Содержание к диссертации
Введение
Глава I 1. Обзор литературы 17
1.1. Определение генетического полиморфизма. Значение генетического полиморфизма в современной медицинской генетике.
1.2. Мультифакториальные болезни и факторы их развития
1.2.1. Генетические факторы 22
1.2.2. Факторы внешней среды 23
1.3. Генетическое тестирование мультифакториальных заболеваний
1.3.1. .Основные задачи предиктивной медицины 26
1.3.2. Сердечно-сосудистые заболевания и гены предрасположенности
1.3.3. Онкологические заболевания и гены предрасположенности к онкологическим заболеваниям
1.4. Старение и долгожительство . 34
1.4.1. История изучения старения и долгожительства 35
1.4.2. Проблема старения на современном этапе 37
1.4.3. Факторы и причины старения 38
1.4.3.1 Факторы, определяющие продолжительность жизни
1.4.3.2. Основные теории старения и долгожительства 40
1.4.4. Гены, ассоциированные с долгожительством 46
1.4.4.1. Гены сердечно-сосудистой системы 48
1.4.4.1.1. Гены метаболизма липидов 48
1.4.4.1.2. Гены ренин-ангиотензиновой системы 53
1.4.4.1.3. Гены, контролирующие обмен оксида азота 57
1.4.4.1.4. Гены, регулирующие уровень гомоцистеина 59 в крови
1.4.4.1.5. Гены фибринолиза 60
1.4.4.2. Гены метаболизма (внешней среды) 62
1.4.4.2.1.1- я фаза детоксикации 63
1.4.4.2.2.2-я фаза детоксикации 63
1.4.4.3. Гены антиоксидантной защиты и ответа на стресс
1.4.4.4. Гены митохондриальной ДНК 69
1.4.4.5. Гены воспаления и иммунного ответа 70
Глава II 2. Материалы и методы 74
2.1. Обследуемые группы 74
2.2. Использованные материалы, реактивы, и оборудование
2.3. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
2.4. Проведение полимеразной цепной реакции (ПНР) 77
2.4.1. Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом ПААГ
2.4.2. Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе
2.5. Электрофорез в нативном ПААГ и визуализация результатов
2.6. Гидролиз ПНР-фрагментов 81
2.7. Гибридизацию меченого продукта на микрочипе Регистрация изображения и его обработка
2.9. Статистические методы 83
Глава III 3. Результаты и обсуждение 85
3.1. Анализ полиморфизма генов сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2) у новорожденных, лиц среднего возраста и у лиц старше 69 лет
3.1.1. Анализ соответствия распределения генотипов закону Харди-Вайнберга
3.1.2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS3, MTHFR, GPIIIa, РАН, GSTM1, GSTTI, NAT2) у новорожденных, лиц среднего возраста и у лиц старше 69 лет
3.1.3. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS3, MTHFR, GPIIIa, РАН, GSTM1, GSTTI, NAT2) в возрастных подгруппах лиц старше 69 лет.
3.2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей 110
генов сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTRI, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и генов
системы детоксикации (GSTM1, GSTTI, NAT2) у лиц старше 69 лет с некоторыми мультифакторными заболеваниями
3.3. Корреляционный анализ генетических и возрастных показателей
3.3.1. Корреляционный анализ между генами сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН), генами системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2) и возрастом (для лиц старше 69 лет)
3.3.2. Корреляционный анализ взаимодействий между генами сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT,
AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTTI, NAT2)
3.4. Комплексный анализ генов сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTTI, NAT2)
у новорожденных, лиц среднего возраста (популяция) и у лиц старше 69 лет
3.4.1. Анализ взаимодействия генов сердечно- сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTTI, NAT2) у новорожденных (Н), лиц среднего возраста (П) и у лиц старше 69 лет (С)
3.4.2. Анализ взаимодействия генов сердечно- сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTTI, NAT2) у лиц старше 69 лет с хроническими заболеваниями в анамнезе Заключение 141
Выводы 150
Список литературы
- Мультифакториальные болезни и факторы их развития
- Факторы, определяющие продолжительность жизни
- Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе
- Корреляционный анализ между генами сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН), генами системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2) и возрастом (для лиц старше 69 лет)
Введение к работе
Итогом Международной программы «Геном человека» явилась идентификация практически всех генов, в том числе и тех, мутации которых приводят к наследственным болезням либо предрасполагают к мультифакториальным заболеваниям. Появилась реальная возможность не только проводить точную молекулярную диагностику, но и с определенной вероятностью оценить предрасположенность человека к тому или иному заболеванию (Шварц, 1997; Nebert, 1997; Баранов и др., 2000).
Хорошо известно, что ранняя диагностика и своевременная профилактика различных заболеваний является актуальной проблемой современной медицины. Как правило, пациент обращается к врачу, когда болезнь уже имеет клинические проявления и не редко серьезные осложнения. При этом основная причина патологического процесса зачастую остается невыясненной (Баранов и др., 2000). В этом случае самое интенсивное лечение требует постоянного применения лекарственных препаратов и может лишь временно улучшить состояние пациента
Поиск генетических маркеров, отвечающих за наследственную предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям, является главной целью современной предиктивной медицины. На практике такая цель может быть достигнута путем молекулярного тестирования генов, получивших название "генов предрасположенности" «suceptibility genes» (Collins, 1999). Последние можно определить как гены, наследственные варианты (полиморфизм) которых совместимы с жизнью, но в сочетании с неблагоприятными внешними факторами могут быть причиной различных патологических состояний и заболеваний, в том числе и таких частых как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, остеопороз, сахарный диабет, бронхиальная астма, и прочих (Баранов и др., 2000).
Выяснение составляющих генной сети каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней ключевых ("центральных") генов и генов-модификаторов (Колчанов и др., 2003), анализ ассоциации их полиморфизма с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для каждого конкретного пациента составляют стратегическую основу нового, быстро развивающего направления - предиктивной (предсказательной) медицины. Для более точной оценки роли генетического полиморфизма в этиологии заболевания особенно перспективным представляется изучение полиморфизма генов, контролирующих наиболее важные, биохимически взаимосвязанные процессы метаболизма. Особый интерес в этой связи представляет изучение полиморфизма генов сердечно-сосудистой системы и системы детоксикации ксенобиотиков. Результаты исследований показали, что полиморфизм генов соответствующих систем существенно меняет их активность, и может быть основной причиной биохимических и функциональных нарушений, приводящих к серьезным острым и хроническим заболеваниям (Пузырев, 2003; Rupert et ah, 2003; Zhu et ah, 2003; Naber et ah, 2004a,b). Поэтому ранняя диагностика наследственной предрасположенности к этим заболеваниям имеет решающее значение для предиктивной медицины, как один из реальных путей в борьбе за активное долголетие, против преждевременного старения (Schachter et ah, 1994; Varcasia et ah, 2001; Анисимов, 2003).
Число работ, посвященных изучению особенностей частот "функционально-значимого" полиморфизма в различных популяциях стремительно растет. Подробно изучается полиморфизм генов, вовлеченных в этиологию и патогенез многих тяжелых хронических заболеваний, таких как сердечно-сосудистые, нейро-дегенеративные и онкологические (Baranov et ah, 1996; Шварц, 1997; Пузырев, 2003). Важная информация о вкладе того или иного генетического полиморфизма в развитие мультифакториальных заболеваний, в процессы долголетия и старения может быть получена путем сравнения частот аллелей в разных возрастных группах, начиная от рождения и до глубокой старости. В доступной литературе такие исследования нами не обнаружены. Исключение составляют специальные исследования преимущественно последних лет, посвященные сравнению аллельных частот некоторых генов у лиц среднего возраста и у столетних стариков с целью поиска генетического полиморфизма, положительно ассоциированного с долгожительством (Анисимов, 2003).
Цель настоящей работы - анализ полиморфизма генов сердечнососудистой системы и системы детоксикации в разных возрастных группах (новорожденные, лица среднего возраста и старше 69 лет)
Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих задач:
1. Исследовать полиморфизм генов сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS3, MTHFR, GPIIIa, РАН);
2. Исследовать полиморфизм генов системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2);
3. Провести сравнительный анализ полиморфизма генов сердечнососудистой системы и генов системы детоксикации в разных возрастных группах;
4. Проанализировать ассоциацию полиморфизма изученных генов с некоторыми частыми возрастными заболеваниями. Научная новизна работы:
S Впервые изучены особенности аллельного полиморфизма семи генов сердечно-сосудистой системы {АСЕ, AGT, AGTR1, NOS3, MTHFR, GPIIIa, РАН) и трех генов системы детоксикации {GSTMI, GSTT1, NAT2) в трех возрастных группах населения Северо-Западного региона РФ.
S Проанализированы ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с пятью различными заболеваниями у лиц старше 69 лет: ишемическая болезнь сердца (ИБС), гипертоническая болезнь (ГБ), острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК), инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНСД), катаракта.
S Впервые для трех возрастных групп показаны отличия в распределении частот генотипов по отдельным генам (NAT2 и GSTM1) и их сочетаниям {GPIIIa Al/Al + AGTR1 М- и GPIIIa А1/А1 + GSTM1 0/0), установлены различия в распределении частот сочетанных генотипов четырех генов системы «Давление», и трех генов системы детоксикации.
S Впервые показано, что у лиц мужского пола частоты А2 аллели гена GPIIIa и сочетанного генотипа GSTM1 {+) GSTTI {+) уменьшаются в ряду новорожденные - лица среднего возраста - лица старше 69 лет.
S Впервые выявлены возрастные «рубежи» изменения частот генотипов: 75 лет для генотипа А2/А2 {GPIIIa), 90 лет - для генотипа С/С (AGT).
S Для лиц старше 69 лет впервые установлена ассоциация сочетанных генотипов GSTM1 (0/0)+ MTHFR (С/-) + NAT2 (N/S) с ИБС, GPIIIa {МІМ) + NOS3 (4/4 или 5/5) - с ИНСД, AGT (Т/Т) - с ОНМК, AGTR1 (А/С) + РАН (4G/4G или 5G/5G)+ NOS3 (4/4 или 5/5) - с катарактой. Для лиц старше 69 лет при комплексном анализе полиморфизма генов, продукты которых регулируют давление, впервые показано, что «неблагоприятные» аллели и генотипы этой системы ассоциированы с ИНСД.
Практическая значимость:
Анализ полиморфных вариантов генов сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOSS, MTHFR, GPIIIa, РАН) и генов системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2) можно рассматривать как прогностический тест для оценки риска развития ИБС, ГБ, ОНМК, ИНСД и катаракты.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распределение частот генотипов по отдельным генам (NAT2 и GSTMI), их сочетаниям (GPIIIa Al/Al + AGTR1 А/- и GPIIIa Al/Al + GSTMI 0/0), а также частот сочетанных генотипов 4 генов регулирующих давление, и 3 генов системы детоксикации в трех возрастных группах отличается.
2. Выявлено уменьшение частоты А2 аллели GPIIIa гена и сочетанного генотипа GSTMI (+) GSTT1 (+) у лиц мужского пола в ряду новорожденные - лица среднего возраста - лица старше 69 лет.
3. Установлены возрастные «рубежи» изменения частот генотипов: 75 лет для генотипов АСЕ (I/I) и GPIIIa (А2/А2), 90 лет - для генотипа AGT (С/С).
4. У лиц старше 69 лет выявлена ассоциация генотипов: GSTMI (0/0)+ MTHFR (С/-) + NAT2 (N/S) с ИБС, GPIIIa (А2/А2) + NOS3 (4/4 или 5/5) -с ИНСД, AGT (Т/Т) - с ОНМК, AGTR1 (А/С) + РАН (4G/4G или 5G/5G)+ NOS3 (4/4 или 5/5) - с катарактой. Некоторые сочетанные генотипы по 4-м генам системы «Давление», ассоциированы с ИНСД у лиц старше 69 лет. 5. Выявленные ассоциации полиморфизма изученных генов с долгожительством и мультифакториальными заболеваниями подтверждают предположение о том, что с возрастом происходит элиминация из популяции ряда генотипов и аллелей генов «предрасположенности».
6. Наличие «функционально неблагоприятных» аллелей следует учитывать при разработке индивидуальных программ профилактики заболеваний и «антистарения».
Мультифакториальные болезни и факторы их развития
Расшифровка генома человека позволила лучше понять, как формируется физиологический статус организма, каков патогенез многих заболеваний. Это эпохальное событие дало новый импульс в изучении мультифакториальных заболеваний (Баранов и др., 2000). На рисунке 1 приведены наиболее изученные мультифакториальные заболевания. Особенно важное место среди них принадлежит сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям, которые являются основными причинами смерти в РФ (56,7% и 13,7%) соответственно) (XVII (80) сессия Общего собрания РАМН).
В общей сложности список основных болезней с наследственной предрасположенностью включает сотни заболеваний, в том числе и такие распространенные, как ИБС, сахарный диабет, гипертоническая болезнь, рак молочной железы, рак легкого, рак предстательной железы, наркомания, бронхиальная астма, остеопороз и некоторые другие (Баранов, Хавинсон, 2001). Эти болезни характеризуются так же высокой популяционной частотой (Todd, 1997).
Важно подчеркнуть, что генетическое тестирование проводится только для тех болезней, для которых в предварительных исследованиях среди больных «своего» региона была показана неслучайная ассоциация «функционально ослабленной» аллели с соответствующей болезнью и проведены подсчеты эмпирического риска развития заболевания при наличии определенного генотипа.
Генетическое тестирование в досимптоматический период позволяет оценить риск того или иного заболевания и, исходя из современного врачебного опыта, наметить возможные пути их профилактики (Баранов, Хавинсон, 2001). Развитие генетического тестирования наследственной предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям является основой молекулярной медицины - медицины будущего. Этот новый раздел медицинской науки включает диагностику факторов риска и ряд профилактических и лечебных мер (см. рис. 2), причем основную роль отводят именно выявлению генетических факторов риска.
Важной особенностью молекулярной медицины является ее индивидуальный характер и профилактическая направленность.
Развитие мультифакториального заболевания результат
взаимодействия генетических и средовых факторов. Причем если вклад средового фактора сводится к минимуму при моногенных заболеваниях, то при болезнях с поздней манифестацией, особенно в случае мультифакториальных заболеваний, его роль особенно существенна.
Реакция самого организма на экзогенные факторы сугубо индивидуальна и зависит от полиморфизма генов метаболизма, ранее называемых генами «внешней среды» (environmental genes) (см. рис. 3).
Генетические факторы являются тем фундаментом, на котором формируется тот или иной физиологический статус организма, его предрасположенность или наоборот - резистентность к тому или иному заболеванию. В большинстве мультифакториальных заболеваний их развитие определяется мутациями (генетическим полиморфизмом) не в одном, а сразу в нескольких генах. Тестирование генов предрасположенности и соответствующая профилактика заболеваний (коррекция образа жизни, питания, применение лекарственных препаратов, физические нагрузки и пр.) могут существенно уменьшить число лиц, у которых реально разовьется та или иная патология (атеросклероз, сахарный диабет, гипертония, остеопороз и др.) (Шварц, 1997; Баранов и др., 2000; Пузырев, 2003).
Изучение наследственной предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям заключается в определении особенностей полиморфизма «главных» генов, которые вносят основной вклад в генетическую природу заболевания, и «второстепенных» генов, вклад каждого из которых в патогенез болезни относительно невелик. Совместное действие этих «главных» и «второстепенных» генов формирует генетический фон, на котором развивается патологический процесс (Баранов и др., 2000; Гинтер, 2001).
Для разных заболеваний выявлен разный вклад генетического компонента. Так, в результате многочисленных эпидемиологических исследований было показано, что патогенез остеопороза на 15-25% обусловлен воздействием факторами окружающей среды и на 75-85% генетической предрасположенностью (Jouanny et al, 1995; Ralston, 1999). Анализ близнецовых пар в семьях больных диабетом показал, что роль генетического компонента в развития инсулинозависимого сахарного диабета (ИЗСД) достигает 73% (Kyvik et al, 1995), для психических заболеваний, таких как депрессия и алкогольная зависимость, вклад генетической компоненты ниже и определен в 40 и 60%, соответственно (Баранов и др., 2000).
Многочисленные эпидемиологические исследования указывают на то, что практически все широко распространенные заболевания, включая почти 90% всех злокачественных опухолей, в той или иной мере связаны с неблагоприятными внешними факторами, среди которых видное место принадлежит курению и неправильному питанию. Различные химические токсины, воздействуя на организм, могут провоцировать начало этих заболеваний. Гены, детерминирующие реакцию организма на ксенобиотики, вкючая экзотоксины, кодируют белки, которые по-разному взаимодействуют с этими веществами. В зависимости от особенностей генома, различные индивидуумы могут сохранять устойчивость или, напротив, обнаруживать повышенную чувствительность к различным повреждающим агентам (Баранов и др., 2000).
Существует ряд факторов, приводящих к развитию мультифакториальных заболеваний: образ жизни (нарушение естественных биоритмов) и его условия (качество), неправильное и/или несбалансированное питание, неадекватная и/или недостаточная физическая нагрузка, лекарственные и другие химические и фармацевтические препараты, работа на «вредных» производствах, климат и др.
Факторы, определяющие продолжительность жизни
Борьба за активное долголетие, за максимальное продление жизни -извечная проблема и сокровенная мечта человечества.
Древние греки считали, что продлить жизнь дальше некоего предела и предотвратить смерть невозможно, можно только помочь каждому прожить его естественную жизнь без тяжелых болезней.
В средние века геронтобиология только начинала формироваться и, в основном, опиралась на религиозные и философские представления, далекие от реальности (Торчинов, 1998).
С течением времени происходило накопление наблюдений и экспериментальных фактов, значительно увеличился объем количественных данных, для обработки которых стали применяться статистические методы. В этот период начали выходить трактаты врачей и философов (Г. Церби, Д. Кардано, Ф. Бэкона, А. Галлера, Б. Раша, X. Гуфеланда и др.), в которых подробно описывались физиологические и психологические симптомы старости и возрастные заболевания. Составлялись демографические таблицы продолжительности жизни, сравнивалась продолжительность жизни разных видов, делались попытки установить связь между такими параметрами, как продолжительность жизни и длительностью эмбрионального (внутриутробного) развития, периодом роста организма. (Гаврилов, Гаврилова, 1991).
Научные исследования XIX и начала XX века привели к открытию таких важных биологических концепций и законов, как клеточное строение организмов, теория эволюции и законы наследственности. Сформировались основные биологические дисциплины, составившие основу науки о биологии старения - геронтобиологии.
Термин геронтология (наука о старении) вперые появился в книге И.И. Мечниковым "Этюды о природе человека", опубликованной на французском языке в 1903 г. (Мечников, 1988). Понятие «гериатрия» (медицина старения) было предложено в 1909г. И. Нашером (Грмек, 1964).
Широкую известность получила теория А. Вейсмана о бессмертии простейших и половых клеток многоклеточных и о приспособительном характере старения и смерти как побочных продуктов реализации генетической программы индивидуального развития.
Биохимические и биофизические исследования начала XX века позволили предполагать, что старение является результатом истощения в организме особого фермента «жизни» (О. Бючли), утраты химических веществ (Дж. Люб), дегидратации тканевых коллоидов (М. Рубнер, В. Ружичка), накопления вредных продуктов обмена (А. Каррель), изнашивания организма (Р. Гертвиг). По мнению ряда эмбриологов, старение обусловлено замедлением роста и ослаблением способности к обновлению клеток вследствие их дифференциации (Ч. Минот, Р. Рюссле, Е. А. Шульц). Нейрофизиологи (И.П. Павлов и его последователи) рассматривали старость как результат функциональных нарушений высшей нервной деятельности (Грмек, 1964).
По мере развития новых методов и углубления знаний о биологической природе человека на смену этим представлениям пришли новые гипотезы и теории: теория оксидативного стресса и свободных радикалов (Н.М.Эммануэль, 1954), митохондриальная теория старения (К.Линнаме, 1989), клеточная теория старения (Хайфлик, Мурхед, 1961), гипотезы нарушения спектра и функций белков, процессов гликозилирования и окисления липидов, теория нейрогуморальной дезрегуляции (В.М.Дильман, 1957), теломеразная теория (А.М.Оловников, 1971). Каждая из этих теорий основана на конкретных фактах и многочисленных наблюдениях, детально рассмотренных в фундаментальной монографии В.Н.Анисимова (2003).
Вместе с тем, эти теории не в состоянии объяснить все многообразие процессов происходящих в стареющем организме.
За последние годы, главным образом в результате решающего прорыва науки в области генетики, понятие «старение» претерпело определенную эволюцию, в результате которой основное внимание в исследовании по геронтологии сегодня уделяется изучению особенностей функции всего генома и отдельных генов на разных стадиях онтогенеза.
Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе
Продукты амплификации разделяли в 6 % ПАА геле, приготовленном на трис-боратном буфере (ЮхТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза, с длиной стекла 22-40см. Состав 10х ТБЕ: 0.89М Трис, 0.89М Борная кислота, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0.
После амплификации непосредственно к аликвотам реакционной смеси (10 мкл) добавляли буфер для нанесения проб (Змкл.) и проводили электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. Буфер, используемый для нанесения проб, состоял из 0,25 % бром-фенола, 0,25 % ксилен-цианола и 15% фикола.
Электрофоретическое разделение проводили при напряжении 80 вольт до тех пор, пока образец не входил в гель, и проходил под действием тока в геле около 1 см от лунок. В дальнейшем напряжение увеличивали до 250 вольт. Заканчивали электрофоретическое разделение фрагментов ДНК при выходе маркера (бромфенола или ксилен-цианола) из геля.
Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл), просматривали и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue (LKB, Великобритания).
Аллели генов NOS3, АСЕ, GSTM1, GSTT1 определяли сразу после проведения гель-электрофореза. Так, гомозигот и гетерозигот по нормальной аллели "+" определяли на электрофореграммах наличием продукта амплификации размером 271 п.о. для GSTM1 и фрагмента 315 п.о. для GSTT1. Отсутствие соответствующих фрагментов указывало на гомозиготность индивидуума по делеции одного из генов. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена CYP1A1. Аллельные варианты генов NOS3 и АСЕ определяли наличием вставки в 27 п.н. (аллель "4" - 370 п.о., аллель 5" - 397 п.о.) или Alu-повтора 287 п.н. (аллель I - 477 п.о., аллель D - 190 п.о.), соответственно.
Ферментативный гидролиз ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя (ООО "СибЭнзим", г. Новосибирск). Продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции: Tthl 1II - для гена AGT (165 п.о. - Т аллель,
фрагменты 139 п.о. и 26 п.о. - С аллель); BstDEI - для гена AGTR1 (165 п.о. - А аллель, фрагменты 103 п.о. и 62 п.о. - С аллель); Hinfl - для гена MTHFR (200 п.о. - С аллель, фрагменты 178 п.о. и 22 п.о. - Т аллель); Mspl - для гена GPIIIa (90 п.о. - А1 аллель, фрагменты 70 п.о. и 20 п.о. -А2 аллель); Bsc4I - для гена PAI-1 (165 п.о. - 4G аллель, фрагменты 139 п.о. и 26 п.о. - 5G аллель); при 37С в течение 3 ч в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл амплификата, 3 мкл воды, 1 мкл 10-кратного буфера (рекомендованного производителем для каждой рестриктазы) и 10 ед. (0,5 мкл) рестриктазы. Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 6 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.
Гибридизацию на микрочипах проводили с использованием флуоресцентно меченных образцов, полученных на второй стадии мультиплексной ПЦР, в 32 мкл смеси следующего состава: 8 мкл формамида ("Serva", Германия), 8 мкл 20х SSPE ("Promega", США) и 16 мкл амплификата (по 4 мкл образца из каждой мультиплексной реакции). Гибридизационную смесь денатурировали при 95С (5 мин), охлаждали на льду (3 мин), наносили на биочип и оставляли на ночь при температуре 37С. Далее чип отмывали в lx SSPE в течение 5 мин при 20С и высушивали.
Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью широкопольного люминесцентного микроскопа, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением Imageware ("Биочип-ИМБ", Россия) (рис. 12). Ошибка оценки частот аллелей исследованных генов вычислялась по {\-р) Л = стандартной формуле " (Животовский, 1991), где р - частота аллели, N - количество всех аллелей. Определение соответствия частот генотипов в популяциях равновесию Харди-Вайнберга проводили методом % по формуле: X2 = (N,N3 - l/4N22)2N/(n,V) (Животовский, 1991), где Nb N2 и N3 - численности генотипов XX, Хх и хх, а N -общий объём выборки, П] и П2 - число аллелей исследуемых генов в выборке.
Определение достоверности различий между сравниваемыми группами или подгруппами по частотам генотипов и аллелей производили с помощью критерия хи-квардрат (% ) по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений с контрольной группой.
В случае наличия достоверных отличий между контролем (или популяционной выборкой) и исследуемой группой, вычисляли коэффициент соотношения шансов (odds ratio - OR). Значение OR, применительно к нашим данным, показывает, во сколько раз вероятность наличия данного генотипа у обследуемой группы превышает вероятность его наличия в контрольной группе. Значение OR рассчитывали по формуле: OR = a/b d/c, где а - число индивидуумов с наличием данного маркера в исследуемой группе; b - число индивидуумов с отсутствием данного маркера в исследуемой группе; с - число индивидуумов с наличием данного маркера в контрольной группе; d - число индивидуумов с отсутствием данного маркера в контрольной группе
Соотношение шансов указано с 95% интервалом. Границы доверительного интервала (coincendence interval - СІ) вычисляли по формулам: ORmin= OR(M-96/V 2) и ORmax= OR(1+1-96/V 2)
При сравнении результатов использовали точный критерий Фишера (Животовский, 1991), пакеты программ "GraphPad InStat" (США) и STATISTICA 5.5 (США).
Корреляционный анализ между генами сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН), генами системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2) и возрастом (для лиц старше 69 лет)
Корреляционный анализ взаимодействий между генами сердечно-сосудистой системы (АСЕ, AGT, AGTR1, NOS33, MTHFR, GPIIIa, РАН) и системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, NAT2)
Корреляционный анализ выявил преимущественные сочетания некоторых генотипов разных генов во всех изученных группах (см. табл. 14 и приложение табл. 24). Для исключения проблемы множественных сравнений мы установили более жесткий уровень значимости: а=0.01.
В реультате мы подтвердили положительную корреляцию только для генов АСЕ и MTHFR, ранее обнаруженную в работе Хавинсона с соавторами (Хавинсон и др., 2002).
Для генов со значимым р уровнем на основании данных корреляционного анализа был проведен ряд дополнительных сравнений. Так, статистически значимые различия (57.1%, 72.6%, соответственно, X =5.52, р=0.019, df=l) были установлены для частот генотипов А1/А1 (GPIIIa) и A/- (AGTR1) между группами новорожденных и лицами среднего возраста. Также установлены достоверные отличия частот генотипов Al/Al (GPIIIa) и 0/0 (GSTMI) для новорожденных и лиц среднего возраста (17.2%, 32.1%, соответственно, х2=6.26, р=0.012, df=l), и для новорожденных и лиц старше 69 лет (17.2%, 28.1%, соответственно, X2=3.89,p=0.049,df4).
Таким образом, проведенный корреляционный анализ позволил не только подтвердить факты, ранее полученные с помощью метода і в наших исследованиях, но и установить ряд новых интересных закономерностей, список которых приводится ниже. 1. Долгожительство у лиц старше 75 лет преимущественно сочетается с D аллелью и D/D генотипом АСЕ гена, ассоциированных с гипертонией и сердечно-сосудистыми заболеваниями (Шварц, 1997; Баранов и др., 2000, 2005; Пузырев, 2003). Следует отметить, что после 75 лет фактором, лимитирующем продолжительность жизни, становиться I аллель гена А СЕ, которая в отличие от D аллели ассоциирована с ожирением и сахарным диабетом 2 типа (Шварц, 1997; Баранов и др., 2000, 2005; Пузырев, 2003). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что носители D аллели не имеющих сердечно-сосудистые заболевания до 75 лет имеют некоторое преимущество перед носителями I аллели после 75 лет;
2. Выявленное отличие частоты генотипа Al/Al {GPIIIa) и A/- (AGTRI) у новорожденных и лиц среднего возраста, по-видимому, указывают на то, что сочетание этих генотипов могут способствовать «повышению выживаемости в детском возрасте», но не оказывает заметного влияния на продолжительность жизни лиц среднего и пожилого возраста.
3. Достоверное увеличение частоты генотипов Al/Al (GPIIIa) 0/0 (GSTM1) у лиц среднего возраста в сравнении с новорожденными (32.1% и 17.2%, соответственно, %2=6.26, р=0.012, df=l) и у лиц старше 69 лет в сравнении с новорожденным (28.1% и 17.2% соответственно, %2=3.89, р=0.049, df=l) позволяет предполагать наличие отбора по «благоприятным» аллелям и генотипам этих генов в раннем и в среднем возрасте.
4. Подтверждена неслучайная корреляция долгожительства и «нулевых» генотипов генов GSTT1 и GSTM1 (Taioli etal, 2001; Хавинсон и др., 2002; Pesch et al, 2004; Christiansen et al, 2006).
Генная сеть заболеваний сердечно-сосудистой системы как системы детоксикации включает значительное число генов. Заболевание может возникать в результате неблагоприятного сочетания многих (нескольких) полиморфных генов, которые, в конечном счете, оказывают неравноценное влияние на суммарный риск заболевания: -при этом вклад генов может быть независимым (аддитивным); -эффект некоторых генов может проявляться только совместно, то есть при наличии определенных аллельных комбинаций
Исходя из этого, для оценки вклада нескольких полиморфных генов необходимы специальные подходы к анализу имеющихся данных. Нами рассмотрены 4 системы: «Давление» (ренин-ангиотензиновая + NOS3 -система регулирующая кровяное давление), «Фибринолиз» (фибринолиз -система играющая роль коагуляции), «Детокс» (детоксикация 1 - система фазы II детоксикации, где нормальные генотипы GSTM1 и GSTT1 генов (+/+ и +/-) считали условно «положительными») и «Детоксо» (детоксикация 2 - где «нулевые» генотипы GSTM1 и GSTT1 генов условно считали «положительными»).
