Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот 9
крови
Методологические подходы к исследованию концентрации 9 циркулирующей ДНК в плазме крови в норме и при патологии
Форма циркуляции и особенности строения внеклеточных 19 дезоксирибонуклеиновых кислот крови
Методологические подходы к исследованию концентрации 27 циркулирующей РНК в плазме крови в норме и при патологии
Форма циркуляции и особенности строения внеклеточных 30 рибонуклеиновых кислот крови
Факторы, влияющие на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови 32
Влияние нуклеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови 32
Влияние протеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови 36
1.2. Механизмы, приводящие к появлению в крови циркулирующих 40
нуклеиновых кислот
Апоптоз и некроз как - возможные источники появления внеклеточных 42 нуклеиновых кислот в крови
Активная секреция нуклеиновых кислот во внеклеточную среду 44
Биологическая роль внеклеточных нуклеиновых кислот в крови 46
Использование внеклеточных нуклеиновых кислот крови в 51 практической медицине
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 58
2.1. Материалы 58
Реактивы и препараты 5 8
Лабораторные животные 59
Образцы крови 59
Оборудование 59
2.2. Методы 60
Приготовление Р меченых фрагментов ДНК 60
Методы выделения ДНК из плазмы крови 61 2.2.2.1. Выделение ДНК методом фенольпой очистки 62 2.2.2.2.Метод выделения ДНК после осаждения комплексов белков с SDS 62
2.2.2.3. Метод выделения ДНК осаждением комплексов белков с SDS и 62
осаждения полисахаридов обработкой перхлоратом натрия
2.2.2.4. Метод выделения ДНК осаждением комплексов белков с SDS и осаждения 62
полисахаридов обработкой перхлоратом натрия, с последующей
экстракцией липидов смесью хлороформ : изоамиловый спирт
2.2.2.5. Метод сорбции ДНК на стеклянные частицы 63
б. Метод сорбции ДНК на модифицированном стекле 63
Культивирование клеток 63
Методы выделения РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток 64 линии А431
Метод феиолъной экстракции 64
Фенол-гуанидиновый метод 64
Выделение РНК при помощи модифицированнго стекла 65
Оценка эффективности выделения РНК длиной 96 н. при помощи сорбции 66 на модифицированном стекле
Приготовление растворов ДНК и РНК для построения калибровочных 66 кривых
2. 2.7. Взятие крови и приготовление элюатов с поверхности эритроцитов и 67
лейкоцитов
2.2.8. Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме 68
крови и клеточных элюатах
2.2.9. Исследование размера внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме и 69
элюатах с поверхностей клеток крови
Изготовление конъюгатов и иммунизация животных 70
Изготовление сорбентов и выделение антител методом аффинной 71 хроматографии
Выделение специфических антител 73
Изготовление конъюгатов антител с пероксидазой хрена 74
Определение протеазной активности при помощи иммуноферментного 75 анализа
2.2.15. Приготовление модифицированного субстрата для определения 76
дезоксирибонуклеазной активности
Определение нуклеазной активности при помощи иммуноферментного 78 анализа
Статистическая обработка данных 78
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 79
Разработка методов выделения и определения концентраций 80 циркулирующих нуклеиновых кислот
Определение концентрации ДНК и РНК при помощи флуоресцентных 88 красителей Hoechst 33258 и SYBR Green II
3.3. Влияние метода сбора крови и хранения образцов на концентрацию 93
внеклеточных нуклеиновых кислот
3.4. Свободные и связанные с поверхностью клеток внеклеточные нуклеиновые 97
кислоты в крови здоровых доноров
Особенности циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот у больных 102 с доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы
Исследование размера внеклеточных нуклеиновых кислот крови 108
Исследование факторов, влияющих на длительность циркуляции 113 внеклеточных нуклеиновых кислот
Исследование нуклеазной активности плазмы крови и ФБ-ЭДТА элюатов 113 здоровых доноров и больных с опухолями молочной железы
Определение протеазной активности плазмы крови и ФБ-ЭДТА элюатах 119 здоровых допоров и больных с опухолями молочной железы
ВЫВОДЫ 128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 130
Список сокращений
GAPDH глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназа
SDS - додецилсульфат натрия
БСА - бычий сывороточный альбумин
БФС - бромфеноловый синий
ГТЦ - гуанидина тиоцианат
ДЭПК - диэтилпирокарбонат
ММП - матриксная металлопротеаза
ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТБ -трисовый буфер (0.01 М трис-HCl (рН 7.5), содежащий 0.15 М NaCl)
Трис-трис-(гидроксиметил)аминометан
ФБ - фосфатный буфер (0.01 М фосфатный буфер (рН 7.5), содежащий 0.15 М NaCl)
ФИТЦ - флуоресцинизотиоцианат
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Введение к работе
До недавнего времени считалось, что в организме эукариот дезоксирибонуклеиновые кислоты локализованы исключительно в клеточных структурах: преимущественно в ядрах клеток и, частично, в митохондриях, где они отвечают за хранение, воспроизводство и экспрессию генетической информации. Вне клеток нуклеиновые кислоты были обнаружены только при таких заболеваниях как системная красная волчанка [3] или в случае массированного воздействия ионизирующего излучения [4]. При этом внеклеточные нуклеиновые кислоты считались биологически инертным материалом, а появление антител против ДНК у аутоиммунных больных [5] рассматривалось как исключение из правил. Однако постепенно накапливались данные о биологической активности нуклеиновых кислот. Было показано, что нуклеиновые кислоты могут взаимодействовать с поверхностными белками клеток [6] и белками крови [7], причем такое взаимодействие может быть как сиквенс неспецифичным [7], так и зависящим от последовательности оснований [8]. Было обнаружено иммуномодулирующее действие неметилированных CpG богатых фрагментов ДНК [9,10], и некоторых структур, образуемых дезоксирибонуклеиновыми кислотами (триплексы, палиндромы) [11]. Иммуномодулирующие свойства ДНК и ее способность сиквенсспецифично взаимодействовать с молекулами белков уже пытаются использовать в практической деятельности для стимуляции субпопуляций лейкоцитов [12] и создания медицинских противосвертывающих препаратов на основе аптомеров [13].
В последние годы было установлено, что вне клеток, и прежде всего в плазме крови животных и человека в норме и при патологиях, обнаруживаются эндогенные внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты [14]. Показано, что при онкологических заболеваниях в крови больных появляются онкоспецифические ДНК [15, 16], [17], характеристические ДНК обнаруживаются в кровотоке и при других заболеваниях, связанных с трансформацией клеток [18]. Более того, в крови беременных обнаруживаются циркулирующие нуклеиновые кислоты плода [19]. Очевидно, что внеклеточные ДНК крови могут быть использованы для разработки методов медицинской диагностики, что и продемонстрировано в ряде исследований [20,21].
Долгое время считалось, что в плазме крови рибонуклеиновые кислоты не могут долго циркулировать в связи с высоким уровнем рибонуклеазной активности [22].
Отдельные данные об их возможной рециркуляции в составе комплексов с белками рассматривались скорее как исключение из правил [23]. Однако в последнее время при помощи метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией обнаружено значительное количество мРНК онкогенов в пуле внеклеточных рибонуклеиновых кислот. Например, при раке молочной железы в сыворотке обнаруживается мРНК цитокератина 19 и мРНК маммоглобина, которые в сыворотке здоровых доноров не детектируются [24], а в крови здоровых доноров выявлены мРНК генов домашнего хозяйства [25]. В настоящее время концентрация внеклеточной РНК в норме и при патологических состояниях не исследована. Одной из причин этого, по-видимому, может являться общеизвестный факт их нестабильности и отсутствие простых скрининговых методов селективного определения концентрации рибонуклеиновых кислот.
Механизмы, приводящие к появлению и обеспечивающие долговременную циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кислот, равно как и их биологические функции в настоящее время мало исследованы. По данным одних авторов основными процессами, приводящими к появлению циркулирующих нуклеиновых кислот являются апоптоз и некроз [15]. По данным других авторов, клетки могут активно секретировать нуклеиновые кислоты и этот процесс также вносит вклад в появление внеклеточных нуклеиновых кислот в кровотоке [9, 26]. Патогенетические процессы, приводящие к повышению уровня внеклеточных нуклеиновых кислот в крови при заболеваниях практически не исследованы, однако получены предварительные данные о наличии корреляций между концентрацией внеклеточной ДНК крови и развитием таких заболеваний как рак молочной железы [20], рак легкого [21], рак желудочно-кишечного тракта [14], системная красная волчанка [3]. Очевидно, что исследование процессов, обеспечивающих появление и циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кислот, а также понимание их физиологической роли позволит получить новые данные о механизмах патогенеза рака и других заболеваний, сопровождающихся изменением уровня циркулирующих в крови нуклеиновых кислот.
Для выяснения биологической роли и диагностической ценности определения концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот необходимо детальное исследование особенностей циркуляции нуклеиновых кислот в крови, факторов, влияющих на их концентрацию в крови, а также достоверное выявление корреляций в изменении концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот крови с развитием патологий. Для такого исследования необходимы высокопроизводительные, чувствительные и точные
методы определения концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот, а также методы, позволяющие исследовать влияние внеклеточных нуклеаз и протеаз на циркуляцию нуклеиновых кислот в крови.
Целью настоящей работы являлась: 1). Разработка количественных методов анализа внеклеточных нуклеиновых кислот; 2). Исследование особенностей циркуляции дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот в крови здоровых доноров и онкологических больных; 3). Исследование факторов, влияющих на циркуляцию в крови внеклеточных нуклеиновых кислот.
