Введение к работе
Актуальность темы.
В биохимических исследованиях белков традиционно в особые группы объединяют различные макромолекулы, выполняющие сложные регуляторные функции, связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием [Culig et al., 1996; Zinkel et al., 2006]. Изучение свойств и особенностей функционирования таких белков-регуляторов, а также кодирующих их генов, часть из которых относят к онкогенам, значительно усилилось в постгеномную эру в связи необходимостью выяснения молекулярных основ возникновения различных злокачественных опухолей, в частности, рака предстательной железы (РПЖ) [Yu, Rohan, 2000; Peltonen, McKusick, 2001; Turner, Grose, 2010].
РПЖ является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Согласно статистике, в 2009 г. в США РПЖ занимал лидирующее значение по количеству выявленных случаев заболевания и второе место по количеству летальных случаев [Jemal et al., 2009]. В России РПЖ находится на 4-м месте в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Чиссов и др., 2008]. Более того, за период с 1998 по 2008 гг. отмечается значительный рост заболеваемости РПЖ, составляющий в странах Запада в среднем 3% за год [Boyle et al., 1996], а по оценкам, сделанным в нашей стране - более 7% в год [Чиссов и др., 2008]. Широкая распространенность РПЖ, вариабельность клинических симптомов и высокий процент летальности больных во многом определяют пристальное внимание к этому заболеванию не только онкологов, но и биохимиков, молекулярных биологов, а также специалистов других биологических дисциплин.
Хотя к настоящему времени получен ряд данных, указывающих на участие в развитии РПЖ различных ростовых факторов и регуляторных белков [Russell et al., 1998; Reynolds, Kyprianou, 2006], однако остается много нерешенных вопросов, связанных с определением их непосредственного вклада в онкогенез. Среди них наиболее активно исследуемыми являются белки, входящие в так называемую ось «гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1» (axis GH/IGF-1) [Cohen et al., 2000]. В числе особенно актуальных и интенсивно изучаемых вопросов - перспективы использования белковых факторов, вовлеченных в патогенез РПЖ, для диагностики и определения риска возникновения заболевания. О важности поисков новых биомаркеров и разработок на этой основе молекулярных ди-агностикумов РПЖ говорят накапливающиеся сведения о недостатках традиционно используемого в клинике теста на простат-специфический антиген (ПСА) [Stamey etal., 2004].
Проблему осложняет то, что для многих белковых ростовых факторов и других регуляторных белков характерен выраженный биохимический полиморфизм,
проявляющийся их качественными и/или количественными изменениями. Эти изменения, в свою очередь, играют важные роли в процессах пролиферации клеток, приобретении ими способности к инвазии и метастазированию, что приводит, в конечном счете, к формированию злокачественного фенотипа клеток [Djavan et al, 2001; Weber, 2007; Bidosee et al., 2009].
Известно, что биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен как генетическими, так и эпигенетическими причинами [Beaudet et al., 1989; Zhang et al., 2009]. К генетическим причинам относят множественность генов, или полилокусность, а также полиаллелизм и альтернативный сплайсинг. Среди эпигенетических причин наиболее распространены постсинтетические модификации белков [Вудс, 1983; Шишкин и др., 2007].
С началом постгеномного периода особое внимание исследователей привлекает полиморфизм белков, обусловленный однонуклеотидными заменами в соответствующих генах (так называемые single nucleotide polymorphisms, SNP's) [Zhang et al., 2009]. В частности, ведутся многочисленные работы, направленные на выяснение ассоциации отдельных полиморфных вариантов с риском различных онкологических заболеваний [Gsur et al., 2001; Chen et al., 2006; Pilato et al., 2010]. По мнению ряда авторов, результаты таких исследований представляют интерес для развития представлений о молекулярных предпосылках возникновения раковых опухолей и могут найти применение для формирования групп высокого риска этих заболеваний, в частности, РПЖ [Mononen, Schleutker, 2009].
Таким образом, ведущиеся в настоящее время исследования по поиску и изучению свойств регуляторных белков человека позволяют надеяться на получение важных результатов, которые расширят представления о молекулярных механизмах РПЖ и будут способствовать разработкам новых подходов к пресимптомати-ческой диагностике, профилактике и лечению этого заболевания.
Цель и задачи исследования.
Основной целью данной диссертационной работы стало изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке предстательной железы с помощью постгеномных технологий.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Разработать биотест-систему, использующую в качестве тестируемого объекта культивируемые эпителиальные и мышечные клетки, которая позволяла бы определять биологические эффекты различных регуляторных белков, присутствующих в сыворотке крови.
Провести иммуноферментное определение сывороточной концентрации отдельных регуляторных белков у пациентов с раком предстательной железы и
в группе контроля и оценить проявления количественного полиморфизма этих белков.
Провести посредством двумерного электрофореза сравнительный протеом-ный анализ белков в клеточных линиях, моделирующих рак и доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ), для обнаружения качественного и количественного полиморфизма белков как потенциальных маркеров рака предстательной железы.
Изучить встречаемость отдельных регуляторных белков в образцах тканей простаты у больных раком и гиперплазией.
Исследовать возможность ассоциации различных полиморфных вариантов в некоторых генах, относящихся к системе гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1, а также в генах отдельных актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.
Научная новизна.
Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта культивируемые клетки рака простаты (LNCaP), и с помощью этой биотест-системы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.
В тканях простаты человека впервые обнаружены две электрофоретические изоформы белка Dj-І, различающиеся по pi и, возможно, представляющие собой результат посттрансляционных модификаций. При иммуноферментном анализе сывороточного уровня Dj-І у больных раком и гиперплазией предстательной железы получены новые данные, свидетельствующие о достоверном повышении уровня данного белка в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с группой ДГПЖ.
Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты. Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты. Кроме того, при анализе полиморфного сайта 2911G/A (Glu917Arg) гена IRS1 обнаружено достоверно значимое накопление аллеля А у больных раком по сравнению с контрольной группой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов FMN1 и IRS1 в формировании предрасположенности к раку предстательной железы.
Научно-практическая значимость.
Оптимизированная клеточная биотест-система может быть использована для изучения биологических эффектов ростовых факторов на культивируемые клетки рака предстательной железы и для исследований молекулярных нарушений клеточной пролиферации при данном заболевании.
При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в многоуровневую информационную базу данных «Протеомика рака простаты-2009», созданную в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН совместно с ООО «Инновационные биотехнологии» ( .га).
При сравнительном исследовании идентифицированного белка Dj-І в четырех клеточных линиях показано его более низкое содержание в клетках, моделирующих доброкачественную гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак простаты (РС-3, DU-145 и LNCaP).
Результаты проведенных протеомных и иммуноферментных исследований на образцах тканей простаты и сыворотках крови больных раком и гиперплазии простаты позволяют считать белок Dj-І перспективным маркером рака предстательной железы и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью валидации для последующего использования в диагностике заболевания.
Полученные данные о полиморфизме двух из десяти исследованных ДНК-локусов могут найти применение при урологических обследованиях мужчин для формирования групп высокого риска рака простаты.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве
биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (LNCaP), и с помощью
этой биотест-системы у обследованных пациентов с раком предстательной желе
зы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком
простаты на клетки.
При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты».
Изучение белка Dj-І в четырех клеточных линиях показало его более низкое содержание в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, DU-145 и LNCaP).
Протеомные и иммуноферментные исследования образцов тканей проста-
ты и сыворотки крови у больных раком и гиперплазией позволяют считать белок Dj-І перспективным биомаркером рака простаты.
5. Сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонук-леотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты показал достоверно значимое различие рапреде-ления частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 и 2911G/A (Glu917Arg) в гене IRS1 (rsl801278) у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой.
Апробация работы.
Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), VII Съезде онкологов России (Москва, 2009), 25-ом Ежегодном съезде Европейской ассоциации урологов (25th Anniversary EAU Congress, Barcelona, 2010).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ (из них 2 в зарубежной печати), включая 4 статьи в профильных рецензируемых российских и международных журналах, 1 статью в сборнике, 2 информационно-методических письма и 8 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (386 наименований). Работа содержит 17 таблиц и 27 рисунков.
