Содержание к диссертации
Введение
1. Витамин Е и гемостаз (обзор литературы) 10
1.1. Токоферол и гемостаз 12
1.2. О соотношении липидпероксидации и гемостаза в организме 33
2. Материалы и методы исследований 45
3. Результаты исследований 52
3.1. Изменения липидпероксидации антиоксидантного потенциала тромбоцитов, их коагулоактивности и плазменного уровня маркеров НВСК в отсутствии и при дефиците токоферола 52
3.2. Изменения в тромбоцитах ЛПО, АОП, коагулоактивности, плазменного уровня маркеров НВСК и ТкТР при содержании токоферола в рационе в количестве, эквивалентном малым и средним лечебным дозам 54
3.3. Динамика изменений ЛПО и АОП в клетках крови при введении токоферола в дозе, превышающей потребность в 6 раз (9 мг/сут) 57
3.4. Интенсивность НВСК и коагулоактивность тромбоцитов после внутривенного введения крысам клеток крови, выделенных у крыс, неполучавших токоферол и получавших его в разных количествах 59
3.5. Содержание маркеров внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину при тромбинемии, моделируемой на фоне Е-авитаминного питания и питания рационом с токоферолом
4. Обсуждение и заключение 75
5. Выводы 101
- О соотношении липидпероксидации и гемостаза в организме
- Изменения липидпероксидации антиоксидантного потенциала тромбоцитов, их коагулоактивности и плазменного уровня маркеров НВСК в отсутствии и при дефиците токоферола
- Динамика изменений ЛПО и АОП в клетках крови при введении токоферола в дозе, превышающей потребность в 6 раз (9 мг/сут)
- Интенсивность НВСК и коагулоактивность тромбоцитов после внутривенного введения крысам клеток крови, выделенных у крыс, неполучавших токоферол и получавших его в разных количествах
Введение к работе
Актуальность. Анализ литературы последних десятилетий позволяет сформулировать некоторые положения, обоснованные результатами исследований, представленных значительным числом публикаций и касающихся темы, разрабатываемой нами.
-
Состояние системы гемостаза - одной из важнейших систем жизнеобеспечения - зависит от интенсивности свободнорадикальных процессов, в их числе процессов липидпероксидации [А.Ш.Бьшіевский и др., 2000, 2003, 2009; Г.А.Сулкарнаева, 2004, 2006; Р.Г.Алборов, 2004, 2006; A.Gorlach е.а., 2003; K.Pawlak е.а. 2003; A.E.Goga е.а., 2009], и эта зависимость является двусторонней.
-
Антиоксиданты, в их числе и витаминной природы, ограничивают in vivo ли-пидпероксидацию (ЛПО), и поэтому замедляют непрерывное внутрисосудистое свертывание крови [А.Ш.Бышевский и др., 2008; С. Antoniades е.а., 2003; A.V.Solov'eva, 2008]; введение прооксидантов, ускоряя ЛПО, сопровождается интенсификацией непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) [Е.А. Винокурова, 2006; Е.М.Шаповалова и др., 2008; N.Kaul е.а., 2008].
-
Влияние ЛПО на гемостаз предположительно реализуется за счет накопления в кровотоке первичных и вторичных липидпероксидов, усиленно продуцируемых клетками крови, особенно тромбоцитами и в меньшей степени эритроцитами и лейкоцитами [Р.Г.Алборов и др., 2005], антиоксиданты снижают активность тромбоцитов, ограничивая их способность к агрегации и к реакции высвобождения [Р.Г.Алборов, 2006; O.Hussein е.а., 2008]
4. Эритроциты, нейтрофилы и моноциты экспонированнные с тромбоцитами
нормальной плазмы повышают их активность, что проявляется повышением способ
ности кровяных пластинок к агрегации и к реакции высвобождения. При экзогенной
гипертромбинемии на фоне повышенного антиоксидантного потенциала (АОП), вы
званного введением витаминов-антиоксидантов, прирост способности эритроцитов и
лейкоцитов активировать тромбоциты ограничивается [A.Sh.Bishevsky е.а., 2004;
L.M.Bermejo е.а., 2007; G.Denas е.а., 2009].
5. Опубликованы работы, в которых рассмотрены данные литературы, посвящен
ной влиянию витаминов на гемостаз [А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников, 1991;
В.П.Мищенко и др., 2005; Q.Li е.а., 2009], при знакомстве с ними обращает на себя
внимание следующее: а) изучались в этом плане преимущественно витамины А, В5,
Bi2, Е и С, из них наиболее детально - витамины А и Е, причем особое внимание
уделено токоферолу (ТФ), который является одним из важных природных антиокси-
дантов, широко используемым в медицинской практике как компонент многих офи-
цинальных поливитаминных препаратов; б) эффекты дефицита или дополнительного
введения ТФ, как и других витаминов, на свертывание крови оценивали, определяя
активность отдельных про- и антикоагулянтов в циркулирующей крови, что не по
зволило однозначно решить, вызывает назначение ТФ наклонность к активации ге
мостаза или снижает его активность [А.Ш.Бышевский, 1978,1991; Е.М.Шаповалова,
С.Л.Галян и др. 2008; F.Violi е.а., 2009]; в) экспериментаторы лишь в единичных
случаях использовали сбалансированные по микро- и макронутриентам рационы пи
тания, а в клинических исследованиях редко оценивали степень обеспеченности ор
ганизма пациента витаминами, в том числе и теми, которые вводили в терапевтиче
ский комплекс. Все сказанное, особенно данные о роли тромбоцитов в существова
нии связи гемостаз-липидпероксидация, определило направление планируемого на
ми экспериментального исследования.
Цель исследования
Используя в экспериментах сбалансированный пищевой рацион, изучить механизм влияния дефицита и избытка токоферола на липидлероксидацию и коагулоак-тивность тромбоцитов, на интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину - показатели, интегрально характеризующие состояние гемостаза.
Задачи исследования
-
Изучить динамику изменений липидпероксидации в тромбоцитах, их коагуло-активности и плазменного уровня маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови у крыс, содержащихся на Е-авитаминном рационе и рационе, включающем токоферол, в количестве, равном суточной потребности, 25,50 и 75% от неё.
-
Изучить динамику тех же величин при содержании крыс на рационе, включающем токоферол в количестве, эквивалентном его малым и средним лечебным дозам.
-
Изучить изменения липидпероксидации и антиоксидантного потенциала в тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и эритроцитах при содержании в рационе токоферола в количестве, превышающем суточную потребность.
-
Изучить интенсивность НВСК, коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тромбину после внутривенной инфузии крысам клеток крови, вьщеленных у крыс-доноров, неполучавших токоферол и получавших его в разных количествах
-
Изучить интенсивность НВСК, коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тромбину на моделях гипертромбинемии, создаваемых на фоне Е-авитаминного рациона и рациона с токоферолом.
Научная новизна
Впервые установлено, что отсутствие токоферола в рационе, сбалансированном по содержанию других нутриентов, ведет у крыс к ускорению перекисного окисления липидов и снижению антиоксидантного потенциала в тромбоцитах и в меньшей степени в моноцитах, нейтрофилах и эритроцитах.
Показано, что внутривенное введение тромбоцитов крыс, которые получали Е-авитаминный рацион, увеличивает у крыс-реципиентов коагулоактивность тромбоцитов, ускоряет непрерывное вігутрисосудистое свертывание крови и снижает толерантность к тромбину, а инфузия моноцитов, нейтрофилов и эритроцитов сопровождается теми же, но менее выраженными сдвигами. Впервые выявлена и охарактеризована зависимость степени изменений интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантности животных к тромбину от антиоксидантного эффекта токоферола в его отсутствии, дефиците или избытке в питании. Установлено также, что отсутствие токоферола в рационе усугубляет гипертромбине-мию, связанное с нею ускорение непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и снижение толерантности к тромбину, вызываемое неодинаковыми по природе воздействиями (введение адреналина, тромбина, кровопотеря, сезонные сдвиги), а его избыток ослабляет эффекты гипертромбинемии.
Практическая значимость
Полученные результаты позволяют рекомендовать при заболеваниях, протекающих с наклонностью к гиперкоагуляции, осуществление контроля состояния тромбоцитарного звена гемостаза, уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови и обеспеченность токоферолом, что позволит оценить целесообразность включения токоферола в комплекс терапии при таких состоянии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Отсутствие токоферола в рационе, сбалансированном по остальным нутриен-там, ускоряет липидпероксидацию и снижает антиоксидантний потенциал в тромбоцитах, в меньшей мере в моноцитах, нейтрофилах и эритроцитах, сопровождаясь ростом коагулоактивности тромбоцитов, ускорением непрерывного вігутрисосуди-стого свертывания крови и снижением толерантности к тромбину.
-
Введение в рацион токоферола в количествах, составляющих часть суточной потребности, ослабляет эти сдвиги, а в количествах, эквивалентных лечебным дозам, замедляет липидпероксидацию, повышает антиоксидантную активность тромбоцитов, снижает их коагулоактивность, замедляет непрерывное вігутрисосудистое свертывание крови и нормализует толерантность к тромбину.
-
При внешних воздействиях, сопровождающихся ускоренным тромбиногене-зом, отсутствие токоферола в рационе усугубляет вызываемое тромбинемией повышение коагулоактивности тромбоцитов, ускорение пепрерьшного вігутрисосудистого свертывания крови и снижение толерантности к тромбину; на фоне токоферола в количестве эквивалентном минимальной лечебной дозе, сдвиги, обусловленные тромбинемией, ослабляются.
-
Изменения липидпероксидации, вызываемые отсутствием в рационе токоферола тесно положительно связаны с коагулоактивностью тромбоцитов и интенсивностью непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, тесно отрицательно ассоциированы с толерантностью к тромбину. Аналогичны эти связи и при избытке токоферола в рационе. Влияние токоферола на коагулоактивность тромбоцитов, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину реализуется в значительной мере за счет его антиоксидантних свойств.
Апробация и публикация
Результаты работы доложены на научной конференции Регионального отделения ВБО (Тюмень, 2007), на заседании Тюменского регионального отделения ВБО (2009), на 3-й международной научной конференции (Варадеро, Куба, 2008), на международной научной конференции (Москва, 2008), на Российской конф. «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), на совместном заседании кафедр биохимии и гигиены с основами экологии ТГМА (2008) и опубликованы: в медико-биологических журналах — 9 статей; в виде двух глав в монографии «Влияние важнейших витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутри-сосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину». М.: Медицинская книга. - 2009 (всего 11 публикаций).
Объем и структура работы
О соотношении липидпероксидации и гемостаза в организме
Перекисное окисление липидов (липидпероксидация или ЛІТО) протекает как совокупность радикально-цепных реакций с вырожденным разветвлением. Использование кислорода в них осуществляется по одному из двух путей - оксидазному и оксигеназному.
Первый из них - оксидазный путь, представляет собой четырёхэлектронное восстановление 02 с образованием воды. Реализуется этот путь конечным звеном дыхательной цепи -цитохромоксидазой.
Оксигеназный путь осуществляется включением одного или двух атомов кислорода в молекулу субстрата. В реакциях этого пути полное восстановление кислорода не происходит, поэтому и могут образовываться его активные формы - супероксиданионрадикал, перекись водорода и гидроксильный радикал (02\ Н202 и НО" соответственно) [Ю.А.Владимиров, 1987, 1998; 2005; B.Olas, Z.Wachowicz, 2003]. Накопление активных форм кислорода ведет к дисбалансу в соотношении субстратов окисления, переносчиков 02 и Н2 (гипоксия, гипероксия, реоксигенация), усиленному выбросу катехоламинов при стресс-ситуациях [В.В. Давыдов, 2004], накоплению металлсодержащих комплексов переменной валентности, инактивации ферментных и неферментных антиоксидантных систем.
Образование активных форм 02 обусловливает воздействие токсикантов разнообразной природы (СС14, пестициды, антибиотики, ксенобиотики, соли тяжелых металлов) [Ю.А. Владимиров, 1987; Д.ФЛЛакиров, Д.А. Еникеев, 2003; В.В. Сукоян и др., 2005] и воздействия некоторых физических факторов [О.И. Цебржинский, 1993; A.M. Al-Johany е.а., 2009; AВ ходе процессов, свойственных нормально функционирующей клетке, жирные кислоты фосфолипидов — структурных компонентов биомембран взаимодействуют с активными формами Ог вне зависимости от того, чем инициировано их появление. Это приводит к появлению гидропероксидов — первичных продуктов липидпероксидации (сопряженных диеновых конъюгат - ДК) [Х.М. Марков, 2005]. Гидроперекиси непрерывно деградируют до вторичных продуктов окисления (карбонильных соединений, спиртов, эпоксидов и др.), Дальнейшее окисление вторичных продуктов липидпероксидации ведет к появлению диальдегидов - соединений которые открывает реакция с тиобарбитуровой кислоaтой - т.н. ТБК-активные продукты. За счет полярных группировок гидроперекисей фосфолипидов происходят изменения физических свойств липидного бислоя биологических мембран [В.Е. Каган, 1981]: 1. В микроокружении интегральных белков накапливаются гидроперекиси фосфолипидов, отличающиеся детергентными свойствами, уменьшается (за счет насыщения двойных связей) количество непредельных липидов, увеличивается подвижность полипептидных цепей и активность ферментов. При интенсивно идущем процессе снижается количество непредельных фосфолипидов, что уменьшает подвижность интегральных белков, активность энзимов, рецепторов и каналообразующих пептидов [Ю.А. Владимиров, 1998, 2005]. 2. Рост полярности приводит к тому, что накопившиеся окисленные фосфолипиды, взаимодействуя между собой, образуют упорядоченные группы (перекисные кластеры), и это способствует формированию каналов проницаемости для разных ионов, в частности для Са2+, что в свою очередь ведет к угнетению Са2+-АТФ-азы, т.е. к повышению концентрации Са в клетке. «Кластеризация», достигшая -35-высокой степени, сопровождается фрагментацией мембран [В.Н. Ушкалова и др., 1993]. 3. Диальдегиды со свободными аминогруппами мембранных белков образуют межмолекулярные сшивки («поперечные сшивки»), что усугубляет инактивацию белков [В.Н.Титов, Д.Н.Лисицын, 2005]. Наряду с перечисленными явлениями, ускорение липидпероксидации вызывает окисление HS-групп аминокислот, образующих активный центр мембранных белков, т.е. инактивирует их [Ю.А. Владимиров, 1987] (заметим, что последствия окисления сульфгидрильных групп могут устраняться за счет синтеза поврежденных молекул de novo [В.Е. Каган, 1981]). Как сказано выше, липидпероксидация как часть процессов свободнорадикального окисления, протекает непрерывно в условиях нормы. Физиологическое значение липидпероксидации - её участие в процессах непрерывного обновления клеточных структур, и в образовании эйкозаноидов, представляющих собой группу биологически активных соединений (простагландины, тромбоксаны и лейкотриены). Их предшественники - арахидоновая кислота и другие высшие жирные кислоты с двойными связями, чередующимися с метиленовыми группами [В.Н. Титов, Д.Н.Лисицын, 2005; J.H.Brox, А. Nordoy, 1983]. Высвобождение кислот-предшественников (преимущественно арахидоновой) из мембранных фосфолипидов обеспечивает фосфолипаза А2 [A.I.Marzoev е.а., 1983; К. Mayer е.а., 2002]. В условиях физиологической нормы, несмотря на присутствие в клетках инициаторов, субстратов и катализаторов липидпероксидации, нарастающую активацию процесса сдерживает непрерывно функционирующая антиоксидантная система, ограничивающая окисление на всех последовательных этапах. Физиологические антиоксиданты представлены энзимами, витаминами и рядом метаболитов. К антиоксидантам-энзимам относят следующие [Ю,А. Владимиров, 1998; Е.Н.Ермолаева, 2003; Н.М. Шилина и др., 2004; G.W.Burton, K.U. Ingold, 1986; Venditti P. е.а., 1998]: супероксиддисмутазу (СОД), трансформирующую супероксиданион-радикалы до менее активной формы — Н2О2, расщепляемой каталазами и пероксидазами, каталазы — гемсодержащие ферменты, катализирующие распад Н2О2 на кислород и воду, пероксидазы — энзимы, устраняющие Н2Ог и гидроперекиси липидов при участии в качестве восстановителя глутатиона (комплекс глутатион-пероксидаза защищает лизосомальные мембраны от липидпероксидации), глутатионредуктазу, которая восстанавливает глутатион, окисляющийся в ходе реакции, церулоплазмин - белок крови, обладающий супероксиддисмутазной активностью и способностью связывать аскорбат и двухвалентное железо, которые являются потенциальными источниками свободных радикалов.
Из антиоксидантов-витаминов наиболее активны токоферолы, особенно а-токоферол [G.W. Burton e.a. 1986]. Углеводородная цепь токферола позволяет ему встраиваться в билипидный слой мембраны, оставляя хромановое ядро у поверхности, что стабилизирует мембрану в целом. Антиоксидантные свойства токоферола определяются его хромановым ядром, которое выступает как ингибитор, гасящий синглетный кислород, супероксиданионрадикалы и перекисные радикалы [В.Н. Ушкалова, 1993; А.А. Капралов и др., 2003].
Изменения липидпероксидации антиоксидантного потенциала тромбоцитов, их коагулоактивности и плазменного уровня маркеров НВСК в отсутствии и при дефиците токоферола
Из 9% раствора фиколла и 50% раствора верографина составляли смеси А, Б, В и Г, перечисленные ниже: А - 15,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,14 г/мл) Б - 17,5 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,13 г/мл) В - 20,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,12 г/мл) Г - 24,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,06 г/мл) Градиент плотности составляли в центрифужной пробирке, наслаивая последовательно по 2 мл смесей А, В, Б и Г и помещая на верхний слой (на смесь Г) 2 мл гепаринизированной плазмы, разбавленной буферным раствором Михаэлиса, к которому заранее добавляли 0.14 М раствор NaCl в соотношении 1:2. Далее центрифугировали 40 мин (1 000 g при 22С). После центрифугирования снимали плазму, оставляя слой в 2 мм, который собирали отдельно. Этот слой использовали для выделения моноцитов (степень чистоты - 97-99% при соотношении 1 : 2). С помощью остроконечной пипетки отсасывали слой между столбиками Г и В - это нейтрофилы (чистота их достигала 96.3±2.7%). Удаляли слой между столбиками, приготовленными из смесей А -и Б, где содержатся эозинофилы. Отделенные фракции клеток осаждали центрифугированием, приливали к осадку 0,14 М раствор NaCl и повторно осаждали центрифугированием (операцию отмывания повторяли дважды). Фракцию лимфоциты+моноциты (соотношение 1 : 2) выделяли в градиенте фиколл/триомбраст, используя: - смесь А - 10 объемов 34% раствора триомбраста плотностью 1,075 г/мл при 22С, и 24 объема 9% раствора фиколла; - смесь В - 10 объемов 34% раствора триомбраста плотностью 1,097 г/мл при 22С и 24 объема 14,6% раствора фиколла. Градиент в центрифужной пробирке составляли из 5 мл смеси В и 5 мл смеси А, наслаивали 10 мл гепаринизированной крови, разведенной 1:2, и фракцию лимфоциты/моноциты, полученную ранее. После центрифугирования (40 мин, 400 g, 22С) собирали легкую фракцию, соотношение лимфоциты/моноциты в ней равнялось примерно 2:1 (66% моноциты и 32% - лимфоциты, степень чистоты -89%). Примесь гранулоцитов составляла 1,2% как и в других работах [F.Pandolfi е. а., 1981]. Разделяли лимфоциты и моноциты изокинетическим методом [G.D.Ross, 1979]: раствор перколла плотностью 1,060 г/мл в среде, освобожденный от Са2+ и Mg , центрифугировали 1 ч (1 000g) для формирования градиента плотности (на градиент наносили 3,0 мл суспензии моноциты+лимфоциты, содержащую примерно 15, тыс. клеток в мкл, центрифугировали 5 мин при 400 g, отсасывая затем легкую фракцию (степень чистоты моноцитов - 91%). Продолжительность экспозиции клеток с плазмой, использующейся для оценки АДФ-агрегации, составляла всегда 30 мин. Для получения сопоставимых данных в пробу плазмы, объемом в 2 мл всегда вносили клетки, взятые из одинакового объема плазмы (из 0.2 мл). Следовательно, определяя значения периода индукции, -50-содержание диеновых конъюгат или ТБК-продуктов и других показателей, характеризующих оцениваемые эффекты клеток данного вида у контрольных и подопытных групп, мы получали сопоставимые величины. Анализ результатов. Статистическую обработку результатов, имеющих числовое выражение, проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 [С.А. Гланц, 1998], используя метод вариационной статистики для малых рядов наблюдений, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (т) и среднеквадратическое отклонение (а). Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стьюдента (t) и степень вероятности (р). Сопоставляя интенсивные показатели (выраженное в процентах отклонение от контрольной величины), использовали альтернативное варьирование, рассчитывая те же статистические показатели. Взаимосвязи переменных анализировали методом ранговой корреляции Спирмена. Различия рассматривали как достоверные при значениях степени вероятности 0,05. Графический анализ данных проводили в системе Microsoft Graf (приложение MS Word 2000), корректность аппроксимационных графиков, оценивали по величине коэффициентов аппроксимации (R2). В работе использованы перечисленные ниже коммерческие препараты и реагенты: 1. Тромбин и фибриноген бычьей крови (фирмы «Технология стандарт»), 2. Тромбопластин (кадаверный лиофильно высушенный, фирма «Технология-стандарт»). 3. Кефалин (фирмы «Технология-стандарт»). 4. Набор «D-dimer test" фирмы Roche 5. АДФ(ЯеапаІ). -51 6. Тироксин (Reanal). 7. Каолин (легкая фракция фирмы «Технология-стандарт») 8. Изопропанол - ч. (дополнительная очистка простой перегонкой). 9. Хлорбензол - ч. (дополнительная очистка простой перегонкой). 10. Бутанол - х. ч. 11. Соли, основания и кислоты - х.ч.
Динамика изменений ЛПО и АОП в клетках крови при введении токоферола в дозе, превышающей потребность в 6 раз (9 мг/сут)
Возвращаясь к данным табл. 5, мы может констатировать также и то, интенсивность выявленных сдвигов, вызванных инъекцией тромбина, максимальна в случае, когда энзим вводили крысам, содержавшимся на рационе без токоферола. При введении тромбина животным, получавшим токоферол в соответствии с суточной потребностью, обсуждаемые сдвиги менее выражены, и ещё слабее они выражены у животных, которые содержались на рационе с четырёхкратным против потребности количеством токоферола в рационе.
Наличие или отсутствие связей между динамикой изучаемых показателей, представленных в табл. 5, рассматривается в разделе «Обсуждение ....»
Предварительный вывод таков: дозированная гипертромбинемия, создаваемая путем введения в кровоток разных (но не вызывающих гибели животных) количеств тромбина, сопровождается пропорциональным дозе ростом коагулоактивности тромбоцитов, ускорением НВСК и снижением ТкТР. Степень активации тромбоцитов, ускорения НВСК и снижения ТкТР зависит от обеспеченности организма подопытных токоферолом - изменения максимальны при Е-авитаминном питании, уменьшены при содержании токоферола в соответствии с суточной потребностью в нём и ограничены при избытке токоферола в питании.
В рассмотренном выше эксперименте моделирована экзогенная гипертромбинемия. Чтобы подтвердить или исключить выводы, к которым приводит предварительный анализ результатов этой серии опытов, мы в очередных сериях использовали альтернативные приемы моделирования гипертромбинемии - введение адреналина и кровопотерю. Адреналин - эффектор активации гемостаза при болевом раздражении [В.П.Балуда, 1978, 1981, 1995]. Механизм его «гипертромбинемического» эффекта таков: взаимодействуя с адренорецепторами подтипа а2, адреналин, снижая содержание цАМФ [C.R.Jones е.а., 1985] и проницаемость мембран для внеклеточных ионов кальция [L.H.Block е. а., 1985], ингибирует аденилатциклазу. Сдвиги концентрации Са2+ в цитозоле изменяют активность протеинкиназы [S.Watson е.а., 1995], а, следовательно, скорость фосфорилирования и способность к агрегации [Е.А.Алексеева, П.П.Голиков, 1989; О.В.Галенко, Е.В.Платонов, 1996; Block е. а., 1985]. Не исключено и осуществление адреналининдуцируемой агрегации за счет стимуляции обмена Na+ и К+ через изменения концентрации инозитола [P.R.Tranter е. а., 1989]. Важно, что в том и другом случае активация адреналином тромбоцитов ведет к росту гемостатического потенциала [M.P.Gawaz, I.Ott, 1996; M.P.Gawaz, 2001], обусловленному ускоренным тромбиногенезом. В выборе дозы, адреналина и пути его введения с учетом продолжительности влияния на свертываемость крови, мы исходили из наблюдений В.П.Бабич [1972], подтвержденных недавно [М.К. Умутбаева, 2003а, б, 2005; Р.Г.Алборов и др., 2005; Р.Г.Алборов, 2004 а, в, 2006]. Опыт спланирован так: 1. Контрольная группа - крысы содержались на полноценном рационе питания; 2. Подопытные группы 1-я, 2-я и 3-я — крысы соответственно получали Е-авитаминный рацион, рацион с токоферолом в дозе, равной суточной потребности и в 4-кратной дозе в сравнении с суточной потребностью дозе в течение 4-х недель. -67-По прошествии четырёх недель крысам контрольной группы инъецировали подкожно 0.14 М раствор NaCl, 1 мл/кг), крысам подопытных групп вводили тем же путем раствор адреналина солянокислого (1.0 мл/кг, содержащий 30 мкг адреналина). Пробы крови в контрольной и подопытных группах отбирали через 30 мин после инъекции. -68-Из приведенных в табл. 6 результатов эксперимента следует, что введение адреналина привело на момент отбора проб у животных всех групп к повышению уровня фф. Р3 и Р4, повышению ОКАТ, спонтанной и АДФ-зависимой агрегации, а также плазменного уровня маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ и D-димеров). Эти изменения свидетельствуют об активации тромбинообразования адреналином, вводимым в инъекциях, и согласуются с данными, согласно которым при той же дозе адреналина через 15 мин наблюдается тенденция, проявляющаяся статистически после 30 мин [Р.Г.Алборов, 2006]. Это убеждает нас в осуществлении ускоренного тромбиногенеза, так как направленность изменений, а также их зависимость от содержания токоферола в рационе совпадает с тем, что мы наблюдали при введении в кровоток тромбина. Наиболее важно то, что при содержании животных на Е-авитаминном рационе изменения оказались максимальными, а их выраженность была ниже при введении адреналина на фоне рациона, содержавшего токоферол в количестве, соответствующем потребности, и ещё ниже - при 4-кратном избытке токоферола в рационе. Тем не менее, мы провели дополнительно опыты, в которых в качестве ваоздействия, вызывающего тромбинемию, использовали кровопотерю. Основывались в данном случае на том, что, как ранее показано, при извлечении из циркуляции крови в объеме, составляющем около 25% общего её объема, растет гемостатический потенциал [С.Н.Ельдецова, 1990; С.Л.Галян, 1993; В.Г.Соловьев, 1997; Р.Г. Алборов, 2006].
Интенсивность НВСК и коагулоактивность тромбоцитов после внутривенного введения крысам клеток крови, выделенных у крыс, неполучавших токоферол и получавших его в разных количествах
При этом особенно много работ посвящено токоферолу -важнейшему природному антиоксиданту, широко использующемуся в медицинской практике, как в индивидуальном виде, так и в составе комплексных медицинских препаратов.
Привлекло наше внимание главным образом то, что последствия для гемостаза дефицита или дополнительного введения токоферола, впрочем, как и других витаминов, обычно оценивали, определяя активность отдельных факторов плазмокоагуляции, и это не позволило установить, вызывает ли токоферол в конечном счете наклонность к активации гемостаза или, напротив, угнетает свертываемость крови [А.Ш.Бышевский, 1978, 1991; В.П.Мищенко, 2005; В.С.Шидин, 2007; V. De Sanctis е.а., 2008; A.Mente е.а., 2009].
Кроме того, оказалось, что в экспериментальных работах лишь в единичных случаях использовали сбалансированные по содержанию нутриентов рационы питания, а в клинике крайне редко оценивали степень обеспеченности организма пациентов витаминами, в том числе и включавшимися в терапевтический комплекс.
Все это и определило характер нашего экспериментального исследования, цель которого - изучить влияние дефицита и избытка токоферола на липидпероксидацию в тромбоцитах и других клетках крови, на коагулоактивность тромбоцитов, на интенсивность НВСК и на толерантность к тромбину, т.е. на ту совокупность показателей, которая позволяет судить об интегральном состоянии гемостаза. Важным условием наших опытов мы считали использование в питании животных рациона, сбалансированного по нутриентам, и, что особенно важно, по содержанию в них витаминов, а также то, что исследуемый витамин вводили в количествах, сопоставленных с суточной потребностью в нём. Изучая динамику изменений липидпероксидации в тромбоцитах, их коагулоактивность и плазменный уровень маркеров НВСК у крыс, содержащихся на Е-авитаминном рационе и рационе, включающем токоферол в количестве, равном 100, 25, 50 и 75% от суточной потребности, мы выявили определенные зависимости, которые подвергли графическому анализу, а также оценили взаимосвязи переменных величин методом ранговой корреляции Спирмена. Обратим внимание на особенность представления данных в аналитических целях: чтобы избежать перегрузки графических изображений, мы использовали те из тестов, которые, изменяясь с наибольшим постоянством, могут служить для оценки динамики контролируемого процесса. Для оценки липидпероксидации — это уровень одного из липидпероксидов, а именно диеновых конъюгат (ДК), для оценки антиоксидантного потенциала - период индукции (ПИ), для оценки коагулоактивности тромбоцитов - показатель ОКАТ и для оценки НВСК - уровень ПДФ. Соотносились названные величины в отсутствии токоферола и при его дефиците в рационе следующим образом. На рис. 1 видно, что уровень ДК увеличивается по мере удлинения времени содержания крыс на Е-авитаминном рацион, а динамика нарастания уровня ДК близка к линейной (коэффициент аппроксимации тренда - R равен 0,93, то есть близок к единице). Период индукции (ПИ) укорачивается примерно с той же динамикой и тренд его также близок к линейному, хотя и в меньшей мере (R2 = 0,78). Следовательно, зависимость между ускорением липидпероксидации и снижением антиоксидантного потенциала является тесной отрицательной - значения коэффициента ранговой -78-корреляции Спирмена rs= -0.89). Растет по мере получения рациона без витамина Е и коагулоактивность тромбоцитов, оцениваемая здесь по величине ОКАТ. Темп её роста также близок к линейному (коэффициент аппроксимации R = 0,89). Коэффициент ранговой корреляции rs для пары ДК и ОКАТ равен 0.86, следовательно, между изменениями этих величин существует положительная связь, хотя и несколько менее тесная, чем отрицательная связь пары липидпероксидация и антиоксидантный потенциал (ЛПО и АОП соответственно). Это подтверждается наличием отрицательной связи в паре ПИ и ОКАТ (rs= -0,84). Толерантность к тромбину (ТкТР) при отсутствии витамина Е в рационе заметно снижается, и, как показали расчеты, является величиной, находящейся в отрицательной связи с показателями липидпероксидации (связь эту нельзя назвать тесной - rs = - 0,67). Как и ожидалось, интенсивность НВСК, оцениваемая по характеру и степени изменений уровня ПДФ, ассоциирована положительно и достаточно тесно с липидпероксидацией (rs= 0,87) и ОКАТ (rs= 0,74) и отрицательно ассоциирована со сдвигами антиоксидантного потенциала (rs= - 0,69). При кормлении крыс рационом, содержащим токоферол в количестве, составляющем 25% от суточной потребности, изменений через 2 недели вообще не находили (впрочем, и при Е-авитаминном рационе изменения на этом этапе были минимальны). Не находили изменений, однако, и через 4 недели (исключение составило небольшое снижение ТкТР).
![Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4500/209024.png "Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Матейкович Елена Александровна")