Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1. Геномная нестабильность как эффект облучения 11
1.2. Полиморфизм - понятие, причины, значение 14
1.2.1. Маркеры полиморфизма ДНК 16
1.2.1.1. Мини- и микросателлиты 17
1.2.1.2. RAPD и AFLP-маркеры 20
1.2.2. Некоторые методы изучения маркеров полиморфизма ДНК 23
1.2.2.1. Рестрикционные ферменты 23
1.2.2.2. Полимеразная цепная реакция 24
1.2.4. Увеличение степени вариабельности ДНК как генетический эффект
облучения 25
1.3. Половые клетки - мишень для действия ионизирующего излучения 26
1.3.1. Некоторые методы изучения генетических эффектов радиации в половых клетках 27
1.3.1.1 Доминантные летальные мутации 27
1.3.1.2. Реципрокные транслокации 28
1.3.1.3 Аномальные головки спермиев, . 28
1.3.2. Стадии сперматогенеза 29
1.3.3. Различие стадий сперматогенеза по чувствительности к радиационному воздействию 30
1.3.4. Летальное действие радиации 31
1.3.5. Различия чувствительности половых клеток к генетическому действию ИИ 31
II. Материалы и методы... 35
П. 1. Однократное облучение животных 35
П.2. Хроническое облучение животных 36
11.3. Реактивы и оборудование 37
11.4. Выделение ДНК 38
11.5. Постановка полимеразной цепной реакции 39
11.6. Электрофоретический анализ в агарозном геле 40
11.7. Документирование результатов электрофореза 40
П.8. Анализ паттернов амплифицированной со случайными праймерами ДНК (RAPD-профилей) 41
П.9. Выделение и обработка пероксидом водорода лимфоцитов селезенки 41
11.10. Метод электрофореза единичных клеток 41
11.11. Статистическая обработка результатов 44
III. Результаты и обсуждение 46
III. 1. Плодовитость, соотношение полов в потомстве однократно- и хронически облученных мышей 46
Ш.2. Вариабельность продуктов амплификации со случайными праймерами у потомков облученных мышей 48
Ш.2.1. Спонтанная вариабельность продуктов RAPD потомства контрольных групп мышей двух различных линий 51
Ш.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозах 1-3 Гр .52
Ш.2.2.1. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c , однократно облученных в дозе 1 Гр 56
Ш.2.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозе 2 Гр 57
Ш.2.2.3. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозе 3 Гр 58
Ш.2.3. Зависимость эффекта от дозы для различных стадий сперматогенеза при облучении в диапазоне доз 1 -3 Гр 59
Ш.2.3.1. Средний уровень полиморфизма при облучении 1 -3 Гр 63
Ш.2.3.2. Статистический анализ результатов изучения вариабельности RAPD-маркеров по частотам появления новых полос 63
Ш.2.4. Частота исчезновения родительских полос в паттернах потомков 65
Ш.З. Выход мутаций в расчете на 0,01 Гр при остром облучении на стадиях сперматид и сперматогониев 67
Ш.4. Влияние низкоинтенсивного хронического облучения на уровень полиморфизма ДНК потомков мышей линии СВАЛас 67
Ш.5. Определение частоты реципрокных транслокаций в сперматоцитах мышей 71
Ш.6. Чувствительность спленоцитов мышей линий BALB/c и СВАЛас к пероксиду водорода после облучения в различных дозах 73
III.6Л Изменение количества спленоцитов мышей линии BALB/c в отдаленные сроки после облучения в дозах 1- 6 Гр 74
III.6.2. Зависимость среднего индекса комет спленоцитов мышей линии BALB/c от концентрации пероксида водорода 75
Ш.6.3. Чувствительность спленоцитов мышей линии BALB/c к пероксиду водорода после облучения в дозах 1-6 Гр 76
IIL6.4. Динамика изменения чувствительности спленоцитов мышей линии СВАЛас к пероксиду водорода при хроническом облучении 78
Ш.7. Обсуждение 79
IV. Выводы. 89
V. Список литературы
- Геномная нестабильность как эффект облучения
- Половые клетки - мишень для действия ионизирующего излучения
- Анализ паттернов амплифицированной со случайными праймерами ДНК (RAPD-профилей)
- Плодовитость, соотношение полов в потомстве однократно- и хронически облученных мышей
Введение к работе
Актуальность темы.
Развитие методов биохимии, молекулярной биологии и генетической
инженерии позволяет подходить к оценке таких явлений как
пострадиационный мутационный процесс и радиационно-индуцированная нестабильность генома с точки зрения оценки изменения молекулярно-генетических показателей. В последние годы постоянно увеличивается количество работ, посвященных оценке изменения вариабельности маркеров полиморфизма ДНК у потомства облученных родителей. Маркеры полиморфизма ДНК, такие как микро- (МКС) и минисателлитные локусы (МНС), ДНК Y-хромосомы, митохондриальная ДНК имеют ряд характеристик, которые делают их более удобными для изучения радиационно-генетических эффектов [Алтухов, Салменкова, Курбатова и др., 2004]. Наибольший интерес исследователей в области изучения генетических эффектов радиации привлекают мини- и микросателлитные локусы. Помимо радиационного фактора, была показана индукция мутационного процесса в МКС и МНС при воздействии химических мутагенов, а так же вследствие оксидативного стресса, вызываемого действием перекиси водорода [Yauk, Quinn, 1996; Jackson, Loeb, 2000]. Появление относительно простых и быстрых методов работы с ДНК позволило выявить в начале 90-х годов взаимосвязь повышенной вариабельности микросателлитных локусов и онкологических заболеваний. Следствием изучения корреляции онкологических заболеваний и индуцированной изменчивости микросателлитных локусов стало введение в научную практику нового термина - микросателлитная нестабильность [Peltomaki, Lothe et al., 1993; Loeb, 1994; Безлепкин, Газиев, 2001].
Использование МКС и МНС для изучения генетических последствий облучения дает целый ряд преимуществ перед традиционными методами. К
7 примеру, за счет повышенной частоты спонтанных мутаций, для исследований не требуется значительного числа животных в экспериментальных группах. Большая часть исследований в этой области посвящена изучению генетических последствий малых доз облучения, то есть до 0,2 Гр [UNSCEAR, 1999]. Целый ряд работ Dubrova и соавторов показывает передающееся по наследству увеличение вариабельности минисателлитных локусов в результате воздействия ионизирующих излучений в различных дозах, как на модельные объекты, так и на человека [Dubrova et al., 1996, 1998, 2000, 2002].
Диапазон доз от 0,5 до 1 Гр и выше охвачен молекулярно-генетическими исследованиями в значительно меньшей степени. Вопрос о закономерностях радиационной индукции полиморфизма ДНК при воздействиях средних и больших доз ИИ и связи такой индукции с нестабильностью генома остается открытым. Boyd и соавторы, изучая зависимость «доза-эффект» для частоты мутаций в мини- и микросателлитных локусах в клетках линии UVW, показали, что при воздействии у - радиации в дозах 1 - 3 Гр наблюдается достоверное увеличение частоты мутаций с увеличением дозы облучения [Boyd, Livingstone, Wilson et al., 2000].
Помимо анализа вариабельности сателлитных локусов, довольно широкое распространение получил метод оценки генетической вариабельности с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров (random amplified polymorphic DNA, RAPD, или arbitrary primed DNA, AP-PCR). Данный метод дает возможность быстрого сканирования генома за счет получения фингерпринтов («отпечатков пальцев») ДНК и может быть использован для оценки изменений, произошедших в нем под воздействием каких-либо факторов. Набор фрагментов ДНК, получаемых при амплификации со случайными праймерами, обладает генотип-специфичностью и может служить критерием при изучении генетических различий между близкородственными видами, линиями, сортами, породами и штаммами.
Анализ RAPD или AP-PCR является модификацией полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой вместо пары праймеров (прямой и
8 обратный), фланкирующих определенную последовательность, используется серия одиночных случайных праймеров, не имеющих специфичности к данному геному. Также, иногда, используется смесь из 2 - 4 таких праймеров, такая модификация носит название semi-RAPD [Матвеева и др., 2005].
Анализ вариабельности полиморфной ДНК применяется в радиационно-генетических исследованиях, как на модельных объектах, так и для мониторинга популяций человека. Безлепкин с соавторами [Безлепкин и др., 2000] показали увеличение генетической вариабельности у потомков мышей линии BALB/c, хронически облученных гамма-излучением в дозах 0,1 - 0,5 Гр с помощью AP-PCR. Примером использования данной технологии в радиционно-генетическом мониторинге может служить работа Weinberg с соавторами, которые показали увеличение частоты мутаций с помощью RAPD у детей ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [Weinberg et al., 2001]. Существует множество других примеров удачного использования полиморфной ДНК для оценки генетической вариабельности, возникающей у потомков облученных родителей. Но значительная часть таких исследований посвящена эффектам малых доз, тогда как информации о генетической вариабельности, возникающей при воздействии доз ИИ от 0,5 Гр и выше, явно недостаточно. Изучение молекулярно-генетических эффектов средних и больших доз радиации дало бы более полное представление о механизмах воздействия ионизирующего излучения на геном.
Цель и задачи исследования.
Цель данной работы заключалась в изучении молекулярно-генетических эффектов радиационного воздействия у мышей линий BALB/c и CBA/lac и их потомков в условиях однократного и хронического облучения в различных дозах.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить индукцию генетической вариабельности на пре - и постмейотической стадиях сперматогенеза при облучении в дозах от 1 до 3 Гр с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной со случайными праймерами.
Дать сравнительную оценку чувствительности стадий сперматогенеза на основании анализа уровней вариабельности продуктов RAPD потомков мышей, облученных в диапазоне доз 1-3 Гр.
Изучить с помощью метода ДНК -комет изменение устойчивости клеток селезенки мышей линий BALB/c и СВАЛас к воздействию однократного облучения в диапазоне доз 1-6 Гр и пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр.
Изучить молекулярно-генетические эффекты хронического низкоинтенсивного D-излучения у мышей и их потомков с помощью методов RAPD и электрофореза индивидуальных клеток (комет- тест).
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ радиационно-генетической чувствительности пре - и постмейотических стадий сперматогенеза в области доз от 1 до 3 Гр с помощью анализа полиморфизма ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров. Для анализа полиморфизма ДНК была использована серия случайных праймеров, в которую входили как одиночные, так и смеси праймеров. Получены достоверные различия между опытной и контрольной группами для всех использованных доз облучения. Исследованы генетические эффекты пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр, лишь в несколько раз превышающей годовую дозу от естественного радиационного фона (0,086 - 0,173 Гр/год).
10 Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных на человека с целью оценки рисков как острого, так и хронического облучения. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать использование метода амплификации ДНК со случайными праймерами при проведения радиоционно-генетического мониторинга. При этом, воспроизводимость метода увеличивается при использовании модификации, описанной в настоящей работе, а так же при использовании серии праймеров.
Геномная нестабильность как эффект облучения
Эффекты радиационного воздействия на биологические системы могут проявляться непосредственно после облучения или же в отдаленные сроки.
Среди исследованных отдаленных эффектов ионизирующей радиации одним из наиболее интересных и важных является индуцируемая геномная нестабильность. Термин "радиационно-индуцированная нестабильность генома" обычно используется для описания генетических повреждений в потомстве клеток через несколько клеточных циклов после облучения [Morgan et al., 1998].. Высокий процент клеток с дефектами и пролонгированный период их появления свидетельствует, что нестабильность не является ответом на прямое повреждение ДНК или на мутации в специфических генах. Более вероятное объяснение - эпигенетические изменения в генной экспрессии регуляторных факторов и цепные реакции хромосомных перестроек [Harms-Ringdahl, 1998; Murnane, 1996].
Причины индукции нестабильности генома могут быть различными: комплексы двухцепочечных разрывов в ДНК, активация мобильных генетических элементов и снижение эффективности функционирования процессов репарации. Множественные фенотипы нестабильности могут включать различные кариотипические отклонения, такие как дестабилизация хромосом, обмены сестринских хроматид и анеуплоидию, мутации и амплификацию генов, клональную гетерогенность, отсроченную репродуктивную и апоптическую гибель клетки, либо неопластическую трансформацию [Morgan et al., 1998; Limoli 1997].
Известно, что любые агенты, способные продуцировать комплексы двухцепочечных разрывов в ДНК, будут индуцировать геномную нестабильность [Limoli, 1997]. Однако разрывы не вызывают нестабильность генома непосредственно. Они являются лишь первичными молекулярными повреждениями, ведущими к индукции хромосомных перестроек и генной экспрессии [Morgan et al., 1998]. Гены, экспрессия которых изменяется, могут продуцировать факторы, напрямую влияющие на темп перестроек хромосом (ферменты репарации и рекомбинации ДНК), а также контролирующие апоптоз, клеточный цикл, стабильность повторяющихся последовательностей ДНК.
Изменчивость генома является основой эволюции, разнообразия видов и внутривидового полиморфизма. Она лежит в основе возникновения множества наследственных заболеваний и таких соматических болезней, как рак. Заметными вехами на пути исследований нестабильности генома были анализ транспозиций подвижных элементов и открытие мобильных элементов в геноме дрозофилы [Гвоздев, Георгиев, 1978] и формулировка принципа увеличения скорости мутаций в раковых клетках по сравнению с нормальными [Shapiro, 1980].
Как и любое биологическое явление, нестабильность генома, а вернее, механизмы, лежащие в ее основе, могут иметь важное позитивное значение в жизни клетки. Например, соматический гипермутагенез при созревании антител. Данный процесс заключается в том, что при клонировании гены мутируют с огромной частотой (частота мутаций в 100 миллионов раз больше, чем при точковых мутациях), и возникает огромное количество вариантов антител, чуть отличных друг от друга. Какой-то из них оказывается «подогнанным» к антигену наилучшим образом. Этот окончательный вариант снова клонируется и запоминается клетками иммунной памяти, т.е. наследуется на время жизни особи и возникает приобретенный иммунитет [Жимулев, 2003].
Изучение индуцированной нестабильности применительно к целостному организму, эффектам в потомстве у человека, к примеру, затруднено по ряду причин, хотя такие попытки и предпринимались [Воробцова, 2002]. В экспериментах на лабораторных животных было показано снижение-устойчивости генетического аппарата клеток потомства облученных родителей к мутагенным факторам.
С помощью дополнительного тестирующего облучения выявлена повышенная радиочувствительность хромосом генома соматических клеток (гепатоцитов, кариоцитов, эмбриональных фибробластов) потомства самцов мышей и крыс, облученных в дозах 4,2 - 6,0 Гр по сравнению с хромосомами потомства интактных родителей. Повышенная чувствительность к радиационному фактору выявлена и в соматических клетках потомства дрозофил - самцов, облученных в дозах 10-30 Гр [Воробцова, 1988]. В последнее время появились данные, свидетельствующие о повышенном уровне хромосомных аберраций как спонтанных, так и после дополнительного тестирующего облучения у потомков первого и второго поколений животных, подвергшихся радиационному воздействию. Показана наибольшая чувствительность к действию радиации у внуков облученных самцов крыс, хотя и у потомков первого поколения уровни аберраций хромосом в клетках костного мозга после тестирующего облучения были достоверно повышены [Гришанкина, Шаповалова, 2000].
Результаты этих исследований свидетельствуют об унаследованной через гаметы облученных родителей нестабильности генома соматических клеток потомства, что выявляется с помощью дополнительной радиационной нагрузки.
Половые клетки - мишень для действия ионизирующего излучения
Термином «доминантые летальные мутации» (ДЛМ) обозначают изменения в генетическом аппарате половых клеток, приводящие к.гибели потомков первого поколения, в основном на ранних стадиях эмбриогенеза [Ли, 1962; Малашенко и др., 1977]. В основном, возникновение ДЛМ обусловлено хромосомными аберрациями, как структурными, так и количественными.
Для определения частоты ДЛМ используют скрещивание облученных самцов с самками, которых подсаживают с периодом в неделю. Подсаженные в первую неделю самки оплодотворяются сперматозоидами, которые во время облучения были уже зрелыми спермиями; вторая и третья неделя - поздними и ранними сперматидами, четвертой и пятой - поздними и ранними сперматоцитами, шестой недели - сперматогониями. На 18-ый день после подсадки к самцам, самок забивают и подсчитывают у них количество желтых тел в яичнике, число мест имплантаций в яичнике и количество живых эмбрионов. Частоту ДЛМ вычисляют по общей смертности эмбрионов, величине доимплантационных потерь и постимплантационной смертности.
Величину индуцированной летальности определяют по формуле:
Под реципрокными транслокациями (РТ) понимают взаимные обмены участками негомологичных хромосом. Анализ частоты РТ производят в два этапа - генетический и цитологический этапы. Генетический анализ заключается в выявлении гетерозигот по РТ среди потомков первого поколения. При скрещивании нормальных самок с гетерозиготными по РТ самцами, около половины зигот имеют несбалансированный геном, и погибает в самом начале эмбриогенеза. Для выявления гетерозиготных самцов, оплодотворенных ими самок забивают через 14-18 дней после подсадки и определяют общую гибель эмбрионов. В случае выявления самцов, гетерозиготных по РТ, к ним повторно сажают самок. Далее, наличие РТ подтверждают цитологически. Большие возможности для изучения закономерностей индуцированного мутационного процесса в сперматогониях дала разработка методики определения частоты РТ в сперматоцитах на стадии диакинеза - метафазы первого мейотического деления [Evans et al., 1964]. Как известно, РТ не отсеиваются в ходе созревания, доходят до стадии спермиев и могут являться причиной ряда наследственных болезней. Эта методика получила широкое применение в области изучения индукции мутагенеза в мужских половых клетках мышей и человека [Lyon et al., 1972; Brewen et al., 1975].
Для скрининга мутагенеза у млекопитающих, индуцированного действием различных мутагенных факторов, широко используется методика определения частоты аномальных головок спермиев (АГС) [Bruce et al., 1974; Померанцева и др. 1980]. Метод удобен тем, что не требует большого количества животных и является относительно простым. Возникновение АГС, по-видимому, связано с точковыми мутациями и микроделециями. Некоторые исследователи связывают возникновение АГС с соматическими нарушениями в организме [Soares et. al., 1979]. Было показано, что частота АГС повышается через 4-5 неделю после воздействия и их повышенный уровень сохраняется до 8 - 10 недель. В случае облучения ИИ, максимальное повышение уровня АТС наблюдается через 4-5 недель после воздействия, т.е. в период, когда стадии спермиев достигают клетки, облученные на стадиях ранних сперматоцитов и сперматогониев [Bruce et al., 1974]. У мышей сроки появления АГС, степень повышения и длительность сохранения их повышенного уровня варьируют в зависимости от действующих факторов, их дозы, а так же от линии и возраста мышей [Шевченко, Померанцева, 1985].
Гаметогенезом называется процесс созревания . половых клеток, проходящий в половых железах. Сперматогенез - процесс образования мужских половых клеток. Он проходит в несколько стадий: Первая стадия-размножение- диплоидные клетки зачаткового эпителия делятся митозом. У самцов эта стадия представлена сперматогониями. Сперматогонии различают двух типов - А и В. Клетки типа А представляют собой сперматогонии недавно образовавшиеся и еще не вступавшие в митотическое деление. К сперматогониям типа В относят клетки, вступившие в фазу размножения посредством митоза.
Анализ паттернов амплифицированной со случайными праймерами ДНК (RAPD-профилей)
После цервикальной дислокации мышей-самцов, у них извлекали селезенку для дальнейшего выделения лимфоцитов. Органы гомогенизировали в охлажденном (+4С) фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и фильтровали через нейлоновую сетку. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева.
С целью изучения антиоксидантного статуса, клетки подвергали обработке раствором перекиси водорода в концентрации 50 и 500 мкМ. Для этого, слайды с иммобилизированными в агарозу спленоцитами помещали в емкости с охлажденным ФСБ, содержащим 0, 50 и 500 мкМ пероксида водорода. Инкубировали 10 мин при 0С.
Метод электрофореза индивидуальных клеток или ДНК-комет был разработан в 80-х годах прошлого века [Olive et al., 1984] и в настоящее время является одним из самых распространенных методов изучения последствий облучения. Существует множество модификаций метода, влияющих на чувствительность и воспроизводимость.
Электрофорез в щелочной модификации проводили, как описано Singh et al [1988]. Согласно этому методу количество ОР и щелочнолабильных сайтов ДНК прямо пропорционально количеству и расстоянию миграции ДНК из ядерной области после проведения щелочного электрофореза иммобилизованных в агарозу единичных клеток. Метод схематично представлен на рис. 1.
Для окраски использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33258. Анализ ДНК-комет проводили при помощи люминесцентного микроскопа «Axiophot» (Carl Zeiss, Германия).
Подсчитывали 100 «комет» на каждый слайд. В зависимости от формы (длина «хвоста» и диаметр ядра), «кометы» относили к одному из пяти классов: от 0 до 4 (от 0 при отсутствии «хвоста кометы», до 4, когда практически вся ДНК мигрировала из ядра). Данный метод визуальной оценки был предложен Collins et al. [1995] и считается приемлемым для исследования повреждений ДНК. Результаты, полученные этим методом, были подтверждены с помощью компьютерной аналитической системы Kinetic Imaging, Liverpool, UK.
Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами. Результаты анализа вариабельности RAPD-профилей обрабатывали с использованием параметрических критериев Стьюдента (t), точного критерия Фишера и непараметрического критерия Манна-Уитни, регрессионного анализа.
В связи с особенностями подсчета среднего индекса комет, результаты измерения данного параметра обрабатывали с помощью критерия хи-квадрат (метод таблиц сопряжения) [Урбах В.Ю., 1964; Медик В.А., 2000].
Для каждого исследуемого параметра при каждой дозе облучения определялись среднее значение параметра и ошибка среднего. Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием программных пакетов Microsoft Excel 2000 и Statistica v. 6.0.
В табл. 1 представлены данные по плодовитости облученных и контрольных мышей. У облученных мышей замечено снижение среднего количества потомков в сравнении с контрольной группой примерно в 2 раза. При хроническом облучении, плодовитость опытной группы существенно не изменилась.
Как известно, соотношение количества самцов (А) и количества самок (В) в потомстве должно быть равно единице. Однако, согласно литературным данным, в норме соотношение А/В нередко колеблется в пределах 0,98 - 1,01 [Жимулев, 2003]. Долгое время изучалось влияние ионизирующих излучений на соотношение полов в потомстве облученных родителей. В наших экспериментах, в большинстве случаев, после облучения на стадии сперматогониев соотношение полов в потомстве («сперматогониевая группа») было примерно в норме. В потомстве «сперматидных групп», т.е. потомков, полученных при скрещивании самцов в течение второй недели после облучения, соотношение полов в большей степени отклоняется от нормы. В «сперматогониевой группе» при дозе 3 Гр было зарегистрировано аномально большое количество самцов в потомстве (табл. 1). Падение плодовитости в первые 2-3 недели после облучения может быть объяснено гибелью клеток со значительным уровнем повреждений.
Плодовитость, соотношение полов в потомстве однократно- и хронически облученных мышей
В табл. 12 представлены результаты подсчета выхода мутаций для каждой использованной дозы облучения по всем использованным праймерам, а также средний выход по всем праймерам. Снижение выхода мутаций на обоих стадиях сперматогенеза с увеличением дозы может быть объяснено элиминацией клеток при дозах более 1 Гр.
Всего была проанализирована ДНК 48 потомков опытной и 47 -контрольной группы (табл.1). Было обнаружено увеличение процента и средней частоты новых полос лишь для трех из пяти использованных праймеров - 759, Ml и М2 (рис. 16 и табл. 13), отличие от контроля составило соответственно, 33,29%, 55,05% и 23,66%. Отметим, что и при анализе результатов RAPD у потомков однократно облученных мышей, частоты возникновения новых полос при использовании данных праймеров достоверно отличались от контроля. Статистический анализ с использованием двухстороннего t-теста, выявил достоверное отличие (Р 0,05) опытных данных от контроля только при использовании смеси праймеров Ml. Частота нуль-мутаций (табл.11) в контрольной и опытной группах различались незначительно. Таким образом, можно сделать вывод, что воздействие хронического низкоинтенсивного у-облучения на генетический аппарат мышей-самцов линии CBA/lac приводит к изменениям в паттернах потомства облученных мышей, но статистическая значимость данных изменений незначительна, как показали результаты статистической обработки с применением t-критерия Стьюдента.
Как видно из данных таблицы 14, частота РТ у самцов линии СВА была низкой и не различалась при остром и длительном воздействиях. Этот факт подтверждает полученные ранее данные об отсутствии эффекта мощности дозы при низких уровнях воздействия. Частота РТ у самцов линии BALB, облученных в дозе 3 Гр, соответствовала величине, полученной ранее на других линиях мышей. Было показано, что частота индуцированных в сперматогониях РТ линейно возрастает до дозы 4 Гр, дальнейшее увеличение дозы не сопровождалось выходом РТ, а при дозах свыше 10 Гр их частота снижалась [Шевченко, Померанцева, 1985].
Для наиболее полной оценки отдаленных молекулярно-генетических последствий острого и хронического облучения гамма-излучения, был поставлен ряд экспериментов с целью изучить изменение чувствительности спленоцитов к пероксиду водорода.
Пероксид водорода (НгСЬ) способен распадаться на свободные радикалы ОН, которые так же могут образовываться при радиолизе воды и обладают наибольшей активностью и вносят основной вклад в повреждение ДНК свободными радикалами. Таким образом, с помощью пероксид водорода можно тестировать антиоксидантные системы клетки, целью которых является защита генетического аппарата от свободных радикалов. Опубликован ряд работ, в которых пероксид водорода используется как дополнительный повреждающий фактор для изучения антиоксидантного и репарационного статуса [Wojewodzka et al., 2002; Piperakis, Petrakov, Tsilimigaki et al., 2003; Bowden, Buckwalter, McBride et al., 2003].
На рис. 17 представлены результаты подсчета лимфоцитов, выделенных из селезенки мышей-самцов линии BALB/c в отдаленные сроки после облучения. Наблюдается резкое снижение количества клеток после облучения в дозе 6 Гр. Подобный эффект можно объяснить значительной дозой облучения, так как данная доза является полулетальной для мышей.
Первоначально, для построения калибровочной кривой «доза-эффект», нами был проведен эксперимент по изучению чувствительности спленоцитов мышей линии BALB/c к пероксиду водорода в различных концентрациях (50 -500 мкМ). Результаты эксперимента представлены на рис. Кривая «доза - эффект», представленная на рис. 18, имеет тенденцию к выходу на «плато» начиная с концентрации пероксида водорода приблизительно 100 мкМ, что может быть объяснено увеличением гибели клеток.
Таким образом, для дальнейших исследований были выбраны концентрации 50 и 500 мкМ, как позволяющие наиболее полно изучить реакцию клеток на воздействие пероскида водорода.
На рис 19 и 20 представлена динамика изменения среднего индекса комет в зависимости от дозы облучения и концентрации пероксида водорода. Данные графика на рис свидетельствуют о сохранении зависимости «доза-эффект» через 11 месяцев после облучения дозами 1 - 6 Гр, что свидетельствует о сохранении отдаленных последствий при облучении этим диапазоном доз.
