Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 6
1.1. Характеристика рода Aegilops L. и существующие таксономические проблемы . 6
1.2. Роль полиплоидии в эволюции высших растений. Группа видов Aegilops-Triticum как типичный полиплоидный комплекс. 10
1.3. Изучение видов рода Aegilops. 17
1.4. Геном растений. 20
1.4.1. Уникальные последовательности генома растений. 21
1.4.2. Характеристика отдельных семейств генов растительного генома. 23
1.4.2.1. Семейство генов устойчивости растений. 23
1.4.2.2. Семейство генов запасных белков семян. 29
Глава 2. Материалы и методы. 42
Глава 3. Результаты и обсуждение. 63
3.1. Молекулярный анализ изменчивости и филогенетических связей видов Aegilops, имеющих D геном . 65
3.1.1. Анализ полиморфизма и филогенетических связей видов Aegilops с D геномом методом RAPD. 65
3.1.1.1. RAPD-анализ уровней внутривидового полиморфизма видов Aegilops с D геномом. 65
3.1.1.2 Анализ межвидового полиморфизма видов Aegilops с D геномом методом RAPD. 69
3.1.2. Молекулярный анализ полиморфизма семейства генов резистентности у представителей рода Aegilops, обладающих D геномом. 75
3.1.2.1. Характеристика полиморфизма NBS-LRR-семейства генов резистентности у видов Aegilops,
обладающих D геномом. 75
3.1.2.2 Использование метода RGA-маркирования для определения филогении семейства генов устойчивости и их аналогов у видов Aegilops с D геномом. 77
3.2. Анализ внутривидовой изменчивости и филогенетических связей видов Aegiiops, содержащих U геном. 79
3.2.1. RAPD-анализ полиморфизма и филогенетических связей видов Aegiiops с U геномом. 79
3.2.11. RAPD-анализ уровней внутривидового полиморфизма видов Aegiiops с U геномом. 79
3.2.1.2 Анализ межвидового полиморфизма среди видов Aegiiops с U геномом методом RAPD. 84
3.2.2. Молекулярный анализ внутривидовой изменчивости и межвидовых различий аллотетраплоидных видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis. 91
3.2.2.1 RAPD-анализ внутривидовой изменчивости и межвидовых различий видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis. 92
3.2.2.2 AFLP-анализ внутривидовой изменчивости и межвидовых различий видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis. 94
3.2.2.3 ISSR-анализ внутривидовой изменчивости и межвидовых различий видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis. 96
3.2.2.4 Анализ полиморфизма последовательности ITS района рДНКу видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis. 98
3.2.3. Молекулярный анализ полиморфизма семейства генов резистентности у представителей рода Aegiiops, обладающих U геномом. 102
3.2.3.1. Характеристика полиморфизма NBS-LRR-семейства генов резистентности у представителей рода Aegiiops,
обладающих U геномом. 102
3.2.3.2 Использование метода RGA-маркирования для определения филогении семейства генов устойчивости и их аналогов у видов Aegiiops с U геномом. 104
3.3. Молекулярный анализ полиморфизма и филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса, обладающих S геномом. 107
3.3.1. RAPD-анализ изменчивости и филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса, обладающих S геномом. 107
3.4. Анализ внутривидового полиморфизма диплоидных видов Ае. caudata, Ае. uniaristata, Ае. comosa, Ае. heldreichii и Ае. mutica методом RAPD. 111
3. 5 Молекулярный анализ полиморфизма генома и филогенетических связей видов рода Aegilops. 113
3.5.1. Анализ полиморфизма и филогенетических отношений видов эгилопса с использованием AFLP. 113
3.5.1.1 Анализ внутривидового полиморфизма рода Aegilops, выявленного методом AFLP. 114
3.5.12 Использование AFLP- системы молекулярного маркирования для определения филогении видов рода A egiJops. 116
3.5.2. Использование RAPD-системы молекулярного маркирования для определения филогении видов рода Aegilops. 122
3.5.3. Анализ полиморфизма RGA - последовательностей и филогении семейства NBS-LRR генов резистентности у видов рода Aegilops. 125
3.5.4. Анализ полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК у диплоидных видов эгилопса, имеющих различные геномы. 128
3.5.5 Молекулярный анализ полиморфизма семейства генов гамма-глиадинов у видов рода Aegilops и Т. топососсит. 134
3.5.5.1 Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей гамма-глиадинов в геноме отдельных видов. 135
3.5.5.2 Сравнительный анализ последовательностей генов гамма-глиадинов у диплоидных видов рода Aegilops и вида пшеницы Taticum топососсит. 152
3.6. Анализ взаимоотношений и сравнение межвидовой изменчивости видов группы Aegilops -ТгШсит и рода Hordeum методом RAPD. 162
3.7. Использование данных молекулярного маркирования для анализа систематики и эволюции рода Aegilops. 165
Выводы. 177
Список литературы.
- Характеристика рода Aegilops L. и существующие таксономические проблемы
- Изучение видов рода Aegilops.
- Молекулярный анализ изменчивости и филогенетических связей видов Aegilops, имеющих D геном
- RAPD-анализ изменчивости и филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса, обладающих S геномом.
Введение к работе
Aegilops L- род однолетних злаков трибы ТгШсеае, На основании данных цитогенетического анализа у видов эгилопса выделяют семь основных типов генома: D, S, С, N, U, М и Т. При этом род Aegilops включает в себя виды с различным уровнем плоидности генома (диплоидный, тстраплоидный и гексаплоидный). Было показано, что полиплоидные виды рода представляют собой типичные аллополиплоидьт и, таким образом, для рода Aegilops характерен сетчатый характер эволюции. Родственные виды способны обмениваться генетическим материалом, что приводит к повышенной внутривидовой изменчивости и, в ряде случаев, отсутствию четких границ между видами.
Виды Aegilops являются ближайшими родичами культурных пшениц Т. durum и Т. aestivum, и составляют основную часть так называемого вторичного генофонда пшеницы (Triticum L.). Помимо этого, виды эгилопса секции Sitopsis и Aegilops tauschii считаются донорами, соответственно, В и D геномов культурной пшеницы. Этот факт обусловил повышенный интерес к исследованию рода Aegilops. Изучению рода способствовала возможность достаточно легкого получения гибридов, а таюке малое число и большой размер хромосом у видов рода. Благодаря этому, на настоящий момент род Aegilops является одним из наиболее исследованных в семействе злаков как морфологически, так и методами цитогенетики. Однако, несмотря на постоянный и длительный интерес к роду Aegilops, до сих пор не существует однозначного взгляда на систематику и эволюцию данной группы. Что касается исследования рода с применением новейших молекулярных методов, на настоящий момент, его нельзя считать хорошо изученным, поскольку до сих пор молекулярный анализ рода затрагивал лишь отдельные области генома или отдельные виды эгилопса.
Достаточная охар актер из ованность рода с точки зрения морфологии и цитогенетики, а таюке специфический характер эволюции в данной группе делает род Aegilops интересным объектом в качестве модельного таксона для изучения молекулярной изменчивости при сетчатой эволюции. Помимо этого, исследование видов эгилопса имеет прикладное значение вследствие их таксономической близости к культурной пшенице.
Характеристика рода Aegilops L. и существующие таксономические проблемы
Род Aegilops L. - относится к семейству Poaceae Barnhart (подсемейство Pooideae, настоящие злаки; триба ТгШсеае Dumort., пшепициевые; подтриба Tnticinae Griscb.). Aegilops является средиземном орско-западноазиатс ким родом, виды которого произрастают на территории Средиземноморья, а также Центральной и Западной Азии (Slageren, 1994). Центром происхождения и центром разнообразия рода, по всей видимости, можно считать Закавказье и Переднюю Азию. Таким образом, центр происхождения рода Aegilops, также как и у близкого ему рода Triticum, лежит в пределах Юго-Западноазиатского центра происхождения культурных растений (Вавилов, 1926, 1987; Slageren, 1994).
По существу, однолетние виды, составляющие род Aegilops, являются по происхождению средиземноморскими эфемерами. Интересно, что в трибе ТгШсеае в целом достаточно много однолетних видов. К однолетним видам трибы относятся такие важнейшие культурные растения как твердая и мягкая пшеница, рожь и ячмень. Хотя данная жизненная форма является признаком высокой специализации, но по многим другим признакам виды трибы оказываются достаточно примитивными (Цвелев, 1987). Виды ТгШсеае являются типичными «фестукоидными» злаками, для которых, в целом, характерна меньшая специализация, по сравнению с «эрагростоидными» и «паникоидными» злаками. При этом считается, что «фестукоидные» злаки являются довольно молодой группой. Их меньшая специализация в сравнении с другими злаками связывается с формированием данной группы в горных условиях, которые характеризуются большим разнообразием экологических ниш и большей выраженностью сезонности климата, что препятствовало специализации видов в каком-либо одном направлении (Цвелев, 1976).
Виды трибы ТгШсеае распространены, в основном, вне тропиков, а также в горных районах тропиков. Как уже указывалось, виды эгилопса произрастают на территории Средиземноморья, Центральной и Передней Азии, а также как заносные, известны в более северных областях и в США. Диплоидные виды рода, за исключением вида Ае. (auschii, имеют меньшие ареалы, чем тетраплоидные виды. Подобная картина характерна также и для других родов растений, что, по мнению Н.Н Цвелева, связано с деспециализацней эволюционных филумов при гибридизации (Цвелев 1973, 1975, 1992). Интересно, что при этом гексаплоидные виды, также как и диплоидные, имеют ограниченное распространение (Kimber and Feldman, 1987).
Род Aegilops был выделен Линнеем в 1753, хотя название "Aegilops" упоминалось уже в работах древних греков - Теофраста, Диоскорида и Галена (цит. по Slageren, 1994). Однако до сегодняшнего времери остается актуальным решение ряда таксономических проблем, связанных с представителями данного рода.В подавляющем большинстве работ долинсевского периода упоминается лишь один вид эгилопса — Ае: ovata, и только в отдельных работах приводятся некоторые другие виды - Ае. caudala, Ае. triuncialis и Ае. tauschii. В целом, в долинеезский период наименование "Aegilops" использовалось для обозначения злаковых растений самых различных родов - Avena, Briza, Bromus, Fesluca, Lolium, Phalaris, Triticum, и, кроме того, для растений родов Hyacinthus и Quercus (Slageren, 1994). Линней включил в род Aegilops дикие пшеницы, в то время как к роду Triticum им были отнесены только виды, имеющие культивируемые формы (цит. по Kimber and Feldman, 1987). Такое разделение на два рода поддерживалось исследователями в течение 200 лет. Так например, и А. Эйг (Eig, 1929а) и П.М. Жуковский (1928) относили некультивируемыс виды к роду Aegilops. Классификация с выделением Aegilops в качестве самостоятельного рода была предложена и X. Кихарой (Kihara, 1954). Стоит отметить, что и в двух недавних монографиях авторы также поддерживают деление на два рода (Hammer, 1980; Slageren, 1994). 1С сходным выводам приходят и П.К. Гупта и Б.Р, Баум (Gupta and Baum, 1986). Однако рядом исследователей было предложено объединить все пшеницы и эгилопсы в один род Triticum, т.к. по существу отсутствуют генетические барьеры между двумя этими родами (Stebbins, 1956; Bowden, 1959; Morris and Sears 1967). Но все же многими исследователями объединение родов Aegilops и Triticum в один не было поддержано. Например, в работе М.А. ШенневераЙа (Chennaveeriah, 1960) сохранялось деление на два рода, но при этом виды секции Sitopsis были отнесены к роду Triticum. С объединением не был согласен и П.М. Жуковский (1971), который подчеркивал, что «... на основании морфологических и цитогенетических исследований только секция Sitopsis рода Aegilops близка к роду Triticum и виды ее могли бы войти в систему рода Triticum». Таким образом, на настоящий момент таксономический статус и отношения родов пшеница и эгилопс являются предметом дискуссии.
Еще одной таксономической проблемой является спорный статус вида Ае. mutica. Данный вид характеризуется целым рядом признаков, сближающих его с видами других родов трибы, в частности с видами рода Agropyron. Поэтому отношение к этому виду двоякое: его либо рассматривают как примитивный вид, относящийся к роду Aegilops и близкий к родам Triticum и Agropyron, либо выделяют в отдельный род. Так, этот вид был помещен А. Эйгом (Eig, 1929а) сначала в отдельный подрод АтЫуоругит, а немногим позднее выделен в отдельный одноименный род (Eig, 1929в). В одной из последних монографий, посвященных пшеницам, Ае. mutica также выделен в отдельный род (Slageren, 1994).
Наиболее радикально система однолетних видов трибы Triticeae была пересмотрена А. Лёве (LOve, 1984), при этом была сделана попытка максимально полно отразить в новой системе сложившиеся к этому моменту представления о филогении рассматриваемых видов. В предложенной им системе, основанной на результатах цитологических исследований, в один род помещались виды, обладающие сходными геномами. Род Aegilops в данном варианте классификации был разделен на 13 независимых родов. Несомненно, использование эволюционных связей для построения системы оправдано, но, как было отмечено Г. Кимбером и М. Фельдманом (Kimber and Feldman, 1987), при этом подходе также возникли сложности, связанные с вопросом, какие геномы считать сходными для помещения в один род, а также с корректным наименованием множества новых и зачастую монотипных родов. По мнению Н.Н. Цвелева, правильность предложенного А. Лёве метода выделения родов сомнительна, так как различаемые на его основе роды часто морфологически очень слабо отличаются друг от друга (Цвелев, 1999).
Изучение видов рода Aegilops.
Приблизительно в это же время началось изучение морфологии хромосом у видов Aegilops. Первыми наиболее масштабными исследованиями в этой области можно считать работы Х.К. Эмме (Emme, 1924), О.Н. Сорокиной (1928) и М.В. Сеньяниновой-Корчагшюй (1932), в которых были охарактеризованы кариотипы большинства видов эгилопса. Интересно, что в работах М.В. Сеньяниновой-Корчагиной впервые была предпринята попытка использовать цитогенетические данные для систематики видов эгилопса. В последующих работах, с совершенствованием методики цитогепетических исследований, данные этих авторов были существенно дополнены.
Кроме того, в 1930 году была начата работа по геномному анализу видов рода Aegilops под руководством X. Кихары. Работа продолжалась около 30 лет и ее результаты были опубликованы в 1954 году. В результате было определено родство видов эгилопса, а также предложена еще одна система рода, которая включала 20 видов и 6 секций. Диплоидные виды рода были разделены на три группы: С-геиомная, М- геномная (включая D геном) и S-геномная и использованы как анализаторы в скрещиваниях с полиплоидами. Изучение конъюгации хромосом у межвидовых гибридов первого поколения, а также сравнение полиплоидных видов с искусственно полученными амфиплоидами позволило установить геномные формулы всех проанализированных видов (Kihara, 1954).
В 1960 году была опубликована работа М.С. Шенневерайя, в которой был выполнен кариоморфологический и цитотаксономический анализ рода Aegilops (Chennaveeraiah, 1960). Результатом проделанной работы, помимов вего прочего, стало разделение С- геномной группы X. Кихары на С- (вид Ае. caudata) и U-геномную {Ае. umbelluiata) группы, а М- геномной - на М- {Ае. comosa) и N- {Ае. uniaristata) геномную, кроме того было поставлено под сомнение близкое родство геномов видов Ае. comosa, Ае. tauschii и Ае. mutica, которые были включены X. Кихарой в М-геномную группу.
Очень подробно была изучена меж- и внутривидовая изменчивость хромосом у различных групп видов Aegilops методами С-бэндинга и флуоресцентной гибридизации in situ в серии работ Е.Д. Бадаевой с сотрудниками (Бадаева и др., 1999, Badaeva et al., 1996, 2002, 2004). В результате были охарактеризованы характер С-бэндинга, основные типы хромосомных перестроек, а также филогенетические отношения и степень модификации родительских геномов у исследованых видов.
Интересно что, несмотря па достаточно сильный интерес исследователей к изучению рода Aegilops, молекулярными методами род до сих пор изучен явно недостаточно. Наиболее интересным представляется цикл работ, посвященный исследованию вариабельности повторяющихся нуклеотидных последовательностей генома у различных видов эгилопса, в котором на основании полученных данных были определены происхоледение полиплоидных геномов и установлены филогенетические отношения между видами рода (Dvorak and Zhang, 1992; Zhang and Dvorak, 1992; Dubcovsky and Dvorak, 1994, 1995; Resta et al.,1996). В работах данного цикла виды рода были изучены наиболее полно и последовательно.. Однако стоит отметить, что, во-первых, была исследована только одна из составляющих генома -повторяющаяся ДНК, а во-вторых, исследовались преимущественно межвидовые различия, в то время как вопрос об уровнях внутривидового полиморфизма ДНК оставался открытым. Исключением в этом отношении является работа тех же авторов, посвященная исследованию полиморфизма повторяющихся нуклеотидных последовательностей у видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis, где анализировались не только происхождение геномов данных видов, но и внутривидовая изменчивость (Zhang etal., 1992).
Еще одной составляющей ядерного генома, полиморфизм которой был проанализирован у видов эгилопса, является рибосомная ДНК. В работе Ж.Б. Ванга с сотрудниками (Wang et al., 2000) была определена последовательность внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК, и на основе полученных данных установлены филогенетические отношения между видами рода. Но, опять же, внутривидовые различия ITS последовательностей рДНК в данном исследовании не были проанализированы.
Что касается прочих последовательностей ядерного генома Aegilops, то на настоящий момент они мало исследованы. При этом, обычно изучали полиморфизм у представителей видов из какого-либо одного региона. Примером такого рода работ можно считать исследование генетического разнообразия центрально-азиатских и северо-кавказских видов эгилопса методом RAPD (Okuno et al., 1998), или AFLP-анализ полиморфизма у видов эгилопса, произрастающих в Испании (Monte et al., 2001). Отдельного упоминания заслуживает работа, в которой был проанализирован внутривидовой полиморфизм видов эгилопса с S геномом и Ае. tauschii по 52 локусам, расположенным в геномных областях с низкой и высокой рекомбинационной активностью и была установлена взаимосвязь уровня внутривидовой изменчивости и типа опыления исследованных видов (Dvorak et al., 1998а). Отдельные молекулярные работы были посвящены исследованию частных вопросов. Так например, с использованием различных методов было выявлено множественное происхождение вида Ае. triuncialis (Vanichanon et al., 2003), a методика STS-PCR была использована для проверки гипотезы об обмене генами между симпатрическими популяциями полиплоидных видов эгилопса с U геномом (Chee et al., 1995). В работе К. Кэлдвел с сотрудниками с целью изучения происхождения D генома полиплоидных видов ТгШсит aestivum и Aegilops cylindrica был подробно исследован полиморфизм последовательностей двух локусов: Xwye838, кодирующего ADP-глюкопирофосфорилазу и Gss, кодирующего грануло-связанную крахмал-сиитазу у указанных полиплоидных и родительского диплоидного вида Ае. tauschii (Caldwell et al., 2004).
Таким образом, до настоящего момента не был осуществлен комплексный анализ внутри- и межвидовой изменчивости различных областей генома у видов рода Aegilops молекулярными методами.
Молекулярный анализ изменчивости и филогенетических связей видов Aegilops, имеющих D геном
Еще одной задачей данной работы был анализ филогенетических связей в группе видов Aegilops, имеющих D геном, а также определение родственных отношений видов данной группы с другими диплоидными видами эгилопса.
Для анализа филогенетических связей в группе видов Aegilops, имеющих D геном, были собраны смеси ДНК в соответствии с данными о внутривидовой изменчивости (глава 2). В результате, вид Ае. tauschii был представлен 4 образцами; виды Ае. ventricosa и Ае. cylindrica представлены каждый одним образцом; вид Ае. juvenalis - 2 образцами (juv66 и смесь ДНК остальных образцов); Ае. vavilovii также 2 образцами (vavil41 и смесь ДНК остальных образцов); Ае. crassa - б образцами (1й -смесь ДНК образцов сгЗОІ, сг302, сгЗОЗ, составляющих обособленный подкластер, и относящимися по данным цитогенетики к виду Ае. vavilovii (Е.Д, Бадаева, неопубликованные данные); 2й - тетраплоидный образец сг852; еще три - смеси ДНК образцов гексаплоидной формы; оставшийся образец - смесь ДНК схожих образцов с неизвестным уровнем плоидности) (рис 3.1-3.3, табл. 2.1). Полученные образцы ДНК были проанализированы с использованием 11 праймеров (OPD 12, OPD б, OPD 10, ОРЕ 5, ОРЕ б, ОРК 9, ОРК10, OPN 15, OPN 19, OPN 3, OPN 8). Всего при анализе было получено 788 полиморфных RAPD фрагментов. По результатам анализа были определены генетические расстояния и построена дендрограмма (рис. 3.5).
На дендрограмме виды с D геномом: Ае. ventricosa (DN), Ае. crassa (DX и DXD), Ае. juvenalis (DXU), Ае. vavilovii (DXS) образуют вместе с Ае, tauschii (D) отдельный полиморфный кластер, заметно обособленный от кластеров прочих видов (рис. 3.5). Это говорит, во-первых, о том, что геномы этих видов более похожи на геном Л е. tauschii, чем на геномы прочих проанализированных видов, и, во-вторых, о том, что сам D геном заметно отличается от других геномов. Так, максимальное расстояние между отдельными видами внутри данного D геномного кластера составляет 0,145, в то время как расстояние между данным кластером и ближайшим к нему кластером видов Ае. uniaristaia (геном N), Ае. comosa (геном М), Ае. heldreichii (геном. М) равно 0,215. Стоит отмстить, что виды Ае. tauschii, Ае. ventricosa, Ае. crassa, Ае. juvenalis и Ае. vavilovii, образовавшие отдельный, хорошо обособленный кластер, близки также морфологически и по данным цитогенетического анализа, на основании чего их выделяют в отдельную секцию Vertebrata (Kihara, 1954).
Кластер видов Ае. tauschii, Ае. ventricosa, Ае. crassa, Ае. juvenalis, Ае. vavilovii, в свою очередь, разделяется на три основных подкластера в соответствии с разными типами геномов. Так, отдельный подкластер образуют представители родительского диплоидного вида Ае, tauschii, который имеет геном D, к данному подкластсру примыкает подкластер вида Ае. ventricosa (геном DN). Заметно обособлен от них кластер видов, имеющих в составе своих аллоплоидных геномов и геномы D и X; сюда входят виды Ае. crassa (геномы DX и DXD), Ае. juvenalis (геном DXU), Ае, vavilovii (геном DXS). Внутри данного подкластера виды обособлены друг от друга, а тетраплоидные и гексаплоидные образцы Ае. crassa образуют единую смешанную группу.
Интересно отметить, что входящие в данный подкластер виды также имеют сходную морфологию, и, по-видимому, общее происхождение. Показано, что тетраплоидная форма Ае. crassa является предковой для гексаплоидных видов Ае. juvenalis и Ае. vavilovii, а также для гексаплоидной формы Ае. crassa (Badaeva et al., 2002; Zhang and Dvorak, 1992; Dubcovsky and Dvorak, 1995). Согласно нашим данным, эти виды образуют отдельный подкластер. Уровень различий между видами данного подкластера относительно невысок и вполне сопоставим с уровнем различий между отдельными представителями видаЛе. tauschii, что также говорит о сходстве геномов этих видов и в пользу возможной общности происхождения.
Рядом авторов были получены данные о значительных отличиях генома Ае. juvenalis от геномов предковых форм, а также от геномов других гексаплоидных видов этой группы - Ае. crassa и Ае. vavilovii. Так, согласно данным, полученным методами дифференциального окрашивания и FISH гибридизации, хромосомы Ае. juvenalis существенно отличаются от хромосом предковых форм и родственных гексаплоидных видов (Badaeva et al., 2002). Сходные результаты получены и при анализе полиморфизма рестрпкционных спектров повторяющихся последовательностей. Было показано, что по данным RPLP анализа U геном Ае. juvenalis сильно изменен относительно исходного U генома Ае, umbellulata, а таюке у Ае. juvenalis отсутствует один из пяти маркерных фрагментов, характерных для двух оставшихся гсксаплоидов - Ае. crassa нАе. vavilovii (Dubcovsky and Dvorak, 1995). В нашем исследовании при мультилокусном маркировании методом RAPD не было получено данных в пользу наибольшей обособленности Ае. juvenalis по сравнению с Ае. vavilovii и гексаплоидньши формами Ае. crassa.
RAPD-анализ изменчивости и филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса, обладающих S геномом.
Интересно также выявленное при использовании RAPD-анализа сходство между UX и UC геномами, которое может свидетельствовать о возможном участии С или близкого ему генома в формировании генома X. Это сходство может быть вероятным следствием либо непосредственного происхождения X генома от С с последующей существенной модификацией, либо обмена генетическим материалом между «дифференциальными» геномами в гибридах полиплоидов U группы (в данном случае, - предковои формы видов с UX геномом и Ае. triuncialis с геномом UC), которое, как предполагают Д. Зохари и М. Фельдман (Zohary and Feldman, 1962) и приводит к формированию рекомбинантных геномов.
Еще одним интересным результатом являются данные о сходстве видов с UM геномом с предковым диплоидным видом Ае. umbellulata (U геном). Как уже было сказано, за исключением Ае. juvenalis, все полиплоидные виды U группы обладают значительным сходством с Ае. umbellulata. При этом, по данным RAPD-анализа максимальное сходство с Ае. umbellulata было показано именно для Ае. ovata и Ае. biuncialis. Расстояние между кластером данных видов и видом Ае. umbellulata лишь немногим больше расстояния между видами Ае. triaristata и Ае. columnaris, которые имеют одинаковый тип генома. Такое сходство с донором одного из геномов - видом Ае. umbellulata- можно объяснить либо значительным насыщением второго генома -М - последовательностями U генома, либо тем, что М геном, возможно, сам по себе наиболее близок к U, по сравнению с прочими геномами, входящими в состав полиплоидных геномов видов U группы.
Полученные нами данные о близости геномов UX и UC, а также UM с U геномом подтверждают результаты, полученные при анализе полиморфизма низкокопийных ДНК-последовательностей с применением STS праймеров и последующей рестрикцией полученных фрагментов (Chee et al., 1995). В данной работе также было показано сходство видов Ае. triaristata и Ае. columnaris с видом Ае. triuncialis, а видов Ае. ovata и Ае. biuncialis с Ае. umbellulata. В то же время при анализе полиморфизма повторяющихся последовательностей и С бэндинга данных о сходстве UX генома с UC геномом Ае. triuncialis получено не было (Resta et al., 1996, Badacva et al., 2004).
Также интересно отметить, что в нашем исследовании уровень различий между видами Ае. ovata и Ае, biuncialis был несколько меньшим, чем уровень различий между Ае. triaristata и Ае. columnaris. Ранее же при анализе RFLP полиморфизма повторяющихся последовательностей данных видов, различий между геномами Ае. triaristata и Ае. columnaris показано не было, в то же время геномы Ае. ovata и Ае. biuncialis отличались по трем фрагментам RFLP-спектров (Resta et al., 1996). Различия по характеру С- бэндинга и FISH- гибридизации также были большими в паре видов Ае. ovata и Ае. biuncialis, по сравнению с парой Ае. triaristata - Ае. columnarist на основании чего было сделано предположение о возможном происхождении Ае. triaristata и Ае. columnaris от общей предковой формы (Badaeva et al, 2004). По всей видимости, расхождение в полученных результатах может быть связано как со специфичностью анализируемых последовательностей, так и разрешающей способностью методов.
Наиболее обособленными в пределах U-кластера в нашем исследовании оказались виды, обладающие US- типом геномом -Ае. kotschyi и Ае. variabilis. Стоит отметить, что данные виды несколько отличны от прочих видов с U геномом и по морфологии, - на основании морфологических особенностей Ае. kotschyi и Ае, variabilis были выделены А. Эйгом в отдельную подсекцию Adhaerens, в то время как прочие виды с U геномом вошли в состав другой подсекции- Libera (Eig, 1929а). Вероятно, такая обособленность Ае. kotschyi и Ае. variabilis, обладающих US геномом, обусловлена тем, что S геном сам по себе значительно отличается от прочих типов геномов. Так, по мнению М.А. Шеннавераиа, основанном на данных морфологического и цитогенетического анализа, виды секции Sitopsis, обладающие S геномом, стоят особняком от прочих Aegilops и скорее близки к видам рода Triticum (Chennaveeraiah, 1960).
Как уже было указано, единственным полиплоидом с U геномом, который не группируется вместе с остальными видами U группы, является Ае. juvenalis. Он образует обособленный подкластер вместе с предковым диплоидным видом Ае. tauschii (D геном). Сходство Ае. juvenalis с Ае. tauschii и другими полиплоидами с D геномом обсуждалось в разделе 3.1.1. Данные виды также близки морфологически, и по мнению Д. Зохари и М. Фельдмана входят в одну из трех естественных групп, которая объединяет виды эгилопса с D геномом (Zohary and Feldman, 1962; Kimbcr and Feldman, 1987). Ae. juvenalis, таким образом, по морфологическим и цитогенетическим данным относится к группе видов, объединенных наличием D генома, что согласуется с полученной нами картиной кластеризации.
Таким образом, с использованием метода RAPD-анализа была показана обособленность группы видов эгилопса, объединенных наличием U генома, от прочих видов рода и определены филогенетические отношения между видами данной группы.
Представлялось интересным проанализировать изменчивость и взаимоотношения видов Aegilops kotschyi. и Aegilops variabilis, которые являются близкородственными аллотетраплоидами. Как было показано, данные виды сходны морфологически и обладают одним и тем же типом генома: US (Berg,1937; Kihara, 1940, 1949; Tanaka 1955; Kimber and Yen, 1989). Интересно, что при этом внутри видов наблюдается сильная морфологическая изменчивость, а также изменчивость по морфологии хромосом. Ареалы видов частично перекрываются, но экологические требования у них несколько различны - вид Aegilops kotschyi более приспособлен к аридным условиям, чем Aegilops variabilis (Kimber and Feldman, 1987). Особо стоит отметить, что в зоне контакта происходит спонтанная гибридизация видов, которая приводит к образованию форм, промежуточных по морфологическим признакам. Следствием этого является неоднозначное отношение систематиков к данным видам: большинством исследователей Ae. kotschyi и Ae. variabilis рассматриваются в качестве самостоятельных видов (Slageren, 1994; Kimber and Feldman, 1987), но другми подчеркивается их конспецифичность по ряду критериев (Bowden, 1959).
Для определения филогенетических отношений между видами и оценки уровня внутривидовой изменчивости по молекулярным маркерам нами был проведен анализ геномов методами AFLP и RAPD, выявляющими, в первую очередь, полиморфизм уникальных и умеренно повторяющихся последовательностей, методом ISSR, который был использован для исследования внутривидового полиморфизма межмикросателлитных участков генома, а также анализ полиморфизма пуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейссров (ITS) рибосомной ДНК.
Для RAPD анализа генома видов Ае. kotschyi и Ае. variabilis было отобрано 12 популяций вида Aegilops variabilis и 15 популяций Ае. kotschyi из разных географических районов, охватывающих ареалы этих видов. Помимо этого, в анализ было включено по одному представителю диплоидных видов Ае. umbelluiata и Ае. longissima, обладающих соответственно U и S геномами, которые составляют геном US Ае. kotschyi и Ае. variabilis (табл. 2.4). Для анализа было использовано 8 праймеров из числа применявшихся и в других задачах исследования. Всего при анализе был получен 331 RAPD фрагмент, из которых 316 являются полиморфными. Стоит обратить внимание, что было выявлено лишь 3 видоспецифичных фрагмента: фрагменты OPN15 (850 п. и.) и OPD12 (1300 п.н.) присутствовали только во всех спектрах представителей вида Ае. kotschyi, а фрагмент ОРК9 (1100 п.н.) - только в спектрах образцов Ае. variabilis. По результатам анализа были определены генетические расстояния и построена дендрограмма (рис. 3.13).
