Введение к работе
Актуальность проблемы
Анализ данных современной литературы позволил сформулировать то, что свидетельствуют о целесообразности избранного нами направления исследований: 1. Состояние гемостаза при разных заболеваниях и внешних воздействиях, в том числе и санологических, обычно оценивают по немногим показателям или их сочетаниям, не позволяющим судить об интенсивности взаимодействия тромбин-фибриноген (ВТФ) в кровотоке, и это не всегда позволяет оценить интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) [Б.А Кудряшов, 1975; А.Ш.Бышевский и др., 1987; 1990; Б.И.Кузник, 2010: K. Talbot e.a., 2010]. 2. Интенсивность НВСК характеризует степень напряжения в гемостазе [Д.М.Зубаиров, 2000; А.П. Момот, 1990; А.Ш.Бышевский и др., 2001; З.С.Баркаган, 1998; Т.А.Батрак, 1999; О.Ф.Мысник и др., 2000: В.Ф.Киричук и др., 2002; I.Haszon e.a., 2003; H.M.Spronk e.a., 2003], определяя в значительной мере наклонность к гипер- или гипокоагулемии [З.С.Баркаган, 1998; Д.М Зубаиров и др., 1989; И.Н.Бокарев, 2000, 2002; I.Haszon e.a., 2003; M , 2004], что доказано при изучении НВСК в циркадном и сезонном ритмах [В.П.Балуда и др., 1978; А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников, 1986], а в последние годы - в эксперименте и в клинике [Е.А.Винокурова, 2003; Л.А.Васильев, 2009; В.В.Кондаков, 2009; Е.М.Шаповалова, 2009: S.Y.Joo e.a., 2010]. 3. Из клеток крови и эндотелиоцитов тромбоциты (ТЦ) важнейшие регуляторы свертывания; будучи полифункциональными, они могут быстро изменять гемокоагуляцию в разных регионах, особенно в микроциркуляции [Д.М.Зубаиров, 1978; Б.И.Кузник и др. 1989; Б.И.Кузник, 1990, 2010; С.А.Шитикова, 2000]; активация ТЦ или снижение их коагулоактивности нередко обусловливает формирование тромбофилической или гемофилической наклонности, что подтверждено наблюдениями за состоянием ТЦ при гиперкоагулемии первичной и вторичной [А.Ш.Бышевский и др., 1996, 2005; G.Caimi e. a., 1995]. 4. Свойство ЦТ изменять гемостатический потенциал связано с их активацией, включающей сдвиги, из которых важны и могут контролироваться их способность к агрегации, к реакции высвобождения (секреция содержимого плотных и a-гранул) [Б.И.Кузник и др. 1989, 1990, 2010; С.А.Шитикова, 2000; З.С.Баркаган, 1988; 1998; G.Nubile e. a., 1982; R.Nosal e. a., 1995; F.R.Dembitzer e.a., 2010].
5. Клиницисты используют как лечебные средства соединения, которые тормозят агрегацию ТЦ и реакцию высвобождения, воздействуя на механизмы этих процессов (поиск таких средств воздействия не прекращается); течение агрегации можно модифицировать на разных стадиях трансформации арахидоновой кислоты. Особенно эффективны воздействия на уровне катализируемых циклооксигеназой превращений, ведущих к образованию эндоперекисей. К средствам воздействия на агрегацию ТЦ относятся широко применяющиеся (и не только как антиагреганты) ацетилсалициловая кислота (АСК) и индометацин - ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы превращений арахидоновой кислоты на уровне её высвобождения из фосфолипидов мембран (антагонисты Са2+, некоторые местные анестетики, противовоспалительные средства) [К.М.Лакин, 1988; А.И.Грицюк, 1994; А.Ш.Бышевский и др., 1996; С.А.Шитикова, 2000; T.G.Oliveira e.a., 2010], а также антиоксиданты, способные снижать агрегацию ТЦ – в их числе витамины [С.Л.Галян, 1993; В.Г.Соловьев и др., 2007; Е.М.Шаповалова и др., 2007; А.Ш Бышевский и др., 2009; Л.А.Васильев, 2010; M.Steiner, 1993; D.Xiao e. a., 1995; K.Takeshita e.a., 2009].
Связь агрегационной активности ТЦ с наклонностью к гипо- или гиперкоагулемии, и то, что интенсивность НВСК отражает степень напряжения гемостаза, а сдвиги НВСК определяют наклонность к тромбофилии или к кровоточивости, данные о возможности ограничивать агрегационную способность ТЦ ингибиторами образования тромбоксана А2, обосновывают необходимость изучить характер зависимости между коагулоактивностью ТЦ и их способностью осуществлять высвобождение фф. Р3 и Р4, с одной стороны, НВСК и толерантностью к тромбину с другой при введении нередко используемых в клинике ингибиторов циклооксигеназы (АСК, индометацина, делагила, мепакрина, дазоксибена).
Цель работы
Экспериментально изучить эффекты АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена - ингибиторов трансформации арахидоновой кислоты биомембран - на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину; оценить связи между динамикой сдвигов коагулоактивности тромбоцитов, НВСК и ТкТР при введении этих ингибиторов порознь и на фоне антиоксидантов.
Задачи исследования
1. Оценить дозазависимость эффектов АСК и индометацина (ингибиторы превращений арахидоновой кислоты на этапах, катализируемых циклооксигеназой), на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на НВСК и ТкТР;
2. Изучить дозазависимость эффектов делагила и мепакрина (ингибиторы высвобождения арахидоновой кислоты, инициируемого фосфолипазами) на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на НВСК и ТкТР;
3. Изучить дозазависимость эффекта дазоксибена (ингибитор превращений арахидоновой кислоты на уровне тромбоксансинтетазы) на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, а также на НВСК и ТкТР;
4. Охарактеризовать длительность эффектов этих антиагрегантов (в DI50%) на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на НВСК и ТкТР;
5. Изучить эффекты ретинола и токоферола, эффект АСК на их фоне (по тем же показателям); 6. Оценить ассоциативные связи сдвигов агрегационной и высвобождающей способности ТЦ между собой и с динамикой сдвигов НВСК и ТкТР.
Дизайн экспериментов
1. При питании сбалансированным рационом без добавок ( N=15),
2. При однократном введении антигрегантов в составе рациона в DI50% и в дозах, превышающих или недостигающих DI50% (N =15)
3. При однократном введении в составе рациона DI50% АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена и отбором проб крови через 4, 24, 48 и 72 часа (N=15);
4. При введении антиагрегантов животным, получавшим предварительно димефофсон или витамины антиоксиданты (ретинол и токоферол)(N=15).
Научная новизна
1. Впервые выявлена линейная зависимость между дозой и степенью снижения агрегационных свойств ТЦ, плазменного уровня фф. Р3, Р4 и маркеров НВСК, показано (ранговая корреляция), что связи между дозой и изменениями показателей коагулоактивности ТЦ, их способности к реакции высвобождения и интенсивностью НВСК тесно положительно ассоциированы (значения sr везде не ниже 0.88).
2. Впервые обнаружено, что при введении этих антиагрегантов сдвиги показателей коагулоактивности и высвобождающей активности ТЦ, интенсивности НВСК ассоциированы тесно отрицательно со сдвигами толерантности к тромбину при разных дозах и в разные сроки после введения препаратов (значения sr - между 0.88 и 0,92), что влияние АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена в DI50% на все величины сохраняется до 72 ч, постепенно ослабляясь (исключение: эффекты дазоксибена – они ослабляются быстрее, чем действие четырёх других антиагрегантов).
3. Так же установлено, что в DI50% АСК и индометацин (ингибиторы превращений арахидоната, катализируемых циклооксигеназой), делагил и мепакрин (ингибиторы высвобождения арахидоната) и дазоксибен (ингибитор тромбоксансинтетазы), вводимые со сбалансированным по микро- и макронутриентам пищевым рационом, через 4 ч заметно ограничивают спонтанную и АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов (достоверно уменьшают МА, Т, 1/2Т и tg), замедляют реакцию высвобождения факторов Р3 и Р4, вызывают снижение плазменного уровня маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) и повышают толерантность к тромбину (ТкТР).
4. Доказано, что витамины-антиоксиданты ретинол и токоферол, вводимые одновременно в дозах, адекватных лечебным, вызывают за две недели такое же снижение агрегационных и высвобождающих свойств ТЦ, интенсивности НВСК и повышение толерантности к тромбину, какое наблюдается после введения АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена в DI50%, и что эффекты АСК на фоне предварительного обогащения рациона ретинолом и токоферолом суммируются с их эффектами.
Теоретическая и практическая значимость
Значимость полученных результатов заключается в обнаружении тесной положительной ассоциации между способностью исследованных антиагрегантов угнетать агрегацию ТЦ (особенно спонтанную), их реакцию высвобождения и снижать интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови. Это подтверждает пока ещё недостаточно обоснованные представления, согласно которым агрегация ТЦ инициирует ускорение реакции высвобождения, а также представление об инициирующей роли ТЦ в ускорении непрерывного внутрисосудистого свертывания. Полученные данные подтверждают также целесообразность использовать антиоксиданты как средства, позволяющие уменьшать дозу антиагрегантов.
Совместно с кафедрой биологической химии ЧелГМА, с сотрудниками кафедр биологической химии, гигиены с основами экологии ТюмГМА разработаны и внедрены для обучения студентов и для использования в лечебных учреждениях г. Тюмени (ГЛПУ ТО ОКБ № 1) и области (ГЛПУ ТО ОКБ №11 р.п. Голышманово) методические рекомендации, оформленные актами: «Влияние ингибиторов превращений арахидоновой кислоты на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину».
Результаты, полученные при выполнении работы, используются в обучении студентов по курсам «Гигиена с основами экологии» и «Биохимия»
Положения, выносимые на защиту
1. Антиагреганты, тормозящие трансформацию арахидоновой кислоты тромбоцитарных мембран (АСК и индометацин - ингибиторы циклооксигеназы, делагил и мепакрин - ингибиторы превращений арахидоната, и дазоксибен - ингибитор превращений арахидоновой кислоты на уровне тромбоксансинтетазы) при однократном введении DI50% со сбалансированным рационом питания достоверно снижают через 4 ч агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ и повышают толерантность к тромбину в примерно одинаковой степени.
2. Эффекты АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови дозазависимы и тесно положительно ассоциированы между собой (величины коэффициента sr находятся между 0,85 и 1,00). Сдвиги агрегационной и высвобождающей способности ТЦ, сдвиги скорости НВСК за время, прошедшее после введения АСК, индометацина или делагила носят близкий к линейному характер, сохраняют положительную связь между собой (коэффициенты R2 и sr. не ниже 0,87 и 0,86 соответственно).
3. Избыток ретинола и токоферола, вводимых в течение двух недель, влияет на агрегацию, реакцию высвобождения, НВСК и толерантность к тромбину в том же направлении, что и все изученные нами антиагреганты, а эффект АСК на гемостаз на фоне этих витаминов-антиоксидантов суммируется с их эффектом.
4. При введении АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена, ретинола с токоферолом или АСК на их фоне сдвиги агрегации, реакции высвобождения тромбоцитов, интенсивности НВСК ассоциированы тесно отрицательно со сдвигами толерантности к тромбину (sr не ниже -0,83 во всех парах).
Апробация
Основные положения диссертации доложены на III Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2010), на Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 4 в журналах рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 4 - в других медико-биологических журналах, опубликована 1 глава в монография (Москва: издательство «Медицина» - 2006. - 96 с)
Объем и структура диссертации
