Введение к работе
Актуальность темы. Актин является одним из самых распространенных белков в природе. Он присутствует во всех эукариотических клетках, а в последнее время актино-подобные белки были обнаружены и у прокариот. Актин - глобулярный белок с молекулярной массой 42 кДа, который может существовать как в виде мономера (G-актин), так и в виде длинных полярных филаментов (F-актин), образующихся в результате полимеризации G-актина. Актиновые филаменты являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения и множества иных процессов биологической подвижности. Полимеризация актина (образование филаментов F-актина из мономерного G-актина) представляет собой обратимый динамический процесс, который сопровождается гидролизом АТФ и контролируется множеством актин-связывающих белков. Особое место среди них занимает белок кофилин, способный взаимодействовать как с мономерным G-актином, так и с филаментами F-актина, вызывая фрагментацию филаментов и значительно повышая скорость их деполимеризации. В последнее время множество работ было посвящено свойствам этого белка - главным образом, его влиянию на структуру актиновых филаментов и на динамику их сборки-разборки.
Изучение тепловой денатурации белков позволяет получать новую ценную информацию об их структуре и о тех конформационных перестройках, которые происходят в белках при моделировании процессов их функционирования. Для этого применяется метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий подробно изучать процесс тепловой денатурации белка. Этот метод давно уже успешно применяется в нашей лаборатории для структурно-функциональных исследований мышечных белков [Левицкий и др., 1998; Левицкий, 2004]. При этом, однако, до сих пор практически не проводились систематические исследования тепловой денатурации F-актина. Ясно было лишь одно - то, что это очень сложный процесс, не поддающийся описанию с использованием имеющихся моделей тепловой денатурации белка. Несмотря на значительное количество опубликованных к настоящему времени данных, механизм тепловой денатурации актиновых филаментов до сих пор оставался неизвестным и для его выяснения требовалось множество дополнительных экспериментов. Еще меньше было известно о том, как взаимодействие с различными актин-связывающими белками отражается на тепловой денатурации актиновых филаментов. Выяснение этих вопросов и составило главную цель предпринятого нами исследования.
Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало изучение тепловой денатурации F-актина и влияния актин-связывающих белков на этот процесс. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1). Методом ДСК провести исследования тепловой денатурации актиновых филаментов в широком диапазоне условий, варьируя различными факторами (такими, как концентрация белка и добавленных нуклеотидов, а также скорость прогрева), и попытаться описать механизм этого процесса.
2). Исследовать влияние актин-связывающего белка кофилина на процесс тепловой денатурации мономерного G-актина и филаментов F-актина.
Основные положения, выносимые на защиту.
На основании результатов проведенных исследований предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествуют по крайней мере две обратимые стадии - высвобождение прочно связанной АДФ из субъединиц актина и отщепление субъединиц с концов актиновых филаментов.
Применение метода ДСК впервые позволило выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина, а именно стабилизацию актиновых филаментов при стехиометрических концентрациях кофилина и сильную дестабилизацию филаментов при суб-стехиометрических концентрациях кофилина.
Научная новизна. Впервые предложен механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что актиновый филамент не денатурирует целиком как единое целое, как зачастую считалось ранее. Напротив, необратимой тепловой денатурации актиновых субъединиц в филаменте предшествуют по крайней мере две обратимые стадии - диссоциация субъединиц с концов актиновых филаментов и высвобождение из них прочно связанной АДФ. Результаты экспериментов, проведенных методом ДСК, впервые позволили выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина. Показано, что при стехиометрическом связывании (т.е. при полном насыщении актина кофилином) кофилин заметно увеличивает термостабильность как мономерного G-актина, так и филаментов F-актина. Оказалось, однако, что при низких концентрациях кофилин дестабилизирует актиновые филаменты, заметно смещая максимум теплового перехода F-актина в сторону более низкой температуры. Дестабилизация F-актина кофилином происходила с очень высокой кооперативностью и наблюдалась даже при очень низких концентрациях кофилина (при молярном отношении кофилин/актин, равном 1:100 и даже ниже). На основании этих данных был сделан вывод, что кофилин, связываясь с F-актином, стабилизирует те его субъединицы, с которыми он непосредственно связывается, но с высокой кооперативность дестабилизирует множество соседних субъединиц в актиновом филаменте, свободных от кофилина.
Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации сложных олигомерных белков и их комплексов и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Дестабилизация F-актина кофилином, обнаруженная нами впервые методом ДСК, может играть важную роль в динамике актиновых филаментов в живой клетке, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций -ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Калориметрические подходы, разработанные при исследованиях комплексов актина с кофилином, могут в дальнейшем успешно использоваться для изучения взаимодействия мономерного G-актина и филаментов F-актина с другими актин-связывающими белками.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на III Съезде биохимического общества (г. Санкт-Петербург, 2002), на 31-й, 32-й, 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (г. Люнтерен, Нидерланды, 2002; г. Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г. Гейдельберг, Германия, 2006), на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2004; 2006) и на 30-м Международном конгрессе FEBS (г. Будапешт, Венгрия, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (2
главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников).
Диссертация изложена на страницах, содержит 24 рисунка и 1 таблицу.
