Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1. Дефекты системы эксцизионнои репарации нуклеотидов наследственные заболевания. идентификация факторов репарации 9
1.1.1. Заболевания человека, вызванные дефектами системы эксцизионной репарации нуклеотидов 9
1.1.2. Идентификация генов и белков, участвующих в NER 13
1.2. Организация эксцизионной репарации нуклеотидов 17
1.2.1. Модели сборки репарационного комплекса в репарации целого генома 17
1.2.2. Репарация, связанная с транскрипцией 19
1.3. Узнавание повреждения в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов 21
1.3.1. Модели узнавания повреждения: "ХРС первый", "ХРА первый" или "RPA первый" 21
1.3.2. Модель двухкомпонентного узнавания повреждений ДНК 23
1.4. Факторы эксцизионной репарации нуклеотидов 24
1.4.1. Комплекс XPC-hHR23B - потенциальный сенсор неспаренных оснований 24
1.4.2. Функции UV-DDB в эксцизионной репарации нуклеотидов 28
1.4.2.1. Роль UV-DDB в узнавании повреждений 28
1.4.2.2. Участие UV-DDB в реорганизации хроматина 32
1.4.2.3. UV-DDB и убиквитинилирование 33
1.4.3. Роль ХРА и RPA в NER 33
1.4.4. TFIIH: раскрытие ДНК вокруг повреждения 37
1.4.5. XPG и ERCC1-XPF: двойное разрезание поврежденной цепи эндонуклеазами 39
1.4.6. Застройка одноцепочечной бреши (ресинтез ДНК) 42
1.4.7. Дополнительные функции белков эксцизионной репарации нуклеотидов 43
1.4.1.7.1. Роль TFI1Hв транскрипции 43
1.4.7.2. Участие белков NER в эпигенетическом контроле 44
1.4.7.3. Стимулирование системы BER: участие в спонтанном мутагенезе 44
1.4.7.4. Участие ХР-генов в контроле клеточного цикла и апоптозе 46
1.4.7.5. Роль ERCC1-XPF в других путях репарации 47
1.5. Регуляция процесса эксцизионной репарации нуклеотидов с помощью посттрансляционной модификации 50
Заключение 51
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 53
2.1. Материалы 53
2.2. Методы исследования 59
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного ХРА человека, экспрессированного в клетках Е. coli 59
2.2.2. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков в ПААГ 61
2.2.3. Введение С Р)-метки по 5'-концу олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов 63
2.2.4. Формирование ДНК-дуплексов 63
2.2.5. Удлинение ДНК-праймера, катализируемое Pol /3 (введение модифгщированных dNTP в 3 '-конец праймера) 64
2.2.6. Лигирование одноцепочечногоразрыва (пика), катализируемое ДНК-лигазой фага Т4 (получение олигонуклеотидов с модифицированным dNMP в середине ijemi)64
2.2.7. Комплексообразование белков с ДНК (метод задержки в геле) 65
2.2.8. Фотоаффинная модификация белков 65
2.2.9. Конструирование двухцепочечной плазмиды, содержащей модифицированные dNMP 66
2.2.10. Вырезание повреждения системой NER 61
2.2.11. Идентификация продуктов модификации XPC-hHR23В помощью иммуноблоттинга 68
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 70
РАЗДЕЛ 3.1 . Фотоактивные нуклеотиды имитируют повреждения, выщепляемые системой эксцизионнои репарации нуюіеотидов . 70
3.1.1. Конструирование олигонуклеотидов, содержагцих фотоактивируемую группу в середине цепи 71
3.1.2. Конструирование двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивируемую группу 72
3.1.3. Выщепление повреждения из двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивную группу, в клеточном экстракте HeLa 73
РАЗДЕЛ 3.2 . Взаимодействие xpc-hr23b с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов 78
3.2.1. Взаимодействие XPC-HR23В с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреждения фотореащионноспособные производные нуклеотидов -FAP-dCMP и FAP-dUMP 79
3.2.2. Взаимодействие XPC-HR23B с модельными ДНК-структурами, содерэюащими фотореащионноспособные остатки в поврежденной и неповрежденной цепи 84
РАЗДЕЛ 3.3. Взаимодействие хра и rpa с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов 88
5.5.7. Взаимодействие RPA и ХРА с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреэюдения фотореакционноспособные производные нуклеотидов - FAP-dCMP и FAP-dUMP 88
3.3.2. Взаимодействие ХРА и RPA с модельными ДНК-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов в поврежденной и неповрежденной цепи 96
3.3.3. Взаимодействие RPA и ХРА с модельными фотоактивными ДНК-структурами, содерэюащими модифицированный dNMP на 3'- и 5 '-конце одноцепочечного разрыва 101
РАЗДЕЛ 3.4. Влияние rpa и хра на взаимодействие xpc-hr23b с модельными фотореакционноспособными днк-структурами 107
3.4.1. Влияние RPА и ХРА на модификацию XPC-HR23B с фотоактивируемыми ДНК-структурами, содерэюащими FAP-dCMP 107
3.4.2. Влияние RPA и ХРА на эффективность комплексообразования XPC-hHR23B с ДНК ПО
Заключение 114
Выводы 117
Список литературы 118
- Дефекты системы эксцизионнои репарации нуклеотидов наследственные заболевания. идентификация факторов репарации
- Материалы
- . Фотоактивные нуклеотиды имитируют повреждения, выщепляемые системой эксцизионнои репарации нуюіеотидов .
- . Взаимодействие xpc-hr23b с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов
Введение к работе
Одной из важнейших фундаментальных задач современной биохимии и молекулярной биологии является исследование механизмов хранения и реализации генетической информации. Основным носителем генетической информации является ДНК. ДНК в клетке постоянно подвергается воздействию как эндогенных реакционноспособных метаболитов, так и экзогенных факторов, таких как химические вещества и УФ-излучение (Lindahl Т. and WoodR.D. 1999). Для того чтобы генетическая информация передавалась из поколения в поколение в неповрежденном виде, необходимо сохранение структуры ДНК. В процессе эволюции живых организмов возникло множество механизмов репарации ДНК и их контроля в течение клеточного цикла, которые обеспечивают целостность ДНК, предотвращая последующие генетические изменения, приводящие к возникновению рака и старению (Friedberg Е.С., Walker G.C., Siede W. 1995; HoeijmakersJ.H. 2001; WoodR.D. et al. 2001; ScharerO.D. 2003). Одним из важнейших путей репарации ДНК является эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER). Этот процесс обеспечивает удаление широкого набора повреждений, нарушающих двойную спираль ДНК: например, пиримидиновых димеров, образующихся под действием УФ-света, или объемных химических аддуктов, возникающих в результате воздействия факторов окружающей среды, либо при химиотерапевтическом воздействии.
NER - сложный процесс, который требует координированного действия, по меньшей мере, 25-30 полипептидов (Wood R.D. et al. 2001). Репарация поврежденной ДНК является многостадийным процессом, включающим узнавание повреждения, выщепление поврежденного участка, заполнение образовавшейся бреши (ресинтез) и восстановление целостности цепи ДНК путем лигирования (de Laat W.L., Jaspers N.G., Hoeijmakers J.H. 1999; Volker M. et al. 2001). Существуют два пути NER: репарация целого генома (global genome repair, GG-NER), которая удаляет повреждения во всем геноме, а также репарация, связанная с транскрипцией (transcription-coupled repair, TC-NER). Последний путь репарации ограничивается удалением повреждений в транскрибируемой цепи ДНК транскрибируемых генов и тесно связан с функционированием РНК-полимеразы II (RNApolII) (LeadonS.A. and Lawrence D.A. 1991; VenemaJ.J. et al. 1992; ScharerO.D. 2003). Остановка RNA pol II на повреждении служит сигналом для сборки комплекса белков, осуществляющих репарацию. В случае GG-NER узнавание повреждения представляет собой наиболее сложный этап, механизм которого до сих пор окончательно
не определен, несмотря на значительные результаты, полученные различными методами, в том числе in vivo. До сих пор нет единого мнения о том, какой из факторов NER первым узнает повреждение. До конца не изучена последовательность сборки комплекса факторов NER на поврежденной ДНК, состав и время жизни определенных промежуточных структур, а также точный механизм реакции.
Физические методы исследования отдельных белков и комплексов белков с лигандами, такие как рентгеноструктурный анализ (РСА) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), наиболее информативны и эффективны для изучения отдельных белков и некоторых простых комплексов ДНК с белками. В то же время каждый из этих методов имеет свои ограничения. Например, РСА пока мало пригоден для изучения сложных многокомпонентных комплексов из-за трудностей получения кристаллов таких структур. Кроме того, РСА не дает представления о динамике взаимодействия компонентов комплекса. И, наконец, всегда остается сомнение, применимы ли данные, полученные для кристаллов, к комплексам в растворе и, тем более, ш vivo. Метод ЯМР является достаточно дорогим в связи с необходимостью использовать большие количества исследуемого биополимера, кроме того, существуют очень жесткие ограничения на размер изучаемого объекта.
В связи с этим, одним из наиболее перспективных подходов является метод фотоаффинной модификации. Данный метод основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, практически не влияющей на специфическое узнавание и связывание его ферментом. Подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером и последующее ковалентное присоединение аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр белка или находящимся в непосредственной близости от активного центра. Полученные структурные данные позволяют сделать вывод о расположении и организации участков связывания субстратов в молекуле биополимера. Подход наиболее эффективен при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур. Использование широкого спектра фотоаффинных реагентов, обладающих самой различной эффективностью и селективностью модификации биополимера, открывает возможности исследования комплексов различной структуры и сложности. Данный подход позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белка с лигандом, являющиеся промежуточными в динамичных процессах репликации и репарации ДНК.
Для того чтобы исследовать процесс NER, были сконструированы ДНК-структуры, содержащие объемные фотореакционноспособные группы, имитирующие повреждения
ДНК, удаляемые системой NER. Использование укороченных модельных ДНК-дуплексов, содержащих повреждения, может позволить исследовать отдельные этапы NER, в частности стадию узнавания повреждения ДНК.
Целью данной работы было создание и тестирование фотореакционноспособных ДНК-субстратов для исследования механизма распознавания повреждения в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов.
В ходе исследования планировалось решить следующие задачи.
Конструирование и синтез модельных ДНК-субстратов, содержащих объемные химические аддукты, в том числе арилазидопроизводные нуклеотидов.
Проверка фотореакционноспособных ДНК в качестве субстратов системы NER эукариот в экстрактах клеток HeLa, содержащих полный комплекс NER.
Исследование взаимодействия фотореакционноспособных ДНК с индивидуальными препаратами факторов репарации XPC-hHR23B, RPA и ХРА методами фотоаффинной модификации и задержки в геле для того, чтобы определить композицию комплексов NER на стадии узнавания повреждения.
Дефекты системы эксцизионнои репарации нуклеотидов наследственные заболевания. идентификация факторов репарации
Дефекты в системе NER вызывают серьезные врожденные заболевания, такие как пигментная ксеродерма (xeroderma pigmentosum, ХР), синдром Коккейна (Cockane syndrome, CS) и трихотиодистрофия (trichothiodistrophy, TTD). Для всех этих заболеваний характерна повышенная чувствительность к солнечному свету. Все синдромы отличаются генетической гетерогенностью, проявляющейся в тяжести заболевания. На основании экспериментов по слиянию клеток (см. ниже), пациенты, страдающие этими заболеваниями, делятся на несколько классов: ХР-пациенты (7 групп, от ХР-А до XP-G), CS-пациенты (2 группы, CS-A и CS-B), пациенты с комбинированными XP/CS-синдромами (3 группы, ХР-В, XP-D и XP-G), TTD-пациенты (3 группы, ХР-В, XP-D, TTD-А) и пациенты с комбинированными XP/TTD синдромами (группа XP-D). Разным группам соответствуют дефекты в разных генах. Примечательно, что различные мутации в генах ХРВ, XPD и XPG приводят к разным синдромам. Кроме того, спектр клинических симптомов для всех трех заболеваний сильно отличается (Bootsma D. et al. 1998), причем ряд нарушений у CS- и TTD-пациентов вряд ли является следствием дефектов только системы NER.
Пигментная ксеродерма впервые была описана в 1874 г. (von Hebra F. and Kaposi M. 1874). Наиболее примечательный признак этого заболевания — это пергаментная пигментированная кожа. В некоторых случаях синдром сопровождается прогрессивным дегенеративным старением клеток кожи и глаза (BootsmaD. et al. 1998). Данным заболеванием страдает 1 человек из 250000 в западных странах и 1 из 40000 в Японии и Северной Африке (Friedberg Е.С., Walker G.C., Siede W. 1995). Показано, что данное заболевание вызвано мутациями в одном из генов ХРА, ХРВ, ХРС, XPD, ХРЕ, XPF или XPG. У пациентов с ХР-синдромом частично или полностью дефектна система GG-NER и, за исключением ХРС- и ХРЕ-пациентов, система TC-NER.
Пигментная ксеродерма характеризуется повышенной предрасположенностью к раку кожи ( 1000 раз по сравнению со здоровыми людьми). Обычно рак возникает в местах, подверженных воздействию солнечного света. Многие больные умирают от рака в возрасте около 30 лет. Кроме того, у многих ХР-пациентов в 10-20 раз превышен риск возникновения рака внутренних органов (Kraemer К.Н., Lee М.М., Scotto J. 1984). Принимая во внимание тот факт, что система NER удаляет повреждения ДНК, вызванные как экзогенными химическими веществами, так и клеточными метаболитами, любая из этих групп повреждений может быть причиной возникновения новообразований внутренних органов. Около 20 % ХР-пациентов страдает прогрессирующими неврологическими нарушениями. Возможное объяснение появления таких нарушений состоит в том, что дефекты репарации повреждений ДНК, вызванных эндогенными (окислительными) факторами, приводят к гибели нейронов (Reardon J.T. et al. 1997).
Как уже отмечалось выше, генетическая гетерогенность пигментной ксеродермы приводит к различной чувствительности к солнечному свету и различным неврологическим отклонениям. Тяжелые нарушения системы NER наблюдаются у ХР-А-, XP-B-, XP-D- и XP-G-пациентов (BootsmaD. et al. 1998). Однако у последних двух групп всегда присутствует остаточная репарационная активность. Фактически, группа XP-D тоже неоднородна, и остаточная репарационная активность в некоторых случаях может быть 50 %. Одиночные мутации в XPDQUQ обнаружены у ХР-, CS- и TTD-пациентов. Инактивирующие делеции или усекающие мутации в XPD-гене несовместимы с жизненно важной функцией белка в транскрипции. Умеренная чувствительность к УФ-свету и средний уровень репарационного синтеза, характерные для XP-F-пациентов, могут быть следствием двойной роли XPF-ERCC1 в NER и репарации межцепочечных сшивок (interstrand crosslink, ICL) (Davies A.A. et al. 1995). Нулевые аллели XPF или ERCC1 и последующие нарушения в репарации ICL могут быть несовместимы с жизнью. Что касается белка ХРС, то он необходим только для GG-NER. ХР-С-пациенты демонстрируют восприимчивость к солнечному свету в той же степени, что и здоровые люди, из-за того, что блокирующие транскрипцию повреждения удаляются в норме (Venema J. et al. 1990). В ХР-С-клетках за счет активности TC-NER уровень остаточного репарационного синтеза составляет 15-30 %. Эти клетки менее чувствительны к УФ, чем клетки ХР-А и XP-D (Bootsma D. et al. 1998).
Синдром Коккейна впервые описан в 1936 г. Это плейотропное заболевание сопровождается задержкой физического и умственного развития. Кроме повышенной чувствительности к УФ-свету, синдром Коккейна сопровождается такими симптомами, как низкий рост, кифоз позвоночника, "птичье" лицо, разрушение зубов и, у более старших пациентов, остеопороз (Cockayne Е.А. 1936). Прогрессирующая неврологическая деградация начинается рано и сопровождается задержкой психомоторного развития, нарушениями походки и умственной отсталостью. К другим типичным симптомам относятся нейросенсорная потеря слуха, пигментарная ретинопатия, появление лицевых морщин и катаракты. У больных нарушено половое развитие, отмечается задержка роста, причем отставание в весе больше, чем в росте (кахектическая карликовость). Продолжительность жизни в среднем составляет 12,5 лет. Основная причина смерти -воспаление легких и респираторные инфекции, которые легко развиваются благодаря общему плохому состоянию пациентов. В отличие от пигментной ксеродермы, для данного синдрома не характерна повышенная предрасположенность к раку кожи (Svejstrup J.Q. 2002).
Выявлено, что у CS-пациентов дефектна система TC-NER (за счет мутаций в генах CSA и CSB). Некоторые симптомы, например, характерную внешность, трудно объяснить только дефектами системы NER, поскольку, например, ХР-А-пациенты такими признаками не обладают. Предполагается, что такие симптомы могут быть результатом нарушения транскрипции, индуцируемого повреждением ДНК (van Gool A.J. et al. 1997). Кроме того, эндогенные (окислительные) повреждения могут приводить к возникновению дефектов развития. У мышей, нокаутных по CSB, наблюдаются мягкие CS-симптомы, в то же время мыши с двойной мутацией CSB/XPA страдают значительной задержкой роста и умирают до прекращения вскармливания молоком (deBoer J. and Hoeijmakers J.H. 1999). Дефект TC-NER окислительных повреждений ДНК наблюдался в CS-, но не в ХР-А-клетках (LeadonS.A. and Cooper Р.К. 1993). Среди XP-G-пациентов имеются люди с комбинированными признаками пигментной ксеродермы и синдрома Коккейна. Дефект TC-NER окисленных оснований был обнаружен в клетках именно этих пациентов и не выявлен в клетках XP-G-пациентов ХР-типа (Cooper Р.К. et al. 1997). Этот факт говорит о связи дефектов репарации окислительных повреждений и CS-симптомов.
Материалы
В работе использовали dATP, dCTP, dGTP, dTTP "Биосан", Россия); маркеры молекулярной массы белков 220,0-14,3 кДа (High-Range Rainbow, "Amersham", Великобритания) или 250,0-10,0 кДа (Precision Plus Prestained или Precision Plus Unstained "BioRad", США); глицин, изопропил-р-Б-тиогалактозид (IPTG), глицерин, имидазол, EDTA, апротинин, кумасси G-250 и R-250, DTT, фосфокреатин (дитрисовая соль), BSA, HEPES ("Sigma", США); Tris, г4,Ы -метиленбисакриламид, мочевина ("Amresco", США); акриламид, ТЕМЕД ("Helicon", Россия); MgCb, формамид, Р-меркаптоэтанол, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), имидазол ("Serva", Германия); бромфеноловый синий, ксиленцианол, формамид, SDS ("Fluka", Швейцария), смесь ингибиторов протеаз ("Roche", Германия); бензамидин ("ICN", США); персульфат аммония ("Merck", Германия) DEAE-бумагу DE-81 ("Whatman", Великобритания); бакто-агар и компоненты питательной среды: триптон и дрожжевой экстракт ("Диаэм", Россия); бромистый этидий ("BioRad", США); CsCl и агарозу ("Gibco BRL", США); нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм ("Milhpore", США); рентгеновскую пленку "Fuji" (Япония) или "Agfa" (Германия). В работе использовались следующие хроматографические сорбенты: гепарин-сефароза ("Pharmacia", Швеция), 1ЧТА-№2+-Сефароза CL-6B (НПО "Вектор", Россия), фосфоцеллюлоза Р-11 ("Whatman", Великобритания), MicroSpin G-25 ("Amersham Pharmacia Biotech", США). Остальные реагенты были отечественного производства и имели квалификацию ос.ч. или х.ч.
В работе использовали (у-32Р)АТР с уд. акт. 3000-5000 Ки/ммоль, (a-32P)dCTP с удельной активностью 5000 Ки/ммоль (производства Биотехнологической лаборатории, ИХБФМ СО РАН, Россия, или "Атегзпат",Великобритания). Фотоактивные производные FAP-dCTP - экзо-Ы-{2-(г [-(4-азидо-2,5-дифтор-3 хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил)аминоэтил}-2 -дезоксицитидин-5 -трифосфат и FAP-dUTP - 5-{Н-(М-(4-азидо-2,5-дифтор-3-пиридин-б-ил)-3-аминопропионріл)-транс-3 аминопропенил-1 }-2 -дезоксиуридин-5 -трифосфат любезно предоставлены СВ. Дежуровым (ИХБФМ СО РАН) (рис. 8). Фотоактивное производное Thio-dUTP - 4-(тио)-2 -дезоксиуридин-5 -трифосфат любезно предоставлено B.C. Богачевым (рис. 8). Антраценовое производное Anthr-dCTP - экзо-М-(4-(9-антраценилгидразинкарбонил) бутил-карбамоил)-2 -дезоксицитидин-5 -трифосфат И.В. Сафроновым (ИХБФМ СО РАН) (рис. 8). В работе использовали вакуумную сушку для акриламидных гелей "ColeParmer" (США), рН-метр "ОР 211/1" (Венгрия), счетчик радиоактивности "Электроника D2-10M" (Россия), центрифуги "Centricon Т-42К" (Италия) и "Eppendorf 5415" (Германия), осветитель ВИО-1, "Ломо" (Санкт-Петербург, Россия) и система для облучения "BIO-LINK (BLX)" (Франция). Хроматографическое оборудование "LKB" (Швеция) и "FPLC system" (Франция). Распределение радиоактивности в высушенных гелях определяли с использованием системы "Molecular Imager" и программного обеспечения "QuantityOne" ("BioRad", США). Буферные растворы Для приготовления всех буферных растворов (табл. 2) и реакционных проб использовали дважды дистиллированную воду. Воду и все буферы подвергали стерилизации автоклавированием или фильтрованием через поливиниловый или нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм) производства "Nalgene" или "Millipore" (США). Табл. 2. Состав буферов и сред, использованных в работе
Векторы экспрессии и штаммы Е. coli Для экспрессии рекомбинантных белков в работе использовали штамм Е. coli BL21DE3(pLysS). Плазмиды pET15b, содержащая фрагмент гена ХРА человека с дополнительной последовательностью, кодирующей шесть остатков гистидина на N-конце рекомбхшантного белка, и pBlueScript II KS (+) были любезно предоставлены др. О. Шерером (SUNY Stony Brook, США). Плазмида pET24d, содержащая фрагмент гена hHR23B человека с дополнительной последовательностью, кодирующей шесть остатков гистидина на С-конце рекомбинантного белка, была любезно предоставлена др. К. Сугасавой (Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Япония). Ферменты, белковые факторы, антитела, экстракты и клеточные линии В работе были использованы полинуклеотидкиназа фага Т4 и ДНК-лигаза фага Т4 ("Биосан", Россия или "BioLabs", Великобритания), фосфокиназа креатина (2,5 мг/мл, "Sigma", США) и модифицированная ДНК-полимераза фага Т7 (секвеназа, "UBS", США). Рекомбинантный RPA человека был выделен, как описано ранее (Henricksen L.A. et al. 1994), и любезно предоставлен И.О. Петрусевой (ЛБХФ, ИХБФМ СО РАН). Рекомбинантная ДНК-полимераза р (Pol р) была выделена по протоколу (Драчкова И.А. и др. 2001) и любезно предоставлена С.Н. Ходыревой (ЛБХФ, ИХБФМ СО РАН). Экстракт клеток HeLa, выделенный по протоколу (Biggerstaff М. and Wood R.D. 1999), и препараты рекомбинантного белка XPC-hHR23B бьши любезно предоставлены О. Шерером (SUNY Stony Brook, США). В работе использовали препараты белка ХРА человека, как выделенные в ЛБХФ ИХБФМ, так любезно предоставленные О. Шерером (SUNY Stony Brook, США) и В. Вермойленом (Erasmus Medical Centre, Нидерланды). Поликлональные антитела кролика против ХРС любезно предоставлены Дж. Ангуло и Л. Микколи (СЕА, Fontenay-aux-Roses, Франция). В работе использовали конъгогаты моноклональньгх антител кролика против IgG кролика с пероксидазой хрена ("Биосан", Россия). Олигонуклеотиды В работе были использованы синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, не содержащие модификаций в цепи, производства "Metabion" (Германия) и лаборатории Медицинской Химии (ИХБФМ СО РАН, Россия). Олигонуклеотиды, содержащие фотоактивное производное AAF-dGMP - 8-(N ацетиламинофлюорен)-2 -дезоксигуанозин-5 -монофосфат, синтезированы и любезно предоставлены Л. Жилле (Institute of Molecular Cancer Research, Швейцария) (рис. 8). Олигонуклеотиды, содержащие фотоактивное производное FAB-dUMP - 5-{(4-(4-азидо 2,3,5,6-тетрафторбензоиламшю) бутил)-аминокарбонил-карбамоил-пропил-оксиметил}-2 дезоксиуридин-5 -монофосфат синтезированы и любезно предоставлены В.Н. Сальниковым (ИХБФМ СО РАН) (рис. 8).
. Фотоактивные нуклеотиды имитируют повреждения, выщепляемые системой эксцизионнои репарации нуюіеотидов .
Система NER является уникальной системой репарации, способной с помощью одного и того же набора белков репарации удалять широкий спектр различных по структуре повреждений ДНК, которые возникают как под действием "привычных" для организма факторов (УФ-облучение), так и абсолютно новых агентов (химические вещества, в т. ч. лекарственные препараты). Основными субстратами NER являются фотоповреждения (циклобутанпиримидиновые димеры и (б-4)-фотопродукты) и объемные аддукты ДНК (аддукты с бензо(а)пиреном, ацетиламинофлюореном и т.д.). Исходя из широкой субстратной специфичности NER, мы предположили, что замещенные по основанию производные нуклеотидов, содержащие фотореакционноспособные арилазидогруппы, присоединенные протяженными линкерами, могут быть использованы для имитации повреждений ДНК, репарируемых данной системой. Эти заместители являются достаточно объемными, и, как было показано ранее, ДНК, содержащие такие остатки, являются субстратами бактериальной системы эксцизионной репарации нуклеотидов UvrABC - аналога эукариотической системы NER (DellaVecchia M.J. et al. 2004). Чтобы подтвердить это предположение в отношении системы NER высших эукариот, мы исследовали ДНК, содержащие модифицированные остатки dCMP и dUMP, в качестве субстратов NER в экстрактах, полученных из клеток HeLa. Из литературных данных известно, что для эффективного узнавания и удаления поврежденного нуклеотида требуется достаточно протяженная ДНК (минимальный размер субстрата NER составляет около 100 н.о. (Huang J.C. and SancarA. 1994)). Существует два основных подхода к созданию протяженных структур, содержащих единичное повреждение. В первом случае конструируют линейные двухцепочечные ДНК длиной около 150 п.н. Для этой цели короткий олигонуклеотид, содержащий повреждение, лигируется с серией частично комплементарных олигонуклеотидов (HessM.T. et al. 1997а, Huang J.C. and SancarA. 1994). Во втором случае повреждение вводят в кольцевые двухцепочечные ДНК (плазмиды) (Wang Z.G., Wu Х.Н., Friedberg Е.С. 1991; SugasawaK., Masutani С, HanaokaF. 1993). Следует отметить, что оба способа довольно трудоемки и имеют достаточно низкий выход. Однако второй способ более привлекателен, поскольку полученные плазмиды можно использовать не только для изучения репарации in vitro, но и для трансформации клеток и изучения других биологических процессов, в частности мутагенеза. Конструирование олигонуклеотидов, содержащих фотоактивируемую группу в середине цепи На первом этапе были синтезированы 60-мерные олигонуклеотиды, комплементарные (+)-цепи плазмиды pBluescript II KS и содержащие внутри цепи фотоактивируемые аналоги нуклеотидов (FAP-dUMP и FAP-dCMP). Для этой цели путем сплавления соответствующих олигонуклеотидов конструировали ДНК-дуплекс, содержащий мононуклеотидную брешь (рис. 9, а). Фотоактивируемые нуклеотиды вводили в 3 -конец бреши с помощью ДНК-полимеразы Р (Pol р), используя в качестве субстратов соответствующее производное dNTP (FAP-dUTP или FAP-dCTP, рис. 9, б). Образующийся после достройки одноцепочечный разрыв (ник) лигировали ДНК-лигазой фага Т4 (рис. 9, в). Полученный фотоактивный 60-мер, содержащий в центре цепи фотореакционноспособный остаток dNMP, выделяли с помощью гель-электроэлектрофореза в денатурирующих условиях (рис. 9, г).
На втором этапе была разработана процедура введения фотоактивируемых остатков dNMP в кольцевые плазмидные ДНК. Для этого 60-мер, содержащий фотоактивный остаток, предварительно фосфорилировали по 5 -концу полинуклеотидкиназой фага Т4 (для обеспечения эффективного лигирования на последующих стадиях). Затем фосфорилированный по 5 -концу фотоактивный 60-мер (п. 3.1) отжигали с (+)-цепью плазмиды pBluescript II KS в условиях 4-х кратного избытка олигонуклеотида (рис. 10, а) и использовали в качестве праймера в реакции синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой фага Т4 (рис, 10, б). Образующийся одноцепочечный разрыв лигировали. с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (рис. 10, б; 11, а). Полученную двухцепочечную кольцевую ДНК очищали при помощи центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия (EtBr) с последующим удалением EtBr экстракцией бутанолом, концентрированием и обессоливанием с помощью Centncon YM-30 (рис. 10, в; 11, б). Полученную ДНК очищали дополнительно от следов непрореагировавшего фотоактивного 60-мера с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 10, в).
Выщепление повреждения из двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивную группу, в клеточном экстракте HeLa На третьем этапе анализировали возможность репарации модифицированных нуклеотидов, содержащих фотореакционноспособные группы, системой NER в клеточном экстракте HeLa (рис. 10, в). Для детекции продуктов реакции NER применяются два основных подхода: определение вновь синтезируемого олигонуклеотида на стадии ресинтеза ДНК либо слежение за выщепляемыми олигонуклеотидами. В первом случае в реакционную смесь добавляют [а-32Р]-меченый dNTP, который используется как субстрат ДНК-полимеразы на стадии ресинтеза ДНК. Для детекции выщепленного поврежденного нуклеотида используют прямые и непрямые способы. Прямой способ детекции требует при создании ДНК-структур введения вблизи повреждения радиоактивной метки, как правило, это [ Р]. Выщепленный олигонуклеотид легко определяется сразу же после электрофоретического разделения продуктов реакции без дополнительных манипуляций. Однако период полураспада [ Р] составляет всего 14 дней, что позволяет использовать ДНК-субстраты только в течение небольшого периода времени. В связи с этим были разработаны непрямые способы детекции выщепленного олигонуклеотида, несущего повреждение. В этом случае радиоактивная метка в ДНК-субстрат не вводится, что позволяет наработать сразу большое количество ДНК, заморозить и расходовать по мере необходимости. Можно выделить два наиболее распространенных непрямых способа детектирования: блоттнпг по Саузерну и 3 -концевое радиоактивное мечение (Shivji М.К. et al. 1999). В первом случае осуществляется перенос продуктов выщепления на нитроцеллюлозную мембрану с последующей гибридизацией с радиоактивно меченным комплементарным зондом. Во втором случае на 3 -конец выщепляемого олигонуклеотида с помощью ДНК-полимеразы вводятся радиоактивно меченные dNMP. В качестве матрицы для полимеразной реакции выступает комплементарный олигонуклеотид с 5 -выступающим концом, содержащим несколько остатков нуклеотида, комплементарного используемому в реакции радиоактивно меченному [a-32P]-dNTP. Метод 3 -концевого радиоактивного мечения прост и удобен, однако требует знания места 3 -расщепления для подбора комплементарного нуклеотида.
. Взаимодействие xpc-hr23b с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов
Процесс удаления повреждения ДНК системой NER является многостадийным и включает в себя узнавание повреждения, "расплетание" ДНК вблизи повреждения, вырезание поврежденного олигонуклеотида и застройку образовавшейся одноцспочечной бреши. Для осуществления процесса вырезания повреждения in vitro необходимо шесть факторов репарации: XPC-hHR23B, ХРА, RPA, TFIIH, XPG и ERCC1-XPF (Mu D. et al. 1995; Araujo S.J. et al. 2000; Araki M. et al. 2000; Aboussekhra A. et al. 1995). XPC-hHR23B, ХРА и RPA участвуют в узнавании повреждения, TFIIH обладает геликазной активностью и "расплетает" поврежденную ДНК, эндонуклеазы XPG и ERCC1-XPF разрезают ДНК с обеих сторон от повреждения. Стадия узнавания представляет для нас наибольший интерес, поскольку до сих пор, несмотря на многочисленные исследования различных групп ученых, она остается наименее детально охарактеризованной. В частности, до сих пор обсуждаются вопросы, какой именно репарационный фактор узнает повреждение и каков порядок сборки репарационного комплекса на поврежденной ДНК.
Одним из перспективных и эффективных инструментов для изучения архитектуры репарационного комплекса является метод фотоаффинной модификации. Суть метода состоит в образовании под действием УФ-облучения ковалентных сшивок между несущим фотореакционноспособную группу донором (например, ДНК), и акцептором (белки и нуклеиновые кислоты). Как было показано п. З.1.З., двухцепочечные кольцевые плазмидные ДНК, содержащие фотореакционноспособные аналоги dNMP, FAP-dCMP и FAP-dUMP, являются субстратами системы NER в экстрактах клеток HeLa. Таким образом, фотоактивируемые аналоги dNMP имитируют повреждения, удаляемые в процессе NER, и содержащие их ДНК могут быть использованы в дальнейшем для изучения архитектуры и последовательности сборки репарационных комплексов на различных этапах репарации. Данный метод позволяет выявить, возможные контакты между фоторекционноспособным нуклеотидом и белками NER. Вводя фотореакционноспособные группы в различные ДНК-структуры (и в различные их участки), можно получить информацию о том, какие белки и их субъединицы контактируют с тем или иным участком ДНК на разных этапах репарации. Еще одним важным достоинством метода фотоаффинной модификации является возможность фиксации нестабильных (или промежуточных) комплексов NER, что также позволит расширить представление о молекулярном механизме процесса репарации. Несмотря на то, что минимальный размер NER-субстрата составляет около 100 н.о. (Huang J.C. and Sancar А. 1994), для узнавания повреждения и посадки отдельных факторов на ДНК, вероятно, требуется менее протяженная ДНК-структура. В частности, известно, что для образования стабильного комплекса RPA с ДНК достаточно 30 н.о. (Wold M.S. 1997). Известно, что эффективность связывания XPC-hHRB с ДНК возрастает с увеличением длины ДНК, тем не менее, для достаточно прочного комплекса этого белка как с одноцепочечной, так и с двухцепочечной ДНК достаточно 45 н.о. (Reardon J.T., MuD., Sancar А. 1996). В связи с этим взаимодействие отдельных факторов репарации с ДНК мы решили исследовать на более коротких, по сравнению с субстратами NER, модельных ДНК-дуплексах длиной 60 и 48 п.н.
На сегодняшний день многие авторы считают, что XPC-hHR23B является наиболее вероятным белковым фактором первичного узнавания повреждения (Sugasawa К. et al. 1998; Batty D. et al. 2000; Naegeli H. 1995). Представляло интерес выявить, существует ли корреляция между эффективностью репарации и сродством XPC-hHR23B к поврежденной ДНК. Взаимодействие XPC-HR23B с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреждения фотореакционноспособные производные нуклеотидов - FAP-dCMP и FAP-dUMP Чтобы исключить влияние характера нуклеотидной последовательности при сравнении эффективности процесса репарации и эффективности комплексообразования XPC-hHR23B с поврежденной ДНК, на первом этапе в качестве модельных ДНК-субстратов было решено использовать фотореакционноспособные ДНК-дуплексы длиной 60 п.н. Нуклеотидная последовательность этих ДНК-структур соответствовала модифицированному участку плазмиды pBlueScript IIKS, синтезированной в п.3.1.2. Сначала ферментативным путем получали 60-мерные олигонуклеотиды, содержащие фотореакционноспособные "повреждения" (рис. 8). Далее полученные фотоактивные олигонуклеотиды использовали в одноцепочечной форме (60ssCFAP, 60ssUFAP) или сплавляли с 60-мерным олигонуклеотидом, последовательность которого полностью соответствовала участку (+)-цепи плазмиды pBlueScript IIKS (положения 691-743), для получения полных ДНК-дуплексов (60dsCFAP и 60dsUFAP). Из литературных данных известно, что эффективность репарации повреждений зависит от степени нарушения спирали ДНК вблизи повреждения (GunzD., Hess М.Т., Naegeli Н. 1996; Huang J.C. et al. 1994). Поэтому для увеличения уровня дестабилизации ДНК были сконструированы структуры ДНК, в которых фотоактивируемые группы вводились в короткие некомплементарные участки длиной три нуклеотида (60mmC , 60mmU ). Модификация XPC-hHR23B фотоактивными 60-мерами 60ssCFAP (дорожки 1-3), 60dsCFAP (дорожки 4-6), 60mmCFAP (дорожки 7-9), 60ssUFAP (дорожки 10-12), 60dsUFAP (дорожки 13-15) и 60dsCFAP (дорожки 16-18) (радиоавтограф 10 % SDS-ПААГ при соотношении акриламида к Ы,Ы -метилен-бисакриламиду 80:1). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 250 нМ XPC-hHR23B, 50 нМ ДНК, 50 мМ Tris-НС1, рН 8,0 (при 25С), 60 мМ NaCl, 1 мМ EDTA или 5 мМ MgC!2. Смесь инкубировали 30 мин при 37С и облучали 5 мин на Х=312 нм при мощности 5 мДж/см2с (система для облучения "BIO-LINK (BLX)"). Реакцию останавливали добавлением буфера Леммли. Реакционную смесь, содержащую XPC-HR23B и [Р32]-радиоактивно меченные фотореакционноспособные ДНК, инкубировали при 37С и затем облучали УФ-светом (312 нм) для образования ковалентных сшивок между фотореакционноспособной арилазидогруппой и возможными акцепторами. Продукты модификации разделяли в SDS-ПААГ и визуализировали радиоавтографией. Как видно из рис. 14, для всех исследованных структур ДНК наблюдали заметную модификацию только большой субъединицы гетеродимера (ХРС), что было подтверждено с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против этого полипептида (рис. 15). В случае 60mmCFAP и FAP j— 60mmU наблюдались также минорные продукты модификации, электрофоретическая подвижность которых позволяет предположить, что они могут быть отнесены к субъединице hHR23B (рис. 14, дорожки 8, 9 и 17, 18). К сожалению, однозначно подтвердить или опровергнуть это предположение с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против этого полипептида не удалось. Это может быть связано с малым количеством обнаруживаемого продукта.
