубулином выявляется быстроседиментирующий компонент (см. рис. 13, 1а), отсутствующий на седиментограммах индивидуальных актина и тубулина. Кроме того, при длительном центрифугировании обнаруживается, что пик мономерного актина в смеси актина и тубулина имеет в 5,3 раза меньшую площадь, чем пик в препарате чистого актина той же концентрации. Сопоставляя эти наблюдения можно предположить, что в присутствии тубулина часть актина осаждается в сое- таве быстроседшентирующего компонента, образование которого, по-видимому, индуцируется тубулином. для проверки этого предположения были поставлены опыты по препаративному центрифугированию смеси актина и тубулина с последующим электрофоретическим анализом осадков.

Препараты актина, тубулина и их смеси инкубировали о ч. при 20С, а затем осветляли 2 мин при 45 000 g для удаления крупных белковых агрегатов, которые могли образовываться во время инкубации. Супернатанты отбирали, наслаивали на 10$ раствор сахарозы на бушере А и центрифугировали I час при 320000 є. Для контроля специфичности в таких же условиях поставили опыт, в котором тубулин был заменен на БСА. Электрофореграммы полученных осадков представлены на рис. 14. Можно видеть, что после первого низкоскоростного центрифугирования (осветления) осадки, содержащие небольшие количества белков, обнаруживаются как в препаратах индивидуальных актина, тубулина и БСА, так и в смесях актина с тубулином и с БСА. Эти осадки, по-видимому, представляют собой образующиеся при инкубации крупные агрегаты белков, которые при аналитическом ультрацентрифугировании не выявляются, т.к. осаждаются уже в начале разгона ротора. При последующем высокоскоростном препаративном центрифугировании, как видно на рис. 14 П, осаждения индивидуальных актина, тубулина и БСА не наблюдалось. В смеси актина и БСА также не было обнаружено осадка. Только в смеси актина и тубулина наблюдалось осаждение значительного количества актина. Таким образом, опыты с применением препаративного центрифугирования подтвердили, что быстроседиментирующий материал, образующийся в смеси актина и тубулина, представляет собой актин. Обобщая полученные результаты можно заключить, что методами аналитического и препаративного ультрацентрифугирования не было обнаружено образования прочного стехиометрического комплекса между актином и тубулином в растворе: в смеси этих двук белков не наблюдалось их соосаждения; значительная часть актина и весь ту-булин седиментировали так же, как и при центрифугировании индивидуальных компонентов. Вероятно, для образования прочного комплекса с тубулином существенна стабилизация конформации актина при иммобилизации на сефарозе. Однако и в растворе тубулин, по-видимому, взаимодействует с актином.

Об этом свидетельствует образование в присутствии тубулина (но не БСА) быстроседиментирущей формы актина в условиях, когда сам по себе актин находится в мономерной форме. Возможно, что в растворе молекулы актина и тубулина не образуют прочных связей друг с другом, а вступают лишь во временное взаимодействие. Нельзя исключить и возможности того, что тубулин связывается с актином и в растворе, но входит в состав быстроседиментирующего материала в очень малом количестве, не обнаруживающемся при электрофорезе. 2.4. Выделение белкового соактота, ответственного за понижение вязкости актина экстрактом мозга Как видно из вышеизложенного, с помощью хроматографии грубого экстракта мозга на колонке с иммобилизованным актином не удалось выделить фактор, понижающий вязкость актина. Можно предположить, что искомый фактор присутствует в экстракте мозга в небольшой концентрации по сравнению с тубулином. Тубулин, по-видимому, быстро насыщает актиновую колонку и мешает обнаружению фактора, понижающего вязкость актина. Для выделения этого фактора необходимо было, во-первых, обогатить им исходный материал для аффинной хроматографии и, во-вторых, избавиться от тубулина. Поэтому на первом этапе выделения фактора мы применили обычные биохимические методы фракционирования, контролируя процесс фракционирования путем определения активности. Ниже кратко изложены предварительные опыты по фракциониро-ваниго экстракта мозга, приведшие к выработке схемы выделения фактора, понижающего вязкость. На первой стадии фракционирования мы испытали пригодность метода дробного осаждения сульфатом аммония. Белки экстракта мозга осаждали, доводя последовательно концентрацию сульфата аммония до 30, 50 и 70$. Осадки суспендировали в равных объемах буфера А, диализовали против этого буфера и определяли способность полученных фракций понижать вязкость актина. Из табл. 7, где представлены результаты, видно, что все фракции примерно в одинаковой степени понижали вязкость актина. Поскольку в использованном диапазоне концентраций сульфата аммония осаждается большая часть белков мозга, ясно, что этот метод не мог дать существенной очистки фактора. Далее была исследована возможность очистки фактора из экстракта мозга с помощью ионообменной хроматографии. Экстракт мозга в буфере В наносили на колонки с тремя ионо-ооменниками: фосфоцеллюлозой, ДЭАЭ-целлюлозой и карбоксиметил-целлюлозой. Связавшиеся с колонками белки элюировали 0,6 М EDI, диализовали против буфера А и определяли их способность понижать вязкость актина (табл. 8). Адсорбция белка, понижающего вязкость актина, наблюдалась только на ДЭАЭ-целлюлозе. С другими ионооб-менниками фактор не связывался.

Похожие диссертации на Исследование актин-связывающих белков мозга крупного рогатого скота

Терапия и профилактика бабезиозов крупного рогатого скота (экспериментальные исследования)Бобоназаров, Эшмахамад

Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадейФеофилов, Антон Владимирович

Сравнительная эффективность некоторых препаратов при пироплазмидозах крупного рогатого скота и возможности профилактики (экспериментальные исследованияКулдошев, Отамурод Уразович

Сравнительное исследование аллелофонда яков и их гибридов с крупным рогатым скотом с использованием микросателлитовАль-Кейси, Татьяна Викторовна

Исследование конформационных изменений Ф-актина при его взаимодействии с головкой миозиновой молекулы методом поляризационной микрофлуориметрииХорошев, Михаил Игоревич

Молекулярно-генетические исследования роли компонентов сигнального каскада ремоделирования актина в генезисе поведенческих нарушений Drosophila melanogasterЗахаров, Геннадий Александрович

Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилинаМихайлова Валерия Вадимовна

Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)Илатовская, Дарья Викторовна

Изоформы субъединиц актин связывающего белка САР у позвоночныхКоршунова, Юлия Олеговна

Белок, образующий с актином гель в экстракте селезенки Гиоева Фатима Константиновна