Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 Циркуляция дезоксирибонуклеиновых кислот в крови 8
1.1.1 Источники внеклеточных ДНК крови 8
1.1.2 Состав циркулирующих в крови комплексов внеклеточных ДНК 13
1.1.3 Факторы, влияющие на циркуляцию ДНК в крови 19
1.2 Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты мочи 23
1.2.1 Механизмы появления внеклеточных ДНК в моче 23
1.2.2 ДНК-гидролизующие ферменты мочи 26
1.3 Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике 28
1.3.1 ДНК-маркеры опухолевых клеток в состве внеклеточных ДНК крови 28
1.3.2 ДНК-маркеры опухолевых клеток в составе внеклеточных ДНК мочи 32
1.3.3 Методы исследования статуса метилирования ДНК 33
1.3.3.1. Выявление метилированных цитозинов без использования метилчувствительных нуклеаз рестрикции 34
1.3.3.2. Выявление метилированных цитозинов в составе ДНК при помощи метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции 39
1.3.3.3. Методы маштабного исследования метилирования геномов 42
1.3.4 Использование циркулирующих/внеклеточных ДНК в диагностике рака предстательной железы 48
1.3.4.1. Эпидемиология онкологических заболеваний предстательной железы 48
1.3.4.2. Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы 49
1.4 Заключение 55
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Реактивы 57
2.1.2. Оборудование 58
2.1.3. ПЦР системы, использованные в работе 59
2.1.4. Клетки, используемые в работе 61
2.1.5. Лабораторные животные 61
2.1.6. Клинические характеристики здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 61
2.2. Методы 64
2.2.1. Подготовка образцов крови и мочи 64
2.2.1.1. Взятие образцов крови 64
2.2.1.2. Приготовление плазмы крови и элюатов с поверхности форменных элементов крови 65
2.2.1.3. Подготовка образцов мочи 65
2.2.2. Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 66
2.2.2.1. Приготовление модифицированного субстрата 66
2.2.2.2. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена 67
2.2.2.3. Определение ДНКазной активности иммуноферментным анализом 67
2.2.3. Выделение ДНК из образцов крови и мочи 68
2.2.3.1.Оптимизация методов выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови и мочи 68
2.2.3.2. Выделение ДНК из образцов крови 69
2.2.3.3. Выделение ДНК из супернатанта мочи 69
2.2.4. Культивирование клеток линии HeLa. 69
2.2.5. Получение лейкоцитов человека 70
2.2.6. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa 70
2.2.7. Выделение геномной ДНК из клеток линии HeLa и лейкоцитов человека 71
2.2.8. Приготовление стандарта фрагментированной геномной ДНК для последующего определения концентрации внДНК в моче 71
2.2.9. Определение концентраций цир/внДНК в крови и моче 71
2.2.10. Определение концентрации простатического специфического антигена в плазме крови 72
2.2.11. Исследование размера и состава внНК в моче здоровых мужчин и больных с онкологическими заболеваниями предстательной железы 72
2.2.12. Исследование циркуляции и стабильности препаратов очищенной ДНК и ДНК плазмы крови человека in vivo 73
2.2.12.1. Метилирование геномной ДНК 73
2.2.12.2. Приготовление ПЦР-продуктов промоторной области гена GSTP1 73 2.2.12.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени 73
2.2.12.4. Оценка стабильности ДНК в сыворотке крови мыши 74
2.2.12.5. Эксперименты, выполненные на лабораторных мышах BALB/с 74
2.2.12.6. Обработка крови мыши и выделение свободной цирДНК 75
2.2.13. Секвенирование цир/внДНК методом Сэнгера 75
2.2.13.1. Приготовление [32P] меченых олигонуклеотидов 75
2.2.13.2. Бисульфитная модификация ДНК 76
2.2.13.3. Получение ДНК промоторной области гена GSTP1 (1001-1302, X08058) при помощи полимеразной цепной реакции 76
2.2.13.4. Секвенирование методом Сэнгера 77
2.2.14. Пиросеквенирование геномной ДНК и свободной цирДНК плазмы крови здоровых доноров и
больных раком предстательной железы 77
2.2.14.1. Подготовка образцов ДНК 77
2.2.14.2. Модификация ДНК 78
2.2.14.3. Количественная оценка ДНК до и после модификации 78
2.2.14.4. Пиросеквенирование геномной и циркулирующей ДНК 78
2.2.15. Исследование различий в паттернах метилирования внеклеточной ДНК плазмы крови
здоровых доноров и больных аденокарциномой предстательной железы при помощи микрочипов 79
2.2.15.1. Оптимизация методов эффективного концентрирования цирДНК 79
2.2.15.2. Подготовка образцов цирДНК крови для сравнительного исследования при помощи CpG island microarray 80
2.2.15.3. Проведение микрочипового исследования CpG island microarray 80
2.2.16. Статистическая обработка данных 82
Глава 3. Результаты и обсуждение 83
3.1 Разработка методических подходов к исследованию цирДНК крови и внДНК мочи. 83
3.1.1. Измерение дезоксирибонуклеазной активности. 83
3.1.2. Подготовка образцов цир/внДНК 85
3.1.3. Бисульфитная конверсия внеклеточных ДНК. 92
3.2. Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 95
3.2.1. Определение уровня общего простатического специфического антигена (ПСА) в крови
здоровых доноров и онкологических больных 95
3.2.2. Определение концентраций цир/внДНК при помощи флуоресцентных красителей Hoechst
33258 и PicoGreen 96
3.2.2.1. Определение концентраций цирДНК в плазме крови 96
3.2.2.2. Определение концентраций цирДНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови 101
3.2.2.3. Определение концентрации внДНК мочи 111
3.2.2.4. Исследование размера фрагментов внНК мочи. 115
3.2.3. Исследование нуклеазной активности при помощи иммуноферментного анализа 118
3.2.3.1. Исследование нуклеазной активности плазмы крови здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 118
3.2.3.2. Исследование нуклеазной активности мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 122
3.2.4. Исследование циркуляции и стабильности свободной ДНК и ДНК в составе биополимеров в
крови 124
3.2.4.1. Исследование стабильности свободной ДНК и ДНК плазмы крови человека в крови мыши в экспериментах in vitro 125
3.2.4.2. Исследование циркуляции метилированной и неметилированной свободной ДНК и ДНК в составе природных комплексов in vivo 128
3.2.5. Исследование различий в паттернах метилирования цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 131
3.2.6. Исследование цирДНК крови при помощи микрочипового анализа CpG island microarray Заключение 140
Выводы 141
Список сокращений 143
Список литературы
- Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике
- Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы
- Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
- Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что в крови, лимфе, моче, слезе и других биологических жидкостях млекопитающих содержатся внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК). Такие внНК не однородны по размеру и составу, их концентрация зачастую повышается при травме, развитии онкологических или аутоиммунных заболеваний. Показано,' что источниками ДНК во внеклеточном пространстве (внДНК) являются процессы некроза, апоптоза, онкоза, а также активная секреция. Известно, что внДНК, в отличие от чистых препаратов ДНК, могут длительное время циркулировать в крови (цирДНК), не деградируя под действием ДНК-гидролизующих ферментов крови. Действительно, было показано, что внДНК находятся в составе олигонуклеосом, апоптотических телец и других комплексов, а структура и упаковка ДНК в составе таких комплексов могут влиять на ее стабильность. В частности, метилирование цитозинов в CpG-богатых районах ДНК, способствуя переходу ДНК из В в Z-форму, может приводить к изменению нуклеосомной укладки ДНК или прямого взаимодействия ДНК с белками и, таким образом, стабильности и времени циркуляции определенных фрагментов ДНК в биологических жидкостях. Необходимо отметить, что аберрантно метилированные внДНК рассматриваются в настоящее время как наиболее перспективные потенциальные онкомаркеры. Однако циркуляция метилированных ДНК в крови не изучена, что не позволяет выработать общих подходов к поиску таких ДНК-маркеров, поскольку основная масса исследований цир/внНК ориентирована на поиск маркеров, которые могут быть использованы для неинвазивной диагностики рака. При этом поиск таких маркеров осуществляется прямым перебором аберрантно метилированных ДНК, характерных для опухолевой ткани, без учета их вклада в формирование пула цирДНК. Отсутствие рациональных подходов к поиску таких онкомаркеров в составе цир/внДНК является основной причиной, которая лимитирует развитие диагностики, основанной на использовании цир/внДНК.
Кроме цирДНК крови, внДНК мочи также представляют большой интерес в качестве источника диагностического материала для выявления опухолей предстательной железы, мочевого пузыря, почки. Однако отсутствие данных о размере и составе внНК мочи здоровых и больных, зависимости состава от пола пациентов, факторах, влияющих на время жизни внНК в этой биологической жидкости, не позволяет разработать и оптимизовать подходы, направленные на создание неинвазивных диагностических систем на эти, и, возможно, другие типы рака, основанные на использовании внДНК мочи.
Цель работы. Целью представленного исследования являлось изучение особенностей циркуляции и выведения цирДНК крови, исследование внДНК мочи, оценка возможности рационального поиска потенциальных аберрантно метилированных онкомаркеров и поиск таких онкомаркеров при помощи микрочипов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) разработать методологию исследования: методы выделения и
концентрирования цир/внДНК из крови и мочи, метод бисульфитной конверсии цир/внДНК; 2) исследовать особенности циркуляции метилированной и неметилированной ДНК, а также цирДНК в составе нативных нуклеопротеиновых комплексов; 3) исследовать внДНК мочи, а именно размер и состав внДНК, концентрацию внДНК в норме и при заболеваниях предстательной железы, наличие опухолеспецифичных последовательностей в пуле внДНК мочи; 4) исследовать влияние дезоксирибонуклеаз крови и мочи на концентрацию цир/внДНК; 5) исследовать возможность получения данных о статусе метилирования онкомаркеров методом прямого секвенирования цир/внДНК; 6) провести поиск аберрантно метилированных маркеров опухолей предстательной железы в пуле цирДНК крови при помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k.
Научная новизна и практическая ценность работы. Для исследования вн/цирНК были разработаны методы выделения и концентрирования вн/цирДНК из крови и мочи. Впервые показано, что выведение метилированного и неметилированного ПЦР-продуктов из крови мыши имеет двухфазный характер; метилированная ДНК, вне зависимости от ее происхождения, более стабильна к действию нуклеаз крови, чем неметилированная. Впервые обнаружено, что концентрация свободной и связанной с поверхностью клеток крови цирДНК достоверно возрастает в группе пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы (ОЗПЖ) по сравнению со здоровыми донорами, а также установлена прямая корреляция между концентрацией свободных и связанных с клеточной поверхностью крови цирДНК. Показано, что в составе внНК мочи присутствуют как ДНК, так и РНК, размер фрагментов внДНК у мужчин и женщин отличается. Впервые обнаружено достоверное отличие концентраций внДНК в моче здоровых мужчин и пациентов с ОЗПЖ, а также выявлена корреляция между концентрацией цирДНК плазмы или общей (свободной+связанной) цирДНК крови и внДНК мочи. Впервые обнаружена корреляция между ДНКазной активностью крови/мочи и концентрациями цир/внДНК, а также между ДНКазной активностью мочи и ДНКазной активностью крови у пациентов с ОЗПЖ. Впервые показано, что данные об аберрантном метилировании внНК крови и мочи онкологических больных могут быть получены в результате прямого секвенирования цир/внДНК после их химической конверсии. При помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k впервые проведен сравнительный анализ цирДНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с доброкачественной гиперплазией (ДГТТЖ) и раком (РПЖ) предстательной железы с целью рационального поиска диагностически значимых аберрантно метилированных онкомаркеров. Обнаружено 117 фрагментов, имеющих достоверные различия в уровнях метилирования у больных РПЖ и здоровых доноров, причем метилирование
39 фрагментов не зависит от возраста пациента, а 8 фрагментов являются уникальными последовательностями.
Апробация работы. По материалам диссертации получен 1 Российский патент и опубликовано 9 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях: «Фундаментальные науки-медицине» (Новосибирск, 2005); «The International conference on chemical biology» (Новосибирск, 2005); «CNAPS-IV, V, VI, VII» (Лондон, 2005, Москва, 2007, Гонг Конг, 2009, Мадрид, 2011); «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006); «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006 и 2007); VI международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); «60th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics» (Вашингтон, 2010); «AACR 102nd Annual Meeting» (Орландо, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов, Списка сокращений и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 180 страницах, содержит 44 рисунка и 14 таблиц. Библиография включает 456 литературных источников.
Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике
Еще в 60-х годах прошлого столетия появились первые сообщения о присутствии очень малых количеств ДНК в плазме крови человека и животных [2]. В настоящее время известно, что ДНК циркулирует в крови, как в норме, так и при развитии различных патологий. Концентрация внДНК в плазме здоровых доноров в среднем не превышает 53 нг/мл [4, 21, 23-25]. При развитии онкологических заболеваний концентрация внДНК возрастает и, по данным разных авторов, составляет от 10-1200 нг/мл [26-28] до 2160 нг/мл [23]. В крови онкологических больных ДНК опухолевого происхождения в суммарном пуле цирДНК составляет от 1.9% [29] до 93% [26].
Основными источниками вн/цирДНК в настоящее время принято считать апоптоз, некроз нормальных и опухолевых клеток и секрецию ДНК нормальными и/или трансформированными клетками [26, 30-35].
Происхождение вн/цирДНК в результате апоптоза. Известно, что апоптоз является запрограммированной формой гибели клеток на протяжении всей жизни организма, начиная с ранних стадий эмбриогенеза и до смерти. В организме человека ежедневно около 1011-1012 клеток проходят стадии деления и, для поддержания гомеостаза, часть клеток погибает, генерируя 1-10 грамм ДНК в сутки [5]. Признаками апоптоза являются, уменьшение объема всей клетки и ее ядра, а также межнуклеосомная фрагментация ДНК (с размером фрагментов кратных нуклеосоме) с последующим формированием апоптотических телец [36].
Обнаружение низкомолекулярных фрагментов ДНК размером 180 п.н. и 200 п.н. в плазме [26, 30] и сыворотке [34] онкологических больных и 185-200 п.н. в плазме здоровых доноров [31], а также фрагментов ДНК размером 370-470 п.н., 150-240 п.н., 30-40 п.н. и 20 п.н. в сыворотке больных системной красной волчанкой и здоровых доноров (хоть и в меньшем количестве) [32] служит доказательством ее апоптотического происхождения.
Обнаружение ДНК плода в крови матери [37-38] также согласуется с теорией происхождения вн/цирДНК крови в результате апоптоза. Показано, что клетки трофобласта и около половины фетальных ядросодержащих эритроцитов гибнут именно путем апоптоза. Количество фетальной ДНК (составляющее 3.4-6.2% от общего пула внеклеточной ДНК) в крови матери в 25 раз больше, чем ее же количество в интактных фетальных клетках этого же кровяного русла [39]. Доказательства апоптотического происхождения внДНК получены и в работах, проведенных на клеточных культурах [40-42]. Апоптоз индуцировали обработкой клеток такими химическими реагентами как стауроспорин (ингибитор протеинкиназ широкого спектра действия), камптотецин (индуцирует апоптоз за счет связывания с комплексом ДНК-топоизомераза I) или этопозид (ингибитор ДНК-топоизомеразы II). Апоптотические клетки, меченые анексин V-флуоресцеин изотиоционатом, выявляли при помощи проточной цитометрии. Концентрацию ДНК измеряли при помощи окраски флуорометрическим красителем PicoGreen. Было показано, во-первых, что апоптотические клетки (Jurkat) высвобождают значительно большее количество ДНК в культуральную среду, чем необработанные клетки (максимальные значения концентраций ДНК наблюдались после обработки клеток стауроспорином). Во-вторых, высвобождение ДНК из апоптотических клеток является процессом, зависимым от времени, с количеством ДНК, пропорциональным степени апоптоза, причем характер фрагментации высвобождаемой ДНК подобен характеру фрагментации ДНК, активируемой после инициации апоптоза нуклеазами.
Известно, что фагоцитирующие клетки интенсивно участвуют в удалении как клеточного дебриса [43], так и апоптотических телец [44]. В работе Pisetsky клетки Jurkat, вступающие в апоптоз, культивировали вместе с макрофагами. Было обнаружено, что культивирование с макрофагами приводит к уменьшению количества высвобождаемой в культуральную среду ДНК.
Этой же группой ученых в экспериментах in vivo было показано, что при введении самкам мышей апоптотических клеток Jurkat наблюдается рост концентрации внДНК. Концентрация ДНК достигает максимума в крови через 6 часов после инъекции, а уже через 24 часа падает ниже уровня детекции используемого метода [40].
Происхождение вн/цирДНК в результате некроза. В отличие от апоптоза, некроз не имеет такого четкого сценария развития. Процесс некроза может быть вызван жестким и необратимым вмешательством, например, травмой, высоко-дозовой радиацией, высокой температурой и/или обработкой веществами, приводящими к разрушению клеточной мембраны или блокирующими энергетические процессы [5].
Признаками некротической гибели клеток являются набухание цитоплазмы, разрыв цитоплазматической мембраны, набухание цитоплазматических органелл, умеренная конденсация хроматина и отсутствие фрагментации ДНК, характерной для апоптоза [36]. Так, например, в плазме крови, как больных пациентов, так и здоровых доноров были обнаружены высокомолекулярные фрагменты ДНК ( 10000 п.н.), что навело авторов на мысль о появлении ДНК в циркуляции вследствии некротической гибели клеток [26, 33-34]. Однако из-за отсутствия в норме некротических клеток, процесс некроза не может являться основным источником вн/цирДНК у здоровых доноров. Что же касается онкологических больных, то некротическая гибель клеток, часто наблюдаемая в опухолевых тканях в результате недостаточной васкуляризации и устойчивой ишемии, вполне может служить источником вн/цирДНК крови [5, 45].
Увеличение уже через 20 минут концентрации ДНК в крови больных, получивших травму, может объясняться как происходящими процессами некроза, так и ускоренным апоптозом. Корреляция между количеством ДНК в крови и тяжестью повреждения, полученного пациентом [46], а также быстрое увеличение концентрации внеклеточной ДНК свидетельствуют в пользу некротического происхождения циркулирующей ДНК при травме.
Гипотезам о некротическом и апоптотическом происхождении вн/цирДНК противоречат данные о 90%-ном снижении уровня ДНК в плазме онкологических больных после окончания курса радиотерапии [3]. Известно, что радиация индуцирует некроз (или апоптоз, в зависимости от дозы облучения), и такая обработка должна была бы приводить к повышению концентрации дезоксирибонуклеиновых кислот [5].
Доказательства в пользу появления внеклеточных ДНК в результате некротической гибели клеток, так же как и в случае апоптотической гибели (см. выше), были получены группой Pisetsky в экспериментах, проведенных на клеточных культурах Jurkat [40-41]. Некроз индуцировали обработкой клеток 10% этанолом или нагреванием при температуре 56С в течение 30 минут. Для того, чтобы идентифицировать живые, апоптотические и некротические клетки, их инкубировали с анексином V, меченым флуоресцеин изотиоционатом и пропидиум иодидом, с последующей проточной цитофлуорометрией. Концентрацию ДНК измеряли при помощи флуорометрической окраски PicoGreen. Было показано, что в отличие от апоптотических клеток, в культуре некротических клеток концентрация внДНК существенно ниже, что авторы авторы объясняют тем, что ДНК из некротических клеток не попадает во внеклеточную среду. Как уже упоминалось выше, макрофаги являются основными клетками, которые утилизируют клеточный дебрис [43]. В то время как при совместном культивировании макрофагов с клетками Jurkat, в которых был инициирован некроз, наблюдается высокая концентрация внеклеточной ДНК.
В экспериментах in vivo, при введении самкам мышей клеток Jurkat после индукции некроза, так же как и в случае клеток после индукции апоптоза (см. выше), наблюдается значительное увеличение концентрации внДНК. Концентрация ДНК также достигает максимума в крови через 6 часов после инъекции и падает ниже уровня детекции спустя 24 часа [40].
Происхождение вн/цирДНК в результате онкоза. Наряду с апоптозом и некрозом выделяют еще один тип клеточной смерти – онкоз [47]. Термин онкоз происходит от греческого слова, означающего «опухоль». Онкоз относится к запрограмированной клеточной смерти, характеризующейся набуханием клетки и ее органелл, а также увеличением проницаемости мембраны. Морфологические изменения клетки при онкозе включают в себя агрегацию хроматина в отсутствии явных уплотнений хроматиновых телец, разрушение лизосом, а также набухание и разрушение митохондрий. На биохимическом уровне онкоз обычно индуцируется такими патологическими стимулами как ишемия и/или реперфузия (восстановление кровотока после ишемии). Онкоз часто приводит к неспецифической фрагментации ДНК, сопровождается нарушением синтеза АТФ и повреждением митохондрий, повышением проницаемости плазматической мембраны и дисфункцией ионных насосов, которые приводят к утечке лизосомальных ферментов и внутриклеточных белков [47], в результате чего в кровотоке могут также появляться высокомолекулярные фрагменты ДНК [48].
Появление внеклеточных ДНК в крови в процессе секреции нормальными и опухолевыми клетками. Еще в 1972 году была показана возможность секреции ДНК лимфоцитами, стимулированными фитомитогенами [49]. Немного позднее Anker с соавторами были получены доказательства в пользу рассматриваемой теории, которые в тоже время опровергали апоптозно/некротическую теорию появления внеклеточных ДНК. Авторами было показано, что после инкубации клеток в течение 2-16 часов (при смене среды каждые 2 часа) количество внДНК не изменяется [50-51]. Показано, что внеклеточная ДНК является двуцепочечной и ее молекулярный вес составляет от 3.5 105 до 3.7 106 Да. Авторы делают вывод о том, что источником ДНК являются живые, а не умирающие или мертвые клетки на основании полученных данных: а) одинаковое количество ДНК было обнаружено в культуральной среде после инкубации клеток в течение 2 часов и 16 часов; б) уровень клеточной смерти не влиял на количество внеклеточной ДНК; в) после того, как лимфоциты были центрифугированы и помещены в новую культуральную среду несколько раз подряд, одинаковое количество внеклеточной ДНК было выделено из каждых последующих супернатантов, тогда как, если после центрифугирования лимфоциты помещали обратно в их «старую» культуральную среду, увеличения количества внеклеточной ДНК не наблюдалось; г) требуется более одного часа для получения максимальной концентрации внеклеточной ДНК; д) клетки, секретирующие ДНК, сохраняли свою функциональную целостность, что подтверждалось их способностью к увеличению синтеза ДНК после стимуляции.
Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы
По данным эпидемиологических исследований рак предстательной железы (РПЖ) еще в 80-е г.г. ХХ столетия был довольно редким заболеванием. К середине 90-х годов в связи с увеличением продолжительности жизни и снижением смертности населения от других конкурирующих причин РПЖ во многих странах мира стал одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. К 2004 году прирост заболевших РПЖ в мире составлял в среднем 3% в год, что позволило прогнозировать удвоение числа случаев заболевания РПЖ к 2030 г. [335]. В России рак предстательной железы в структуре онкоурологических заболеваний в 2001 г. переместился с 7 на 4 место и составил 5.9% [336], а в
2009 году – уже 10.7% от всех злокачественных новообразований, встречающихся у мужчин [337]. За последние 10 лет прирост заболеваемости РПЖ в нашей стране составил 155%. В
2010 г. первично выявленный РПЖ был разделен на III группы в зависимости от возраста пациентов: 0-59 лет – 3550 абс. число, 60-69 лет – 7986 абс. число, 70 и старше – 14732 абс. число. «Грубый» показатель прироста заболеваемости раком предстательной железы в России в 2010 г. в разных возрастных категориях составил: 0-59 лет – 338.01 случаев/1000 человек (среднегодовой темп прироста 15.6%); 60-69 лет – 181.76 случаев/1000 человек (среднегодовой темп прироста 10.91%); 70 и старше – 113.50 случаев/1000 человек (среднегодовой темп прироста 7.88%). Если постадийно распределить больных РПЖ, выявленных в 2010 г., то на долю локализованного РПЖ (I-II стадии) придется 44.8%, местно-распространенного РПЖ (III стадия) – 34.9%, метастатического РПЖ (IV стадия) – 18.5%. Пятилетняя выживаемость для местных и региональных стадий по сути составляет 100%, для РПЖ с отдаленными метастазами – только 34% [337].
Из-за отсутствия ранних клинических симптомов злокачественные опухоли предстательной железы распознаются, как правило, на стадии генерализации онкологического процесса, когда хирургическое вмешательство не может быть радикальным, а с помощью гормональных препаратов, цитостатиков и лучевой терапии не удается добиться длительного лечебного эффекта [338-339]. Это является причиной высоких показателей летальности больных РПЖ. Рак простаты характеризуется непредсказуемостью клинического течения. Некоторые опухоли остаются латентными многие годы, другие быстро прогрессируют в неизлечимые метастатические заболевания [340]. 1.3.4.2. Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы
Современные методы локального стадирования включают пальцевое ректальное исследование, определение простатического специфического антигена (ПСА), трансректальное УЗИ, секстантную биопсию, компьютерное аксиальное сканирование, внешнее и эндоректальное магнитно-резонансное исследование. Недостаточная чувствительность этих методов приводит к недооценке стадии почти у 50% больных РПЖ [28, 340]. Таким образом, актуальной проблемой при онкологических заболеваниях предстательной железы является разработка диагностических методов, обеспечивающих выявление предраковых заболеваний (облигатных и факультативных) и ранних стадий развития злокачественной опухоли. К таким методам можно отнести молекулярно-генетические, в частности, анализ изменений во внеклеточных/циркулирующих ДНК у онкологических больных.
Основные генетические изменения в ДНК (мутации, микросаттелитные изменения, изменения статуса метилирования) при развитии онкологических заболеваний предстательной железы локализованы в хромосомах: 1q, 3q, 7, 8p, 8q, 5q, 6q, 10q, 13q, 16q, 18 и Xq12 [341].
Например, Hu с соавторами показали, что уже на ранних стадиях развития РПЖ происходят изменения в гене опухолевой супрессии, кодирующем рецептор к маннозо-6-фосфат/инсулин подобному фактору роста 2 (M6P/IGF2R). Этот ген локализован в хромосоме 6q26 и обычно при раке подвергается делеции. Продукт этого гена играет важную роль в подавлении образования опухолей. Рецептор M6P/IGF2R играет ключевую роль в регуляции накопления внеклеточных протеолитических ферментов и ростовых факторов, вовлекаемых в злокачественную трансформацию клеток. Мутации в гене M6P/IGF2R происходят на ранних стадиях развития рака. Однако необходимо отметить, что ген M6P/IGF2R мутирует и при других видах онкологических заболеваний, таких как рак печени, молочной железы и легкого [342]. Поэтому исследование этого гена на наличие мутаций в тканях простаты или в различных биологических жидкостях может быть использовано только в качестве дополнительного анализа на РПЖ.
При ранней диагностике рака простаты исследуют и потерю гетерозиготности, включающую, например, определенные участки хромосомы 8р (8р12-21, 8р22). Делеция участка, супрессора опухоли, в локусе 8р обнаруживается в 80% случаев метастазирующего РПЖ [341].
Ген NKX3.1, содержащий гомеобокс, локализованный в участке хромосомы 8р12-22, является хорошим кандидатом на роль специфического супрессора опухолей простаты. Функция гена NKX3.1 заключается в регуляции транскрипции, причём одной из его мишеней является ген простатспецифического антигена (ПСА) [343]. NKX3.1 экспрессируется на всех стадиях дифференцировки простаты. Повреждения этого гена наблюдаются в 90% карцином предстательной железы и 60% интраэпителиальных неоплазий этого органа [343]. Более того, изменение экспрессии гена NKX3.1 коррелирует с потерей аллеля и ограниченным метилированием промотора данного гена [344-346]. В экспериментах на мышах было показано, что повреждение гена NKX3.1 приводит не только к дефектам роста и секреторных функций простаты, но и влияет на развитие злокачественной трансформации на ранних стадиях заболевания [347]. Изменения в гене NKX3.1 наблюдаются не только при РПЖ, но и при раке молочной железы и раке легкого [348-349], поэтому исследование экспрессии только этого гена не может дать 100% результата о наличии онкологического заболевания именно предстательной железы.
Одним из перспективных методов диагностики онкологических заболеваний предстательной железы является анализ сайтов метилирования/деметилирования ДНК в опухолевых клетках, которое приводит к гипо/гиперэкспрессии генов. К преимуществам этого подхода можно отнести: Большую стабильность ДНК по сравнению с РНК, используемой при анализе уровня экспрессии генов; При исследовании гетерозиготности измененная ДНК не выявляется в присутствии большого избытка нормальной ДНК, равно как и мутантная ДНК. Исследование сайтов метилирования промоторных областей генов позволяет преодолеть данную проблему.
При раке предстательной железы гипометилированы гены, отвечающие за дифференцировку и пролиферацию (табл. 1), контролирующие ход клеточного цикла, отвечающие за инвазию опухоли и процесс метастазирования, стабилизирующие секрецию белков слизистых оболочек и т.д. Однако гипометилирование практически всех этих генов наблюдается и при онкологических заболеваниях других этиологий, например, при раке желудка, кашечника, легкого и молочной железы [350]. На сегодняшний день известно более 50 генов, гиперметилированных при развитии рака предстательной железы [341].
Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
Обнаруженное нами изменение распределения уровня ДНК внутри группы суммарных цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, с одновременным увеличением уровня цирДНК в плазме крови больных ОЗПЖ может являться следствием изменения активности протеаз и нуклеаз крови. Известно, что повышенный уровень металлопротеиназ обеспечивает опухоли ангиогенез и активную инвазию в прилежащие ткани [427], кроме того, при некоторых типах рака наблюдается повышенная активность протеаз крови [428-429]. Так, например, было показано, что при развитии рака яичника в крови больных пациенток примерно в 2.5 раза по сравнению со здоровыми донорами увеличивается активность протеаз и каспаз (сериновая протеаза) [430]. Кроме того, в крови больных при помощи критерия Спирмана была обнаружена прямая корреляция между уровнем нуклеосом в плазме и активностью каспаз (R=0.224, Р= 0.031), а также между повышением концентрации свободной ДНК и увеличением активности протеаз (R=0.512, Р=0.0001).
В нашем исследовании мы также наблюдали, что при развитии онкологических заболеваний простаты (по сравнению со здоровыми донорами) увеличивается концентрация в плазме крови такой сериновой протеазы как kallikrein 3, широко известной под названием ПСА (описано выше) [431]. Однако нами не было обнаружено достоверной корреляции между увеличением концентрации цирДНК в плазме, ФБ-ЭДТА элюате или трипсине и повышением уровня ПСА ни у больных ДГПЖ, ни РПЖ.
Повреждение белков, связывающих цирДНК с поверхностью клеток крови, в связи с повышенным уровнем протеаз в крови может приводить к высвобождению связанной фракции цирДНК в плазму крови. Более того, наличие ингибиторов нуклеазной активности в плазме крови онкологических больных [429] может также приводить к повышению уровня свободных цирДНК в плазме крови. Кроме того, известно, что связанные с поверхностью клеток нуклеиновые кислоты лишь частично деградируют под действием ДНКазы I, что свидетельствует об их экранировании биополимерами клеточной поверхности [103, 112]. Мы также исследовали дезоксирибонуклеазную активность в крови здоровых и больных, однако результаты этого исследования будут описаны ниже.
Ранее при исследовании нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью первичных (HUVEC) и трансформированных клеток (Hela, А431) in vitro было показано, что основная часть ДНК связана с клетками, по-видимому, за счет белковых взаимодействий, т.е. содержится в трипсиновом элюате с поверхности клеток [55, 106]. Авторы показали, что в ФБ-ЭДТА элюате первичных клеток ДНК содержится около 20 нг/106 клеток, а в ФБ-ЭДТА элюате трансформированных клеток она вообще не обнаруживалась, в отличие от РНК, концентрация которой постоянно увеличивалась в первые 6 часов роста клеток до концентрации 60 нг/106 клеток для культуры Hela и 25 нг/106 клеток для А431. При этом, в трипсиновом элюате первичных клеткок, напротив, ДНК через 1 час после смены среды содержится около 115 нг/106 клеток, а через 24 часа примерно 105 нг/106 клеток. В трипсиновом элюате трансформированных клеток через 1 час концентрация ДНК снижается с последующим возрастанием до 40 нг/106 клеток для культуры Hela и 120 нг/106 клеток для А431; уровень РНК же, напротив, растет в первые 4-6 часов до концентрации 45 нг/106 клеток для Hela и 30 нг/106 клеток для А431, с последующим снижением практически до 0 нг/106 клеток.
Эти данные демонстрируют, что та часть ДНК, котрая элюируется с поверхности клеток обработкой ФБ-ЭДТА не связана с клетками прочно, и, вероятно может обмениваться с ДНК внеклеточной среды и плазмы крови. Действительно, в работе на культурах клеток Hela и А431 [106] было показано, что через 3 часа культивирования размер РНК в ФБ-ЭДТА элюате соответствует подвижности ДНК-маркера в 10 т.п.н., а в трипсиновом этюате длина фрагментов составляет 100-200 нуклеотидов, соответствуя 2.5-5S РНК. Через 24 часа в ФБ-ЭДТА элюате содержится РНК размером только 100-200 н. Что же касается ДНК, то в культуральной среде ее размер через 3 часа культивирования составляет 0.4-, 0.85-, 1.5- и 8.5-10 т.п.н., а через 24 часа лишь 8.5-10 т.п.н. Авторы предполагают, что исчезновение коротких фрагментов внеклеточной ДНК из культуральной среды может быть результатом гидролиза внеклеточными ДНКазами или захватывания клетками, т.к. короткие фрагменты ДНК были обнаружены в трипсиновой фракции через 24 часа культивирования.
Что же касается размера и строения циркулирующих нуклеиновых кислот крови, то по данным Stroun [432], Wu [34] и Deligezer [30] цирДНК плазмы в норме представлены высокомолекулярной фракцией около 20 т.п.н. В диссертационной работе Тамкович С [433] было показано, что у здоровых женщин фракция нуклеиновых кислот «слабо» связанных с поверхностью эритроцитов и лейкоцитов (ФБ-ЭДТА элюат) содержит высокомолекулярную ДНК (10-20 т.п.н.) и фрагментированную ДНК размером от 200 до 500 п.н. Кроме ДНК на поверхности эритроцитов обнаруживались и фрагменты РНК, соответствующие по подвижности ДНК размером 200-500 п.н. Фракция «прочно» связанных нуклеиновых кислот (трипсиновый элюат) содержит исключительно высокомолекулярную ДНК размером 10-20 т.п.н. В плазме и во фракциях «слабо» связанных с поверхностью клеток нуклеиновых кислот, выделенных из крови больных с фиброаденомой молочной железы, автор обнаружила одинаковые по размеру фрагменты ДНК размером 10-20 т.п.н. Фракции «прочно» связанных с поверхностью эритроцитов и лейкоцитов нуклеиновых кислот, содержат как высокомолекулярную ДНК размером 10-20 т.п.н., так и фрагментированную ДНК, основная часть которой представлена фрагментами от 50 до 200 п.н. Следует отметить, что фрагментация нуклеиновых кислот не может быть вызвана обработкой клеток трипсином (препараты трипсина могут содержать ДНКазы), поскольку для обработки клеток здоровых и больных доноров использовался тот же препарат фермента, содержащий 5 мМ ЭДТА. В крови больных раком молочной железы внеклеточные нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью клеток крови, отсутствовали, а цирДНК в плазме не отличалась от цирДНК плазмы больных доброкачественными опухолями молочной железы. Несмотря на то, что используемый Тамкович С. метод выделения нуклеиновых кислот позволяет эффективно выделять нуклеиновые кислоты размером от 50-100 п.н., автор не обнаружила коротких фрагментов ДНК в плазме крови больных раком молочной железы на II и III стадиях заболевания, в отличие от данных Wu [34], детектировавшего в сыворотке раковых больных высокомолекулярную ДНК и фрагмент ДНК длиной около 100 п.н. Автор предполагает, что это связано с появлением коротких фрагментов ДНК в сыворотке крови только у онкологических больных на поздних стадиях заболевания [30], а в работе Wu [34] стадии заболевания не приводятся. Эту гипотезу подтверждают и данные Делигейзера [30], обнаружившего ДНК размером около 200 п.н. в сыворотке крови больных лимфомами на I и II стадиях рака только в 37% случаев и в 100% - на III и IV.
Учитывая эти литературные данные, мы попытались найти взаимосвязь между изменением концентрации свободных цирДНК плазмы крови и концентрации ДНК «слабо» связанной с поверхностью форменных элементов крови (ФБ-ЭДТА элюат) у здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы. Была обнаружена прямая корреляция между концентрацией свободной цирДНК в плазме и концентрацией цирДНК в ФБ-ЭДТА буфере у пациентов с ОЗПЖ (R=0.6665, Р 0.0001) (Рис. 22). Используя шкалу Чеддока и полученный коэффициент R, можно говорить о заметной корреляции между этими пулами цирДНК в крови.
Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
При одновременном введении метилированного и неметилированного ПЦР-продуктов характеристический график, описывающий их циркуляцию в крови, представляет собой суперпозицию таковых для отдельно инъецированных ПЦР-продуктов. Таким образом, наличие в циркуляции метилированой ДНК не влияет на циркуляцию неметилированной и наоборот. Другими словами, эти ДНК не конкурируют за связывание с компонентами крови и тканей (Рис. 39Г). В целом, полученные нами данные относительно циркуляции свободной неметилированной ДНК хорошо совпадают с ранее описанными в литературе. Так, например, в работе Sands с соавторами [166] было обнаружено, что после инъекции в хвостовую вену мыши фосфоротиоатного ОДН через 5 мин в крови его остается 8%, а через 2 часа всего 0.6%. Близкие данные были получены и у Chia c соавторами [60], которые показали, что после инъекции мышам ДНК из тимуса теленка через 3 мин в крови ее остается 16%, а через 2 часа - 2%.
Через 5 минут после введения в хвостовую вену мыши плазмы крови больного РПЖ в кровотоке обнаруживается приблизительно 6% от введенной ДНК по данным метил-специфичной ПЦР метилированной формы гена GSTP1, и в течение последующих 45 минут концентрация ДНК в циркуляции падает до 2%. Затем наблюдается возрастание концентрации ДНК в крови: через 2 часа в кровотоке циркулирует около 6.1% ДНК и ее количество незначительно падает в течение последующих 2-х часов (5.7%) (Рис. 39В). Данные о длительной циркуляции в крови ДНК в составе природных комплексов (апоптотических телец и нуклеосом) коррелируют с данными работ [9], в которых было показано, что такие ДНК стабильны в течение длительного времени в плазме крови.
Данные о падении концентрации ДНК в крови с последующим ее возрастанием до начального уровня связаны, по-видимому, с депонированием ДНК в тканях и последующей диффузией депонированной ДНК в кровяное русло. Действительно, известно, что ДНК может накапливаться в ретикулоэндотелиально-богатых органах, т.е. в печени и селезенке [60, 166], однако ранее не было показано, что такая ДНК не деградирует и способна к рециркуляции. Было показано, что в составе цирДНК крови может присутствовать до 10% и более ДНК опухолевых клеток [26]. Наши данные демонстрируют, что эта величина сильно зависит от выбранной ДНК мишени и может быть справедлива для одной мишени и совершенно не справедлива для другой. Тем не менее, длительная циркуляция метилированных CpG богатых ДНК как свободных от биополимеров, так и находящихся в составе природных комплексов подтверждает их ценность в качестве потенциальных ДНК-онкомаркеров. Действительно, при условии большей стабильности таких последовательностей происходит обогащение пула цирДНК этими последовательностями, что упрощает их детекцию.
Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что 1) свободная ДНК длительно циркулирует в кровяном русле; 2) метилированная ДНК стабильнее неметилированной; 3) внДНК плазмы человека циркулирует в кровотоке мыши в течение длительного времени и доля метилированной ДНК в пуле суммарных ДНК со временем возрастает, что говорит о большей стабильности метилированной ДНК по сравнению с неметилированной.
Исследование различий в паттернах метилирования цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
Известно, что многие маркеры, часто встречаемые в образцах опухолевой ткани, обнаруживаются в составе цирДНК крови с существенно меньшей частотой. Очевидной причиной такого несоответствия является зависимость стабильности ДНК в крови от ее упаковки, нуклеосомной укладки, структуры и т.д. [62-65]. В аналитических обзорах, посвященных анализу диагностического потенциала цирДНК [4, 212], приведены документальные и логические обоснования того, что создание онкодиагностикумов, основанных на использовании цирДНК крови, требует поиска ДНК-онкомаркеров именно в пуле цирДНК крови онкологических больных. Однако в соответствие с данными Diehl с соавторами концентрация ДНК опухолевых клеток в общем пуле цирДНК может варьировать в диапазоне от 0.005% до 11.7% [454]. По данным других авторов, которые использовали для оценки количества опухолеспецифической ДНК количественную метилспецифичную ПЦР промоторной области гена CDKN2, количество опухолевой ДНК в пуле суммарной цирДНК крови составляет от 3 до 93% [26]. Наши данные тоже свидетельствуют о том, что цирДНК обогащены метилированными последовательностями. Для того чтобы оценить возможность выявления онкоспецифических аберрантно-метилированных ДНК при помощи секвенирования или иных подходов, ориентированных на поиск ДНК маркеров, мы исследовали статус метилирования цитозинов промоторной области гена GSTP1 (1001–1302, X08058) в пулах цир/внДНК, выделенных из крови и мочи здоровых доноров, больных доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы методом секвенирования по Сенгеру (п. 2.2.13.). ЦирДНК обрабатывали бисульфитом натрия и амплификацировали промоторную область гена GSTP1 при помощи [32Р]-меченого прямого или обратного праймеров, не содержащих в своем составе СpG динуклеотидов (т.е. амплифицировали и метилированную, и неметилированную последовательности ДНК). После очистки при помощи акриламидного гель-электрофореза, полученные ПЦР-продукты подвергали анализу методом Сэнгера.
Проведенный анализ показал, что данные о статусе метилирования ДНК при онкологических заболеваниях предстательной железы могут быть получены путем секвенирования цирДНК крови и внДНК мочи. ДНК, выделенная из мочи, плазмы крови, ФБ-ЭДТА и трипсиного элюатов с поверхностей клеток крови у всех больных раком простаты имеет одинаковый профиль метилирования промоторной области гена GSTP1, не зависящий от стадии заболевания (Рис. 40С). Однако профиль метилирования цитозинов изучаемого гена во внДНК больных раком предстательной железы отличается от профиля метилирования ДНК здоровых доноров и больных ДГПЖ (Рис. 40). Все цитозины в составе промоторной области гена GSTP1 в группах здоровых доноров и больных ДГПЖ неметилированы, тогда как в группе больных раком простаты все цитозины метилированы (Рис. 40, 41).
Полученные данные показывают, что, несмотря на присутствие в крови и моче больных раком простаты неметилированных фрагментов промоторной области гена GSTP1, количество метилированных фрагментов этого гена достаточно для того, чтобы получить данные о локализации метилированных цитозинов прямым секвенированием цирДНК. Поскольку ДНК была амплифицирована с использованием праймеров, не содержащих CpG-сайтов, можно сделать вывод о значительном вкладе цирДНК опухолевого происхождения в общий пул внДНК.
Таким образом, была показана принципиальная возможность получать информацию относительно профиля метилирования областей отдельных генов при помощи секвенирования, что позволило перейти к следующему этапу работы, направленному на поиск онкомаркеров при помощи микрочипов, предназначенных для поиска метилированных последовательностей человеческого генома.
