Содержание к диссертации
Введение
1 Современные аспекты проблемы зависимости торичной структуры молекулы днк от уклеотидной последовательности 13
1.1. Конформационный полиморфизм двойной спирали молекулы ДНК 13
1.2. «Пропеллеровая» структура укладки пар азотистых оснований 19
1.3. Роль связанной воды в организации структурных форм молекул нуклеиновых кислот 26
1.4. Некоторые особенности колебательной динамики равновесной структуры молекулы ДНК 27
2 Метод и подходы 31
2.1. Возможности современных теоретических подходов в исследовании структуры и свойств биомолекулярных си стем 31
2.2. Особенности применения полуэмпирического квантово-химического MNDO/PM3 метода 51
3. Теоретический анализ электронной структуры и свойств одиночных пар оснований, нуклеозидов и нуклеотидов 57
3.1. Неплоское строение аминозамещенных азотистых оснований и скрытый полиморфизм водородного связывания уотсон-криковских пар 57
3.2. Общая классификация структурного полиморфизма во всех известных типах пар 66
3.3. Структурные и термодинамические особенности пар нуклеозидов и нуклеотидов 74
4. Непланарность водородного связывания уотсон-криковских пар и структурная организация антипараллельных коротких двойных цепочкек олигонуклеотидов 81
4.1. Полиморфизм структуры канонических пар и формирование зависимости кривизны двойной спирали от нуклеотидной последовательности 82
4.2. Влияние зарядового состояния комплементарных цепей на термодинамическую стабильность Н -связывания оснований в олигонуклеотидах 92
5. Особенности равновесной колебательной динамики изолированных двойных спиралей олигонуклеотидов 94
5.1. Неплоское строение аминозамещенных азотистых оснований и специфика колебательных мод нуклеотидов в водородно-связанных парах 95
5.2. Формирование коллективной природы низкочастоного колебательного спектра двойных последовательностей олигонуклеотидов 127
6. Влияние связанной воды на структуру и низкочастотную колебательную динамику нуклеотидных дуплексов 138
6.1. Строение гидратного окружения нуклеотидного дуплекса и зависимость формы Н-спаривания оснований от распределения связанной воды 140
6.2. Вклад гидратации в низкочастотную колебательную динамику олигонуклеотидного комплекса 144
Выводы 160
- «Пропеллеровая» структура укладки пар азотистых оснований
- Особенности применения полуэмпирического квантово-химического MNDO/PM3 метода
- Общая классификация структурного полиморфизма во всех известных типах пар
- Формирование коллективной природы низкочастоного колебательного спектра двойных последовательностей олигонуклеотидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование механизма структурообразования
молекул нуклеиновых кислот, установление физических факторов инициирующих
зависимость вторичной структуры двойных спиралей от нуклеотидной
последовательности, остается одной из важнейших проблем физико -химической биологии.
Собраны вполне убедительные свидетельства того, что генетические процессы регуляции транскрипции обуславливаются главным образом специфическими ДНК-белковыми взаимодействиями и контролируются конформацией молекулы ДНК. И процесс узнавания конкретным белком конкретных мест ДНК, и способность двойной спирали к изгибовым деформациям определяются локальной структурой последовательности нуклеотидов [33,69-70]. В то же время имеющиеся экспериментальные структурные данные указывают на весьма н етривиальную природу происхождения уникальной геометрической гетерогенности нуклеотидных шагов в структуре ДНК.
Прежде всего, это касается наблюдаемого необычного многообразия форм самой спирали ДНК, т.е. ее конформационного полиморфизма. Вообще го воря, согласно постулированному в 50-х годах прошлого века принципу строгого пространственного изоморфизма плоских канонических AT и GC пар, любые комплементарные нуклеотидные последовательности должны обладать, однотипной, регулярной, плоско -параллельной укладкой азотистых оснований в структуре двойной спирали. Однако, в реальных условиях обнаруживается большое разнообразие спиральных форм: А , В, С, D и Z [32,33,71]. Все они оказываются различающимися своими основными структурными параметрами: числом пар оснований на виток, межплоскостными расстояниями между основаниями в стопках, межфосфорными расстояниями и др. При этом, А- и В- формы, а также С-, D-, образуют семейство правовинтовых спиралей. Тогда как Z- форма - это левая двойная спираль.
Считается, что реализация конкретной структуры полимофной формы ДНК (В-ДНК, А-ДНК или Z-ДНК) - это довольно сложный результат соотношения многих
взаимодействий: водородного связывания плоских нуклеооснований, стэкинга (межплоскостного взаимодействия) пар оснований, взаимодействия между заряженными фосфорнокислыми группами, эффектов окружающей среды типа гидратации и наличия противоионов. Вместе с тем, по мнению многих авторов, определяющими здесь все же являются параметры окружающей среды и стэкинг оснований.
Наблюдается, также, и не простое, внутреннее своеобразие зависимости вторичной структуры от нуклеотидной последовательности для каждой отдельной формы двойной спирали. Исходно плоские, уотсон-криковские AT и GC пары оказывается могут реализовывать разные неплоские укладки пар, с доминированием деформаций типа «пропеллера», «ступеньки» или «излома» водородных связей оснований [ 32 -43,71]. Весьма распространено представление, что такая гетерогенность геометрии в упаковке пар также определяется в значительной мере стэкинговыми возмущениями, которые различны в структуре разных последовательностей нуклеотидов [33].
Однако, стэкинговая гипотеза о происхождении структурной неоднородности двойной спирали ДНК не позволяет, на наш взгляд, непротиворечивым образом согласовать накопленные экспериментальные данные. Во -первых, относительная малость энергии стэкинговых взаимодействий по сравнению с энергетикой водородного связывания пар не может удовлетворительно объяснить наблюдаемый довольно большой разброс угловых искажений водородных связей оснований, доходящий до ~ 39, как в "пропеллероподобных", так и в других видах деформаций пар в структуре двойных спиралей олигонуклеотидов [34-37, 42]. Во-вторых, становится непонятным существование очень больших деформаций в одиночных парах оснований, достигающих 49, в структуре монокристаллов нуклеозидов и нуклеотидов [34]. В^ третьих, в рамках стэкинговой гипотезы весьма трудно понять появление симметрии в распределении углов пропеллерового разворота плоскостей оснований во всем многообразии пар: водородное спаривание оснований реализуется не только с разными положительными, но и с разными отрицательными значениями угла пропеллера [34]. Указанные обстоятельства вынуждают некоторых экспериментаторов
выдвигать предположение, что наблюдаемая некопланарность Н-спаривания оснований есть, вероятно, внутреннее свойство самих пар [36].
Все это дает основания заключить: для корректного описания структурно -функциональной организации молекул ДНК важно не только знание формального типа "буквенной" последовательности нуклеотидов, но и глубокое понимание лимитирующих физических факторов в определении устойчивости нуклеотидных цепочек и, прежде всего, в определении устойчивости простейших водородно -связанных нуклеотидных дуплексов.
Несколько лет тому назад нами, совместно с Полозовым Р.В. [1 -7] впервые была выдвинута идея о возможности реализации неплоского, пропеллероподобного варианта Н-спаривания уотсон-криковских пар, исходя из учета малой, но устойчивой исходной пирамидальное строения экзоциклических аминогрупп оснований, по которым происходит водородное связывание пар. Позднее, нами было также отмечено [8], что устойчивый sp -гибридный характер орбиталей валентных N-H связей аминогрупп, определяющий инверсионную бистабильность неплоской геометрии этих групп, может инициировать еще более фундаментальную особенность строения комплементарных пар, а именно - их внутренний структурный полиморфизм Н-спаривания. Для уотсон криковских AT и GC пар оказывается возможным существование не единственной плоской геометрии водородного связывания оснований, как это многие считают, а шести неплоских, зеркально-симметричных пропеллерообразных и ступенькоподобных структур. Такой скрытый полиморфизм спаривания оснований может играть важнейшую роль в определении формы двойных спиралей полинуклеотидов.
Последующие выполненные нами простейшие квантово-химические оценки конформационных особенностей Н-связывания различных типов пар оснований показали плодотворность этого предположения.
Из литературы известны многочисленные примеры теоретического исследования как на основе эмпирических подходов, так и с применением самых новейших методов компьютерной химии, проблемы структурной организации молекул нуклеиновых кислот. Практически все они направлены на обоснование доминирующей, стэкинговой модели появления и стабилизации деформации пар оснований в структуре модельных
комплексов ДНК. Известно, правда, несколько попыток использования неэмпирических, ab initio квантово-химических схем расчета и для проверки идеи возможного влияния непланарности строения азотистых оснований на структурные особенности водородного связывания пар [44-48].
Однако, как показывает анализ имеющихся данных, драмати зм нынешнего общего состояния решения всей этой сложной и деликатной проблемы заключается в том, что очень часто анализируемые эффекты от вкладов тех или иных видов возмущений в энергетику нуклеотидных комплексов, оказываются весьма малыми по величине и взаимно противоположными по знаку. При этом, ошибки используемых теоретических методов нередко оказываются сравнимыми с величинами самих оцениваемых эффектов. Так, например, известно, что выигрыш в энергии при переходе от плоской структуры к неплоской в простейших ароматических аминопроизводных (в том числе и в азотистых основаниях) имеет величину порядка 1 ккал/моль. В то же время, погрешности, например, одного из самых популярных в последнее время неэмпирического, квантово-химического метода такого, как HF/6-31(d,p)//MP2/6-31(d,p), при оценке энергетики молекулярных структур и комплексов достигают величины порядка ~ 2-4 ккал/моль [49-50]. По этим причинам, результаты и выводы многих работ оказываются сильно зависящими не только от вида модельного комплекса и от вида сделанных допущений, но также и от типа используемой методики расчета и потому весьма часто не согласуются друг с другом.
Прецизионных экспериментальных данных, типа данных газовой электронографии или микроволновой спектроскопии, по геометрии изолированных комплексов пар оснований, нуклеозидов или нуклеотидов, в силу слабой термостабильности исходных нуклеиновых компонент, в настоящее время нет.
Поэтому, дальнейшие теоретические всесторонние исследования механизма структурообразования молекул дезоксирибонуклеиновых кислот, на базе учета особенностей электронного строения непланарных форм спаривания комплементарных AT и GC пар и с привлечением адекватных квантово-химических подходов, представляются крайне важными, носят приоритетный характер и тем самым определяют актуальность данной темы диссертации.
Дели исследования. Основная цель работы заключалась в обосновании ключевой роли скрытого полиморфизма водородного связывания уотсон-криковских пар оснований в определении физического механизма зависимости вторичной структуры двойной спирали ДНК от нуклеотидной последовательности.
Поскольку гидратация является важнейшим, неотрывным элементом структурно -динамической организации молекул ДНК, то в работе, в тесном единстве с главным вопросом, теоретически был проанализирован и вопрос о влиянии молекул связанной воды на стабилизацию уникальной геометрии и на формирование функциональной специфики равновесной колебательной динамики пар оснований в структуре олигонуклеотидных двойных цепочек.
Научная новизна работы. В процессе выполнения теоретических исследований был получен ряд новых научных результатов. Среди них:
На основе использования современного полуэмпирического MNDO/PM3 квантово-химического подхода впервые показано, что неплоский характер водородного связывания азотистых оснований в большинстве известных пар с двумя или тремя водородными связями является изначальным, внутренним свойством самих пар. Это свойство определяет у 28 возможных типов пар не один, плоский вариант Н-связывания, а в общем случае 81 вариант геометрии спаривания оснований.
Получено, что:
а) для уотсон-криковских AT пар, как и для многих других пар, в водородном
связывании которых принимает участие одна аминогруппа, характерно
двукратное вырождение Н -спаривания, с реализацией двух зеркально-
симметричных структур типа "пропеллера";
б) для уотсон-криковских GC и других пар, с двумя аминогруппами в
водородных связях, характерно четырехкратное вырождение спаривания, с
образованием попарно симметричных структур «пропеллера» и «ступеньки»;
в) диапазон углов пропеллера и излома в некопланарных конфигурациях пар -
довольно широк и составляет +40 -ь -40 градусов.
Продемонстрирована гетерогенность колебательно-вращательных и
термодинамических характеристик полиморфизма спаривания оснований.
Показано сохранение некопланарного полиморфизма уотсон-криковских пар в условиях структуры двойных спиралей олигонуклеотидов. Проиллюстрировано, как накопление геометрических отличий в укладке AT и GC пар может инициировать зависимость формы спирали от нуклеотидной последовательности.
Установлена важная роль непланарности Н -связывания оснований в формировании коллективной природы низкочастотных мод колеба тельного
спектра двойных цепочек олигонуклеотидов.
Показано, что водное окружение не только стабилизирует структурную
гетерогенность укладки водородно-связанных оснований, но и активно
участвует в определении функционально важных свойств равновесной
колебательной динамики олигонуклеотидных дуплексов.
Научно-практическое значение работы. Полученные результаты имеют, прежде всего, важное методологическое значение. Они существенно расширяют и обобщают представления о физическом механизме структурно-динамической организации двойной спирали ДНК. Указывают на лимитирующие факторы формирования фундаментальной функциональной зависимости вторичной структуры молекул нуклеиновых кислот от нуклеотидной последовательности.
Результаты работы могут быть использованы в построении новых технологий ДНК -расчетов, в создании современных учебно-методических курсов с углубленным описанием особенностей электронного строения и свойств биологических макромолекул, а также могут найти активное применение в биотехнологических разработках, в проектировании новых эффективных лекарственных препаратов на основе интеркаляторов в ДНК -структуры.
Структура и объем работы. Диссертация представлена в стандартной форме и состоит из введения, обзора литературы (Глава I), описания используемого метода и подходов (Глава II), результатов исследования (Главы III -VI), выводов и списка литературы. Работа изложена на 181 страницах, содержит 20 рисунков, 35 таблиц, 250 литературных ссылок.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа, в том числе 15 статей в отечественных и зарубежных изданиях. Апробация работы. Результаты работы докладывались на:
X International Biophysics Congress, July 29 - August 3, 1990, Vancouver, Canada;
VIII Всесоюзном симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 28 октября -1 ноября, 1990, Новосибирск;
XI семинаре по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 26-28 октября, 1993, Пущино;
Российской научной конференции с участием зарубежных ученых «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах», 28-30 июня, 1994, Тверь;
II Международной конференции «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах», 2-5 июля, 1996, Тверь;
XIII семинаре по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 16-20 июня, 1997, Тверь;
- International Conference "Nonlinear Phenomena in Biology", June 23-28, 1998,
Pushchino;
Ill Международной конференции «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах», 29 июня - 3 июля, 1998, Тверь;
X Всесоюзном симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 28 октября - 1 ноября, 1999, Тверь;
II съезде биофизиков Росси, 1999, Москва;
«IV Международной конференции по математическому моделированию», 27 июня -1 июля, 2000, г. Москва, МГТУ «СТАНКИН»;
Школе-конференция "Горизонты физико-химической биологии", 28 мая -2 июня, 2000, Пущино;
II International Conference "Modern Trends in Computational Physics (MTCP'2000)", July 24-29, 2000, Dubna;
V Пущинской конференции молодых ученых "Б иология - наука XXI века", 16-20 апреля, 2001, Пушино;
II International Symposium "Computer Assistance to Chemical Research (CACR'2001)", May 22-23, 2001, Moscow;
VI Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", 20-24 мая, 2002, Пушино;
Первой Национальной конференции "Информационно -вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины (ИВТН-2002» Май, 2002, Москва;
Ill International Conference "Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2002)", May, 2002, Novosibirsk;
V, VI, VII, VIII, X и XI Международных конференциях. «Математика. Компьютер. Образование», 1998, 1999,2000, 2001,2003, 2004 годов, Дубна, Пущино;
«Пропеллеровая» структура укладки пар азотистых оснований
Рентгеноструктурные данные указывают, что уотсон-криковские AT и GC пары, оказываются всегда деформированными [33]. Хотя по определению они должны быть близки к плоской форме. Особенно выделяется «пропеллероподобное» разворачивание Н-спаренных оснований, которое наблюдается практически во всех нуклеиновых кислотах и, которое, может достигать значительной велич ины [32-43, 43а]. Выделяются также деформации типа «ступеньки» или «излома» комплементарных пар. Констатируется, что пропеллеровые развороты и изломы Н-связывания пар оснований - это необходимый и важный атрибут структурной организации молекул ДНК, т.к. через них реализуется фундаментальное свойство структурной гетерогенности двойной спирали ДІЖ, а именно - зависимость торсионных параметров спирали от нуклеотидной последовательности. Искажения Н -связывания способствуют образованию бифуркационных водородных связей [75], лучшему стэкингованию оснований [39] и взаимодействию соседних аминогрупп в спирали [76]. В то же время, отмечается и определенное взаимное сопряжение пропеллеровых и изломовых деформаций [39,42]. Из наблюдаемых неплоских структур водородного связывания пар предпочтительно реализуются конфигурации с сохранением некоторого суммарного значения углового искажения связывания, т.е. если реализуется структура с большим пропеллером, то излом Н-связей у нее будет малым и наоборот. Несомненно, что стэкинг оснований, обусловленный дисперсионными и гидрофобными силами, играет определенную роль в организации укладки пар в двойной спирали [33,37,39,54-57,85-87,109,110]. И это никто не отрицает. Однако, следует заметить, что относительная малость энергии стэкинговых возмущений по сравнению с энергетикой водородного связывания [54,110] не в состоянии удовлетворительно объяснить в настоящий момент стабильность наблюдаемых больших угловых искажений водородных связей пар оснований. Эти "пропел леры" и "изломы" в конформации пар в структуре, например, двойных спиралей олигонуклеотидов доходят до 40 [34-37, 42]. А в структуре одиночных пар нуклеозидов и нуклеотидов такие развороты оснований достигают даже величины почти в 50 [34]. В рамках стэкинговой гипотезы, остается непонятным существование симметрии в угловом распределении пропеллеровых разворотов оснований. Как показывают кристаллографические данные, левые и правые пропеллеры примерно равномерно заполняют собой пространство наблюдаемых угловых деформаций пар [34]. К сожалению, прецизионных экспериментальных данных, типа данных микроволновой спектроскопии или газовой электронографии по детальной геометрии изолированных водородно-связанных пар с точной фиксацией положений всех атомов, включая атомы водорода азотистых оснований, т.е. данных, которые могли бы четко прояснит ситуацию с природой непланарности одиночных пар, в настоящее время нет. И это остается, по сути, главным обстоятельством в доминировании в данной области сэкинговых "настроений".
Но, тем не менее, именно в силу постоянного проявления в имеющихся экспериментах таких «аномалий» и закономерностей в геометрии связывания пар, причем даже для пар не встроенных в двойные спирали, некоторые исследователи все же вынуждены выдвигать предположение, что наблюдаемая некопланарность Н-спаривания оснований есть, вероятно, какое-то внутреннее свойство самих пар [34-35,168]. Так, что имеются веские основания заключить: для корректного описания структурно-функциональной организации молекул ДНК важно не только знание формального типа "буквенной" последовательности нуклеотидов, но и требуется более глубокое понимание лимитирующих физических факторов в определении устойчивой формы двойных нуклеотидных цепочек и, прежде всего, в определении формы отдельных простейших водородно -связанных нуклеотидных комплексов. Некоторое время тому назад нами [1-8], для выхода из создавшегося положения, впервые была выдвинута идея о возможности реализации неплоского, пропеллероподобного варианта Н-спаривания уотсон-криковских пар, исходя из учета малой, но стабильной исходной пирамидальности строения аминогрупп оснований, по которым происходит процесс водородного связывания. Данная идея основывалась на имеющихся точных данных микроволновой колебательно-вращательной спектроскопии о том, что во всех простейших аминопроизводных алифатической и ненасыщенной природы, а также в ароматическом производном - анилине, NH2-rpynna всегда существует в стабильной неплоской конформации [77-82]. Были приняты во внимание, также, и имеющиеся редкие спектроскопические данные, указывающее на определенное отклонение от планарности формы газофазных структур аминозамещенных азотистых оснований - аденина и цитозина [83,84], рисунок 4. С помощью простейших полуэмпирических квантово-химических расчетов нам удалось показать, что именно устойчивый зр3-гибридный характер орбиталей валентных N-H Для уотсон-криковских AT и GC пар оказывается, таким образом, возможным существование не единственной, планарной геометрии водородного связывания оснований, как это многие считают, а шести неплоских, зеркально-симметричных пропеллерообразных и ступенькоподобных структур. (Два симметричных «пропеллера» у AT пары и две «ступеньки» и два «пропеллера» у пары GC). Такой скрытый полиморфизм Н-спаривания оснований, по-видимому, мог бы играть важнейшую роль в определении формы двойных спиралей полинуклеотидов. Последующие наши квантово-химические оценки конформационных особенностей Н-связывания различных типов пар оснований действительно показали перспективность этой идеи [9,10]. Важно отметить, что до выхода наших первых работ, в литературе, вопросу о возможной непланарности строения аминогрупп в азотистых основаниях, практически не уделялось внимания. Экзоциклические аминогруппы молекул полагались либо плоскими, либо почти плоскими [33]. В качестве главного аргумента здесь всегда выдвигалось планарность строения молекулы формамида, (H2N-HC=0, пептидной группы) [191-197]. По нашему мнению, данный случай формамида является скорее исключ ением, чем правилом. Как указывают детальные микроволновые спектроскопические исследования [191], специфика строения этой молекулы такова, что она только "в среднем" плоская. Сильное кулоновское отталкивание зр3-гибридной неподеленной пары электронов атома азота от двух неподеленных пар электронов атома кислорода, лежащих в плоскости молекулы, заставляет водороды ЫНг-группы постоянно совершать безбарьерную подвижку на угол порядка 40 в одну и другую стороны относительно плоскости всей молекулы. Естественно, среднее положение такой инверсионной перестройки N-H связей отвечает как бы плоской геометрии молекулы. В случае же примеров других простейших аминопроизводных, в электронной структуре которых нет близко расположенных с атомом азота неподеленных пар, всегда фиксируется устойчивое неплоское строение аминогруппы [77-82,198]. Наиболее характерный случай - углеводородный аналог формамида - виниламин. Здесь, в отсутствии кулоновских «напряжений», как и положено, ИНг-группа с ее 8р3-гибридным характером валентных связей азота имеет устойчивую пирамидальную структуру. Угол наклона плоскости HNH к плоскости всей молекулы составляет примерно 40 [78].
В дальнейшем, с пониманием важности этого момента, теоретическому выяснению особенностей геометрии аминогруппы в структуре азотистых оснований, а также в других молекулах стало уделяться гораздо больше внимания [44,45,46-48,55,56,170-179,187]. Было замечено, что принятие в расчетах плоской структуры аминогруппы приводит к появлению в низкочастотном спектре нормальных колебаний молекулы мнимых частот [47,174,186-188]. В случае неплоских геометрий оснований таких частот в спектре уже не наблюдается [187]. Наличие отрицательных частот в колебательном спектре молекулы указывает на метастабильную природу конформационного состояния полученного в результате расчета. Отсутствие этих частот в спектре считается теперь убедительным и точным критерием правильности найденной геометрии молекулы, т.е. ее соответствия глобальному минимуму потенциальной энергии [188]. В последние годы, во многом с подачи плодовитой вычислительной работы Спонера, Нобза и соавторов [45,46-48,55,56,173-179], с применением разных неэмпирических схем расчета, включая и наиболее современный подход на базисе 6-31G(d,p)/MP2 приближения, многие стали придерживаются именно такой точки зрения о стабильности неплоского строения оснований с аминогруппой в своем составе. Хотя можно опять указать на сохранение и старой точки зрения. Так, в теоретической работе [189], на основании расчетов нуклеооснований в том же 6 -31G(d,p)/MP2 приближении, был сделан вывод, что непланарностью молекул аминозамещенных оснований можно все же можно пренебречь, и всегда рассматривать их как почти плоские структуры с ( -симметрией геометрии своего основного состояния.
Особенности применения полуэмпирического квантово-химического MNDO/PM3 метода
В данной работе для расчетов в едином приближении структурных, спектроскопических и термодинамических свойств компонентов нуклеиновых кислот использовался хорошо зарекомендовавший себя РМЗ вариант полуэмпирической квантово-химической методики MNDO в свободно распространяемом программном пакете МОР АС 7.01. Выбор для расчетов такой полуэмпирической техники обусловлен наилучшим соотношением точности расчета и необходимых для расчета вычислительных ресурсов, а также неоднократно отмечавшейся в литературе ее надежностью в описании водородно-связанных структур [171,175,230-232]. Расчеты проводились на базе персональных компьютеров типа Pentium III, Pentium IV и с использованием вычислительного суперкомпьютерного кластера Института математических проблем биологии РАН (ИМПБ РАН) в Путинском Научном Центре. В отдельных случаях, для проверки получаемых результатов, а также для оценки некоторых дополнительных структурных характеристик молекул выполнялись и неэмпирические квантово-химические расчеты с использован ием программы GAUSSIAN98 [50], инсталлированной на вычислительном кластере ИМПБ РАН. Из-за многоплановости проводимых в работе расчетов кратко остановимся на некоторых их методических и технических особенностях. 1. Оптимизация геометрии оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, их водородно-связанных комплексов, а также коротких двойных цепочек ДНК проводилась в основном на базе программного пакета МОР АС. Учитывая большие размерности задач, всегда при работе программы использовался ключ PRECISE. Этот ключ предназначен для стократного усиления критериев сходимости и оптимизации по сравнению со стандартными критериями, используемыми по умолчанию. С целью более полного учета конформационной лабильности нуклеооснований использовался также ключ NOMM. Он отключает режим принудительного "выплащивания и замораживания" в молекуле структур типа пептидной группы. Во всех оптимизационных конформационных расчетах контроль устойчивости получаемой геометрии и "попадания" ее в действительно глобальны й, а не в промежуточный минимум потенциальной энергии осуществлялся по получению максимальности значения теплоты образования (при вариации начальных условий процесса оптимизации) и по отсутствию мнимых частот в спектре нормальных колебаний исследуемой системы. Моделирование электронейтральности структур нуклеотидов и их Н -связанных комплексов производилось путем компенсации отрицательного заряда фосфатных групп протонированием (Н+) одного из кислородов (=0") фосфатной группы. В качестве начальных геометрий дуплексов брались кристаллографические данные фрагментов классических В- и Z-форм ДНК из компьютерной базы данных нуклеиновых кислот NDB: http://ndbserver.rutgers.edu/NDB/NDBATLAS/ 2.
Инерциальный дефект, А , этот чувствительный индикатор асимметрии формы молекулярной структуры [233], привлекался нами для интегральной оценки степени непланарности азотистых оснований, а также в качестве меры компактности формы молекул, обладающих разветвленной системой валентных связей. По определению, он связан с главными моментами инерции соотношением: A =IC-(1, + 1,). (u«A2) (2.7) Здесь Іф,ь) - главные моменты инерции бпсС(А, В) выраженные через соответствующие вращательные константы А, В и С. вводимые в обычной спектроскопической практике. В общепринятых спектроскопических единицах, см"1, констант С(А,В) выражение для моментов будет: (,) С (А, В) К Как показали оценки, полученные в РМЗ приближениии оптимизированные геометрии молекул дают хорошее воспроизведение экспериментально наблюдаемых величин этих дефектов. 3. Колебательные спектры молекул и водородно-связанных комплексов рассчитывались в гармоническом приближении, стандартным образом по встроенному в программу МОРАС алгоритму. В расчетах учитывались все степени свободы. Специального, дополнительного масштабирования силовых констант не производилось. Описание характеристичности колебаний проводилось также стандартным образом на основе PED анализа (Potential Energy Distribution Analysis) [114,218] каждого нормального колебания по вкладам конкретных связей в потенциальную энергию молекулы 4. Теплота образования, АН/298К), - основной рассчитываемый в работе параметр молекулярной системы, характеризующий ее полную внутреннюю энергию. Процесс оптимизации геометрии молекулы с помощью уравнений метода Хартри-Фока заканчивается в программе МОРАС при достижении экстре мальности именно этого параметра. По нему, в определенной мере, судят и о термоустойчивости найденной структуры и ведут сравнение с экспериментальными термохимическими данными. Рассматриваемые молекулы и комплексы, особенно олигонуклеотидные двойные последовательности, отличаются высокой конформационной гибкостью. Их гиперповерхности потенциальной энергии изобилуют огромным количеством локальных и не очень глубоких минимумов. Поскольку условия функционирования этих соединений отвечают ненулевым температурам требуется корректная оценка вкладов их колебательно-вращательных степеней свободы в общу ю энергетику термодинамической стабильности.
В данном квантово-химическом подходе соответствующая энтропийный фактор вычислялся на основе использования известного формализма статсумм. Стабильная и значительная деформация водородно-связанных пар, регистрируемая в структуре кристаллов синтетических и нативных форм нуклеиновых кислота, а также в структуре монокристаллов нуклеотидов и нуклеозидов, трудно интерпретируется в рамках только стэкинговой гипотезы природы возмущений в укладке пар оснований. Прямых и точных экспериментальных данных по геометрии одиночных пар, в силу слабой термоустойчивости оснований, в настоящее время к сожалению пока нет. В своих ранних теоретических работах, с применением относительно простой квантово-химической схемы расчета PCILO [1-Ю], мы впервые указали на принципиальную возможность участия слабого, но стабильного отклонения от планарности аминогрупп оснований в формировании "пропеллероподобного" искажения структуры комплементарных пар, причем различающегося для AT и GC типов связывания. Удалось, таким образом, качественно обосновать возможное существование внутренней, структурной неоднородности исходного процесса Н-спаривания оснований. В данной работе, в этой и последующих главах, мы представляем результаты более тщательного и детального анализа не только конформационных, но и различных дополнительных структурных (спектральных, динамических и термодинамических) особенностей этого механизма водородного связывания азотистых оснований, как для структуры одиночных нуклеотидных пар, так и для структуры олигонуклеотидных двойных последовательностей. Такой анализ, с позиций современной полуэмпирической квантовой химии, позволяет наиболее полно обосновать важность инициирующего начала в форме скрытого полиморфизма Н-спаривания уотсон-криковских пар для определения физического механизма зависимости вторичной структуры двойной спирали ДНК от первичной структуры. По аналогии с предыдущими PCILO расчетами, обоснование идеи множественности формы Н-связывания азотистых оснований по одним и тем же водородным связям мы начнем с конформационного анализа самих оснований. В качестве схемы организации (и нумерации) как этих, так и других компонентов нуклеиновых кислот мы использовали стандартное определение, взятое из работы [33], рисунок 7.
Общая классификация структурного полиморфизма во всех известных типах пар
В случае азотистых оснований возможны вообще говоря не только уотсон-криковские, комплементарные спаривания оснований, но и еще 26 типов спариваний с двумя связями N-H... О или N-H...N [237,170]. В данной работе в качестве одной из первых задач было проведение сравнительного теоретического РМЗ исследования особенностей геометрии водородного связывания оснований во всех этих парах канонического или хугстеновского типа (см. рисунок 9.). 1. Общий диапазон изменений угловых параметров водородных связей, характеризующих все деформированные структуры, оказался довольно широким. Так, углы пропеллера в изученных структурах изменяются от ± 2 до ±35 , а углы излома пар - от ± 2 до ±25. Величина же параллельного сдвига плоскостей оснований в конформациях типа "ступенька" может достигать 1 А (см. таб. 5.). Наибольшей деформацией, согласно нашим оценкам, обладает структура GG(II) пары, где угол, например, пропеллерового разворота плоскостей оснований оказывается наибольшим, со =35 , и это при довольно большом, к=25, дополнительном изломе комплекса. Видно также, что по-парная зеркальная симметрия всех неплоских форм Н-связывания по аминогруппам оказывается справедливой и для уотсон-криковских и для большинства хугстеновских пар. Но даже те пары, у которых амино группа не принимает непосредственного участия в Н-спаривании оснований (это GG(I), GT(I), GT(II) пары), они тоже испытывают заметное влияние бистабильности пирамидальной структуры -NH2 группы на общую энергетику и соответственно на формирование некоторой непланарности комплекса. Таким образом, 25 пар оснований формируют в общей сложности 78 различных некопланарных форм спариваний. Если добавить сюда три разных, хотя и планарных структуры ТТ пар, то строго говоря мы сталкиваемся с широким спектром полиморфизма процесса водородного связывания оснований. Эти результаты находятся в хорошем согласии с экспериментальными наблюдениями и о существовании больших угловых деформаций водородно-связанных пар и о равномерном распределении фиксируемых значений положительных и отрицательных углов пропеллерового скручивания оснований в структуре одиночных кристаллов нуклеотидов и нуклеозидов [35,36].
Весьма емко структурные отличия выявленных полиморфных форм пар проявляются, как показали наши теоретические оценки, через величины инерциальных дефектов Д этих структур. Рассчитанные по значениям полученных нами колебательно-вращательных спектроскопических констант А, В, С, эти дефекты А для разных водородно-связанных комплексов оказались изменяющимися в довольно больших пределах, от А = -4.0 (и-А2) до А = -185.0 (и-А2). Причем, если для сравнительно слабо деформированных (как правило "ступенькообразных" и "пропеллерододобных", с малым углом пропеллера) структур величина А лежит в пределах Л = -4.0 -15.0 (u-A2), то для большинства изогнутых пропеллеровых конфигураций его значение находится в диапазоне А = -20.0 -s- -70.0 (u-A ). В уникальном случае, сильно деформированной пары GG(II), с суммарной угловой деформацией порядка 60, величина А равна -185.0 (u-A2). Так, что данный физический параметр вполне может быть использован для идентификации многообразия форм Н-связывания азотистых оснований по одним и тем же водородным связям. 3. Степень стабильности Н-связанных комплексов обычно оценивают по величине энтальпии их образования - важнейшему термодинамическому параметру пар. Эти величины, наряду с другими параметрами электронной структуры комплексов, также рассчитывались в работе. Все они приводятся в Таблице 6. Из данных Таблицы 6. прежде всего, видно, что использованный нами полуэмпирический подход с учетом вкладов дисперсионных взаимодействий позволяет вполне удовлетворительно описывать энергетику водородного связывания различных пар азотистых оснований. Получено, в соответствии с экспериментом, уменьшение устойчивости комплементарных и хугстеновских оснований в ряду GC, AT, ТТ в газовой фазе [67]. Результаты по оценке других термодинамических характеристик комплексов дают возможность говорить, в частности, и о существенном влиянии энтропийного фактора на процесс Н-спаривания оснований. Так, вычисленное значение абсолютной энтропии, S0, оказывается значительным и заметно увеличивается при переходе от наиболее прочного уотсон-криковского GC вида спаривания к неустойчивому, хугстеновскому типу спаривания, ТТ, изменяясь со 131 (кал/К/моль) до 147 (кал/К/моль). Этот сравнимый с изменением энтальпии вклад энтропии в энергетику комплекса находит свое отражение и в величинах Гиббсовых энергий образования пар. Поэтому, обсуждая термодинамическую стабильность различных форм водородного связывания пар несомненно следует учитывать и энтропийные параметры их колебательно-вращательной структуры. Кроме того, явно обозначилась гетерогенность термодинамических параметров внутри одного типа спаривания. Она вполне определенно указывает на необходимость осторожной интерпретации в ряде случаев имеющихся экспериментальных данных по относительной устойчивости одиночных пар. В особенности, когда используется упрощенное группирование, часто встречаемое еще в литературе, типов пар только по виду их составляющих оснований [238] (например, АА или GC) без учета поправок на их внутреннее многообразие форм водородных связываний, характеризующихся отличительными термодинамическими параметрами. 4. Еще одним весьма чувствительным индикатором изменения электронной структуры в ряду водородно-связанных комплексов оказывается величина дипольного момента ц. Являясь, по сути, векторной величиной, электрический дипольный момент весьма ярко, как видно из приведенной таблицы 5, характеризует геометрические отличия тех или иных форм спаривания оснований.
В случае пар с четырехкратным вырождением формы спаривания "пропеллероподобные" и "ступенькообразные" структуры могут заметно отличаться по значениям своих дипольных моментов. Наиболее наглядно это видно на примере GG(I) или СС хугстеновских пар. Здесь, пропеллероподобные и ступенькообразные конформации резко разнятся по величине дипольных моментов. А именно разнятся в соотношении как 1.59 : 0.0 D для первой пары и в соотношении 1.25 : 0.0 D для второй. Такая разница в величинах дипольных моментов этих конформации тоже, кстати, может рассматриваться в качестве хорошего критерия для идентификации таких полиморфных структур, в соответствующих полярографических экспериментах. Дополнительно интересно то, что при изменении взаимной ориентации оснований в паре при их полиморфной перестройке например из "положительной" ступеньки в "отрицательную" - направление дипольного момента пары может просто поменять знак, т.е. из направления "up" перейти в направление "down"! Таким образом, детальный РМЗ анализ структурных свойств водородно-связанных пар показывает существование у подавляющего большинства из них устойчивого полиморфизма формы, обусловленного бистабильным характером строения их экзоциклических аминогрупп. Для уотсон-криковских пар характерен 6-кратный полиморфизм формы комплементарного спаривания.
Формирование коллективной природы низкочастоного колебательного спектра двойных последовательностей олигонуклеотидов
Как показывают наши квантово -химические расчеты модельных коротких двойных цепочек ДНК увеличение размера водородно-связанного нуклеотидного комплекса в целом, как ни странно, уже не так сильно в качественном отношении усложняет структуру колебательного спектра системы. В удлиненных системах наиболее значимыми факторами здесь оказываются очень высокая плотность колебательных состояний на единичный интервал частот, а также весьма нетривиальная, сложная смешанная природа всех колебаний. Но отчасти это и неудивительно. В наиболее протяженных исследованных нами системах - тетрануклеотидных дуплексах, число нормальных мод комплекса уже достаточно велико, составляет примерно 780 мод и они весьма плотно заполняют практически весь диапазон ИК спектра от 1 см " до 4000 см 1. Так, что колебательные свойства рассмотренных примеров вообще могут рассматриваться довольно хорошим приближением в имитации особенностей равновесной колебательной динамики длинных двойных полинуклеотидных последовательностей. В своей работе мы провели расчеты спектров нормальных колебаний всех структур нуклеотидных комплексов обозначенных в конформационных расчетах Главы IV. В данном разделе, в качестве иллюстрации основных закономерностей в поведении низкочастотной колебательной динамики нуклеотидов в структуре водородно -связанных нуклеотидных дуплексов, приведен полный колебательный спектр для случая комплекса d(ApA)d(TpT), таблица 32. (Наэтом примере, кстати, в дальнейшем в Главе VI будет детально проиллюстрировано и влияние связанной воды на колебательную динамику Н-связанных нуклеотидов). Описание колебаний проведено в соответствии со спецификацией функциональных групп Таблицы 11. Межмолекулярные моды, как и ранее, отмечены жирным шрифтом. Поскольку основное внимание мы уделяем описанию специфики низкочастотной области колебаний в удлиняющихся водородно-связанных дуплексах, в сравнительном анализе колебательных спектров представлены также объединенные данные и по удлиняющемуся ряду олигонуклеотидных цепочек: d(ApA)-d(TpT), d(ApApA)d(TpTpT), d(ApApApA d(TpTpTpT), d(ApTpApT)d(ApTpApT), d(GpGpGpG)d(CpCpCpC) и d(GpCpGpC)d(GpCpGpC) (Таблица 33). В этой таблице приведены данные только по 20 самым нижним нормальным колебаниям. Основные результаты полученные здесь могут быть сведены к следующему:
Приведенные ранее в Главе IV (Рисунки 14-16) оптимизированные конформации коротких двойных цепочек олигонуклеотидов четко указывают, что в этих структурах водородное связывание азотистых оснований сохраняет свой некопланарный вид. Естественно здесь, как и в одиночных парах, должен сохраняется сложный смешанный характер нуклеотидных колебаний. С одной стороны, подобие исходных электронных структур систем валентных связей родственных нуклеотидов приводит к фактическому умножению количества похожих колебательных частот нуклеотидов. Но с другой стороны, возникающая в таких последовательностях гетерогенность геометрических параметров внутри одних и тех же уотсон-криковских AT или GC пар уже приводит к довольно сильному дополнительному «перепутыванию» всех мод, как внутримолекулярных (внутрицепочечных), так и межмолекулярных (межцепочечных). Пример колебательного спектра дуплекса d(ApA).d(TpT), приведенный в таблице 32, полное тому подтверждение. 2. Низкочастотная область спектра во всех этих структурах, как и в одиночных нуклеотидных парах, сильно заселяется межмолекулярными модами. В простейшем, например, случае - случае дуплекса d(ApA)-d(TpT), из полученных 20 нижайших мод, 16 мод оказываются межмолекулярными колебательными модами водородно-связанных нуклеотидов. Большинство из них, в особенности моды в области 10, 14, 20, 22, 24, 28, 37, 39, 43, 47, 54 и 56 см"1, имеют, в свою очередь, коллективный характер. В их формировании принимают участие колебания разных функциональных групп обоих водородно-связанных нуклеотидных пар. Внутримолекулярные низкочастотные моды, относящиеся к колебаниям групп в одной цепи, тоже оказываются весьма сложной, смешанной природы. Боле менее выраженная характеристичность колебаний одиночных групп начинает проявляться, как показывает расчет, только при относительно высоких частотах. В более протяженных, тримерных и тетрамерных дуплексах, спектр гармонических мод довольно сильно нивелируется. Возникающая здесь близость частот многих подобных колебаний, делает спектральное распределение мод более однородным и почти непрерывным. Колебательные частоты, начиная с области порядка 3 см 1, весьма плотно, через 1 см"1, заполняют всю длинноволновую область ИК спектра поглощения. Такой квазиконтинуум сохраняется вплоть до границы частот в 400 см"1. Далее, колебательные моды, уже через интервалы в 3-Ю см", заполняют оставшуюся часть ИК спектра, доходя до области частот в 3900 см" \ где находятся характеристические колебания гидроксильных, О-Н групп. Как показывает расчет, интенсивности всех низкочастотных мод оказываются небольшими. Как и в одиночных парах оснований, нуклеоизидов и нуклеотидов, деформационный тип этих колебаний определяет и здесь небольшие величины переходных дипольных моментов, // ,, . Согласно Таблице 4, значения их не превышают величины 0,4- D/A. В то же время, в отличие от реальной ситуации [91-104], в колебательном спектре изолированной модели строения двойной спирали нельзя без привлечения в эту структуру дополнительных внешних факторов выделить в области до 100 см 1, какой-либо резкой границы начала активности мод, отвечающих колебаниям двойной цепи. Согласно нашим оценкам, хотя здесь и обнаруживается формирование большого количества коллективных колебаний, начинающихся практически с "нулевых" частот, но все они наряду с локальными модами обладают слабой интенсивностью и равномерно заполняют всю длинноволновую область ИК спектра поглощения водородно-связанного комплекса. Таким образом, в целом, проведенный в этой главе анализ колебательной структуры различных форм нуклеотидных комплексов позволяет заключить, что основной причиной высокой чуствительности низкочастотных колебательных мод нуклеотидов к структуре олигонуклеотидных дуплексов является некопланарная укладка Н-спаренных азотистых оснований в структуре спирали. Эффект значительного "перепутывания" нормальных мод неплоских водородно-связанных пар обуславливает коллективный характер поведения внутримолекулярных (внутрицепочечных) и межмолекулярных (межцепочечных) колебаний в равновесной колебательной динамике двойных олигонуклеотидных последовательностей.
Похожие диссертации на Полиморфизм водородного связывания нуклеотидов и структурная организация молекулы ДНК
