Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди всех видов онкозаболеваний рак легкого (РЛ) является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований (Пономарева А.А., 2011). Он затрагивает более миллиона людей по всему миру (Артамонова Е.В., 2011) и составляет около 25 % всех смертей от рака (Агуа S.K., 2011, Sung H.J., 2008). Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 13-15% для развитых стран (Fiorentino F.P., 2011) и 9% для развивающихся (Шевченко В.Е., 2007).
Несмотря на разнообразие существующих методов диагностики рака легкого, основная масса больных выявляется в IV стадии, когда исход лечения уже является неблагоприятным (Chen H.W., 2008, Hoffman Р.С., 2000, Mulshine J.L., 2005). Выявляемость больных с I-II стадиями составляет 26,5%, а больных с III-IV стадиями - около 66,4% (Левченко Е.В., 2006, Чиссов В.И., 2009). При этом 5-летняя выживаемость после лечения I стадии РЛ соответствует 70%, а IV стадии - менее 5% (Левченко Е.В., 2006).
Для выявления опухолеспецифичных мишеней могут использоваться аптамеры - одноцепочечные ДНК- или РНК-олигонуклеотиды, которые благодаря уникальным конформациям и пространственному расположению зарядов имеют высокую специфичность и сродство к заданным мишеням (Кульбачинский А.В., 2006). Аптамеры получают из ДНК- или РНК-библиотек путем технологии селекции (SELEX) (Ellington A.D., 1990), позволяющей осуществлять направленный отбор олигонуклеотидов к большому спектру биологических мишеней - от вирусных частиц до целых клеток. Благодаря высокой чувствительности аптамеров (Iliuk А., 2011) можно определять наличие циркулирующих раковых клеток или продуктов распада опухоли в крови больных онкологическими заболеваниями.
Аптамеры, специфичные для опухолей различных типов, обычно подбираются к целым раковым клеткам или рекомбинантным опухолевым белкам. В литературе описана селекция аптамеров к клеточным культурам некоторых гистологических типов РЛ и показана потенциальная возможность их применения для детекции раковых клеток легкого (Zhao Z., 2009; Chen Н. W., 2008; Kunii Т., 2011). Однако аптамеры, подобранные к целым раковым клеткам, являются специфичными только к поверхностным белкам, находящимся на клеточной мембране.
В крови больных онкологическими заболеваниями присутствуют не только циркулирующие опухолевые клетки, но и некротические клетки, экзосомы, мембранные микрочастицы, апоптотические тельца, микроэмболы, продукты распада опухоли, содержащие большое количество внутриклеточных молекул-мишеней. Возможность детекции в крови больных большего спектра молекулярных мишеней с помощью высокоаффинного и специфичного к ним пула аптамеров существенно расширяет диагностические возможности и создает предпосылки для
разработки более чувствительных методов выявления ранних стадий онкологических заболеваний.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение аптамеров на основе одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов к тканям аденокарциномы легкого человека и экспериментальное обоснование возможности их использования для выявления опухолеспецифичных молекул в образцах периферической крови больных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. С помощью технологии SELEX провести селекцию одноцепочечных
ДНК-олигонуклеотидов к опухолевой ткани легкого человека и выбрать
наиболее специфичный и аффинный пул аптамеров.
2. Разделить пул аптамеров на отдельные клоны с помощью
бактериального клонирования, произвести секвенирование отдельных клонов
аптамеров и на его основе осуществить синтез искусственных аптамеров.
-
Изучить свойства синтетических ДНК-аптамеров и выделить из них аптамеры, наиболее аффинные и специфичные к опухолевой ткани легкого человека.
-
Показать принципиальную возможность выявления циркулирующих опухолевых клеток и продуктов распада опухолевой ткани в образцах периферической крови с помощью аптамеров.
-
Определить белковые биомаркеры рака легкого методом аффинного обогащения с помощью аптамеров.
Научная новизна.
1. Впервые проведена селекция аптамеров к тканям
послеоперационного материала рака легкого человека (аденокарцинома
легкого) с применением негативной селекции к условно здоровым тканям
легкого и цельной крови здорового человека.
2. Получен уникальный пул аптамеров с высокой аффинностью и
специфичностью к ткани аденокарциномы легкого человека.
-
Разработана новая методика выявления циркулирующих опухолевых клеток, циркулирующих опухолевых микроэмбол и апоптотических телец в периферической крови больных раком легкого человека.
-
Впервые методом аффинного обогащения с помощью аптамеров определены новые молекулы-кандидаты в биомаркеры аденокарциномы.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты расширяют представление о возможности использования аптамеров для диагностики онкологических заболеваний. Разработанный алгоритм селекции аптамеров и определения их специфичности к белкам-биомаркерам опухолевых клеток может быть применен для разработки диагностических тест-систем на основе аптамеров. Модификация стандартной технологии селекции аптамеров к опухолевым тканям легкого, описанная в работе, может быть применена для получения аптамеров для диагностики других раковых опухолей.
Практическая значимость работы заключается в том, что на основе полученных уникальных последовательностей ДНК аптамеров к опухолевым тканям легкого может быть разработан метод ранней диагностики рака легкого человека.
Апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в зарубежном журнале. Результаты исследования были представлены на международном научном семинаре с молодежной школой "Биотехнология новых материалов и окружающая среда" (2011); на конференции молодых ученых в ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» (2012); на всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (2012); семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (2012-2013); на международной конференции в Тайвани «13th Tetrahedron Symposium» (2012); на международной конференции в Италии «9nt Annual Meeting of the Oligonucleatide Therapeutics Society» (2013); на международной конференции в Англии «1st International Symposium and Exibition Aptamers 2014» (2014).
Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирован 36 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований; обсуждения; выводов; списка литературы. Список литературы состоит из 162 источников, из которых 32 российских и 130 зарубежных.
