Введение к работе
Актуальность темы. Успешность решения задач общей и частной популяционной генетики многих видов, в том числе и сельскохозяйственных, зависит от изученности особенностей полиморфизма различных элементов генома (Харченко, Глазко 2006; Эрнст, 2008; Калашникова, 2010). В последнее время для этих целей широко используются микросателлитные маркеры (Зиновьева, Гладырь, 2009, 2011; Багиров и др., 2009), которые позволили по-новому взглянуть на организацию генома как целого (Зайцев, Храброва, 2011). Достижения в этой области способствовали появлению методов геномного сканирования, т.е. одновременного анализа от десятков до нескольких сотен генетических локусов (Nosil et al., 2009). Хотя к настоящему времени геномы ряда сельскохозяйственных видов полностью секвенированы, и для картирования главных генов количественных признаков широко используются оценки разнообразия по сотням тысяч однонуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) («геномная селекция», Weller, Ron, 2011), эффективность применения таких методов в селекционных программах (GEBV) не очень высока. К тому же она варьирует в зависимости от породной принадлежности (Flori et al., 2009) и эколого-географических условий разведения животных (Hammami et al., 2009).
Альтернативным направлением геномного сканирования может быть использование оценок полиморфизма длин фрагментов ДНК, фланкированных короткими инвертированными повторами; поскольку они широко представлены в геномах, такой подход позволяет охарактеризовать геном как целое. Применение микросателлитных последовательностей в качестве праймеров в ПЦР для геномного сканирования получило название ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat). Эти маркеры нашли широкое применение в популяционно-генетических исследованиях различных объектов (Глазко, 2009; Зиновьева и др., 2011). Однако, поскольку геномное распределение микросателлитов существенно отличается у разных таксонов (Santana et al., 2009), а возможные причины таких отличий до сих пор недостаточно изучены, перед использованием ISSR-PCR для геномного сканирования необходимо исследовать полиморфизм спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от корового мотива микросателлита, а также видовой и породной принадлежности животных, эколого-географических условий их воспроизводства. В связи с этим в настоящей работе выполнен сравнительный анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров, полученных с использованием в качестве праймеров различных микросателлитных мотивов, у ряда видов сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка и оптимизация методов использования ISSR-PCR маркеров для выявления и контроля генетического разнообразия генофондов некоторых видов и пород сельскохозяйственных животных.
Для этого были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Провести сравнительный анализ спектров продуктов амплификации, получаемых с использованием в качестве праймеров участков различных микросателлитов, у крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также некоторых представителей диких видов семейства Bovidae;
-
Оценить информативность спектров фрагментов ДНК, получаемых при использовании различных праймеров для геномного сканирования доместицированных видов Bovidae, а также домашней лошади;
-
Дать характеристику исследованных групп животных по доле полиморфных локусов, полиморфному информационному содержанию спектров продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров в зависимости от нуклеотидной последовательности микросателлитов, используемых в качестве праймеров;
-
Выявить получаемые в результате ISSR-PCR генетические локусы, участвующие в межвидовой и внутривидовой (межпородной) генетической дифференциации;
-
Оценить возможные источники отличий в распределении ISSR-PCR маркеров путем анализа особенностей их локализации в секвенированных последовательностях геномной ДНК с использованием международной базы данных GenBank;
-
Изучить последовательности ампликонов, демонстрирующих разнообразие на внутривидовом уровне, с целью выявления возможных причин наблюдаемых различий.
Научная новизна. В работе впервые выполнен сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, получаемых методом ISSR-PCR анализа, для представителей доместицированных и диких видов копытных. Рассмотрены особенности генетической дифференциации крупного рогатого скота, овец, лошадей по полиморфизму «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами участков микросателлитных локусов. Впервые у исследованных групп животных изучены особенности спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от нуклеотидной последовательности флангов. Получены данные о видовой и породной специфичности, консервативности и изменчивости отдельных фрагментов ДНК, присутствующих в ISSR-PCR спектрах, о возможной связи наблюдаемого полиморфизма со спецификой локализации микросателлитов в различных частях генома. Путем секвенирования показано, что источником появления отдельных фрагментов ДНК в ISSR-PCR спектрах может быть рекомбинация между участками эндогенных ретровирусов. Один из таких фрагментов у лошадей оказался ассоциированным с присутствием хромосомы Y.
Практическая значимость. Подобраны наиболее информативные полилокусные сочетания ISSR-PCR маркеров, позволяющие проследить родственные отношения между группами животных, разработать видовые, внутривидовые, породные и внутрипородные «генофондные стандарты» – совокупности ДНК фрагментов разной длины в ISSR-PCR спектрах, присутствие/отсутствие которых отличает одну группу животных от другой. Полученные результаты дают возможность предложить генетически обоснованные программы сохранения биоразнообразия редких и исчезающих видов и пород, контролировать динамику генофондов сельскохозяйственных животных в условиях искусственного и естественного отборов. Обнаруженный фрагмент ДНК в геноме лошади, ассоциированный с присутствием хромосомы Y, может быть использован для пренатальной диагностики пола эмбриона методом ПЦР-анализа.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты геномного сканирования при генотипировании нескольких десятков фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (ISSR-PCR маркеры) отражают популяционно-генетические взаимоотношения между группами животных на межвидовом, внутривидовом (породном) и внутрипородном уровнях.
2. Участки генома, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов, позволяют создавать тест-системы, устанавливающие принадлежность животного к конкретной (видовой, породной, по признаку пола) группе.
3. Полиморфизм ISSR-PCR маркеров может быть тесно связан с перемещениями и рекомбинацией мобильных генетических элементов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2011», Москва; на Международных московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии (MCCMB’09, MCCMB’11); на Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси, Жодино, 2009; на Национальной научной конференции по генетике, Болгария, 2009; на 7-ой и 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома и системной биологии (BGRS’10 и BGRS’12), Новосибирск; на Международной научной конференции «24-е генетические дни», Брно, 2010; на IX Съезде Териологического общества при РАН, Москва, 2011; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология», 2011; на конкурсе молодых ученых на лучший инновационный проект по вопросам биотехнологии, Подольск, ВИЖ, 2012.
Публикация результатов исследования. Основные результаты работы опубликованы в 21 научной статье, в том числе 9 из них в журналах, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 148 страницах и включает введение, главы «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», заключение, выводы, предложения производству, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей, 19 рисунками. Список литературы включает 167 публикаций, в том числе 108 иностранных.
