Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из актуальных проблем молекулярной генетики человека является создание национального банка данных о характере мутационных повреждений определенных генетических детерминант при наиболее распространённых наследственных патологиях
Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) — распространенное аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное в 95% случаев дефицитом фермента 21-гидроксилаза. В Европейской популяции частота встречаемости ВГКН достаточно высока и составляет 1 2,5 000-10000 новорожденных (Fitness J. 1999)
Недостаточность 21-гидроксилазы характеризуется выраженным генетическим и клиническим полиморфизмом Наиболее тяжёлые клинические проявления наблюдаются у детей с сольтеряющей формой (СТФ) заболевания Дети рождаются с выраженными расстройствами обмена веществ, вызванными нарушениями синтеза глкжокоргакошюв и минералкортикоидов в коре надпочечников У девочек, кроме того, имеется нарушение формирования наружных половых органов При отсутствии своевременного и правильного лечения дети погибают на первых неделях жизни от надпочечниковой недостаточности В связи е нерешенностью проблем ранней диагностики недостаточности 21-гидроксилазы большое медицинское и социальное значение имеет профилактика заболевания, ставшая возможной только с появлением молекулярно-генетических методов Необходимость знания молекулярной природы мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы при данном заболевании связана с тем, что биохимический метод диагностики (определение уровня 17-ОН прогестерона) не всегда точно отражает клиническую картину заболевания, и применение его в пренатальной диагностике недостаточности 21-гидроксияазы может привести к ошибочному диагнозу
В настоящее время известно более 100 мутаций в гене CYP21A2, кодирующем белок 21-гидроксилазу Проводившиеся последние годы во всем мире исследования локуса 6р21 3. в котором картирован ген CYP21A2, выявили гетерогенность недостаточности 21-гидроксилазы на молекулярном уровне и определили целый спектр ВГКН-обуславливающих мутаций После открытия неравновесия по сцеплению между ВГКН и HLA-локусом, внутри которого картирован ген СУР2ІА2 появилась возможность использовать HLA-типирование для пренатальной диагностики данного заболевания
Для каждой отдельной популяции существует свой специфический спектр мутаций, знание когорого, а так же знание особенностей полиморфизма генов входящих в HLA-локус, таких как HLA-DQA1 и MICA являются необходимыми для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининтовых программ с целью выявления гетерозиготных носителей мутаций в гене CYP21A2
Цель и задачи исследования.
Разработать алгоритм молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы на основе анализа гена CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQAI и MICA
В соответсгвии с целью исследования были поставлены следующие задачи. 1 Проанализировать частоты мутаций в гене CYP21A2 у больных с
недостаточностью 21-гидроксилазы при различных клинических формах заболевания 2. Проанализировать полиморфизм генов HLA-DQA! и MICA в группах больных с
сольтеряющей, простой вирильной (ПФ) и неклассической формами (НФ) заболевания
Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена CYP2IA2 и аллелями гено» HLA-DQA1 и MICA
Определить значимость полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы
Разработать на основе полученных данных оптимальную схему молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы
Научная новизна работы. В резульгате проведённого исследования впервые определен спектр мутационных повреждений гена CYP21A2 у больных с недостаточностью 21-
4 гидроксилазы Северо-западного региона России Разработан метод идентификации мутации P453S на основе рестрикционного анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Rsal Описан новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -участок гена CYP21A2 и 3' -участок псевдогена CYP21A1P (тип 2) и разработана методика его выявления Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 У больных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы выявлены «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2) Проведен анализ частот аллелей и генотипов по гену MICA у больных с различными формами недостаточности 21-гидроксилазы Определена информативность GCT-повторов гена MICA для молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы Выявлено неравновесие по сцеплению между мутациями в гене CYP21A2 и аллелями гена MICA Выявлены достоверные отличия в распределении генотипов по гену MICA между группой больных с НФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяцйонной выборкой и между группой больных с ПФ и популяцйонной выборкой Впервые проведена оценка информативности семей с высоким риском рождения ребенка с недостаточностью 21-гидроксилазы основанная на комплексном исследовании мутаций в гене CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA Разработан алгоритм молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы
Практическая значимость
В результате исследования спектра мутаций в гене CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA разработана оптимальная схема молекулярного обследования семей, попадающих в группу риска по рождению ребенка с ВГКН Определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика недостаточности 21 -гидроксилазы в 35 семьях, имеющих детей с ВГКН Полученные результаты явились материалом для подготовки методических рекомендаций по пренатальной диагностике ВГКН
Основные положения, выносимые на защиту
Показано что для каждой клинической формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой специфический спектр мутаций в гене CYP21A2
Показано что клиническое проявление недостаточности 21-гидроксилазы зависит от «тяжести» молекулярного дефекта в гене CYP21A2 Так, при «тяжелых» мутациях соответствие фенотипа генотипу равно 94%, при «легких» - 100% и в группах с мутациями «средней тяжести» - 87,5%
Описана новая «химерная» конструкция (тип 2), состоящая из последовательности гена и псевдогена Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 У бочьных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2) выявлены с частотой в 2,5 большей, чем в популяцйонной выборке
Выявлены достоверные отличия в распределении частот аллелей гена HLA-DQA1 между группой больных с СТФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяцйонной выборкой
Выявлены статистически значимые различия между группой больных с СТФ и популяцйонной выборкой по частотам аллелей гена MICA
6. Показано, что-комплексный анализ полиморфизмов в генах ULA-DQA1 и MICA позволяет ловысшъ яифармативность-семей для лренатаяьной диагностики до 98% Апробация работы. Результаты работы представлены на 9-м международном семинаре по клинической генетике (Кипр, 1998), «а Международной конференции по реабилитации детей-ияваяидов с редкими генетическими заболеваниями ''Врачи мира-папиентам" (С -Пб, 1998), на Конференции по прогрессу в профилактике наследственных болезней (Прага, 1999), на Европейском конгрессе .по генетике человека (Вена, 2001), на 4-м Всероссийском конгрессе эндокринологов (С -Пб, 2001), на конференции «Врачи мира пациентам» (С-Пб , 2003), на Европейском конгрессе по генетике человека (Мюнхен, 2004) и (Прага, 2005), на конф «Современное состояние и новые подходы в дородовой профилактике наследственных болезней и врожденных пороков развития» (С -Пб, 2005), на конф «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2006), на конф
«Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы» (МоскваДООб), на конф «Молекулярная медицина и биобезопасность» ( Москва, 2006)
Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней ГУ НИИАГ им Д О Отта
Публикации По материалам диссертации опубликовано 16 работ
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описание результатов и их обсуждения выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 ссылок Диссертация иллюстрирована 20 Таблицами и 15 рисунками
