Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о физиолого-биохимических механизмах функционирования костной ткани (обзор литературы) 9
1.1. Особенности строения костной ткани и применение костно пластических материалов 9
1.2. Взаимодействие органического и неорганического компонентов в процессе формирования костной ткани 15
1.3. Нейроэндокринная регуляция минерального обмена 23
Глава 2. Материалы и методы исследований 34
2.1. Объект исследований и условия постановки эксперимента 34
2.2. Методы исследований 36
Глава 3. Результаты собственных исследований 39
3.1. Технология получения аллогенного гидроксиапатита 39
3.2. Влияние инъекций суспензии гидроксиапатита в сочетании с имплантацией деминерализованного костного матрикса на показатели метаболизма костной ткани, уровень гормонов коры и мозгового слоя надпочечников 50
3.3. Эффект применения комбинированных препаратов, содержащих гидроксиапатит и измельченную кость 67
3.4. Реакция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой, симпатоадреналовой систем и особенности показателей метаболизма костной ткани после имплантации гранулированного гидроксиапатита 79
Глава 4. Обсуждение результатов 89
Выводы 108
Список использованных источников 110
Приложение 127
- Особенности строения костной ткани и применение костно пластических материалов
- Нейроэндокринная регуляция минерального обмена
- Технология получения аллогенного гидроксиапатита
- Эффект применения комбинированных препаратов, содержащих гидроксиапатит и измельченную кость
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время заболевания опорно-двигательной системы являются широко распространенными, а проблема методов их лечения занимает одно из первых мест в медицине.
Известно, что сложные физиолого-биохимические процессы в органах зависят от функционального состояния соединительной ткани, которая, обладая механическими, защитными и пластическими свойствами, в конечном счете поддерживает гомеостаз. Поэтому главными причинами заболеваний опорно-двигательной системы являются нарушения обменных процессов в организме, сопровождающиеся деструкцией специализированного вида соединительной ткани костной ткани. Процессы метаболизма последней обеспечиваются сложными взаимосвязанными механизмами регуляции. Наряду с местными факторами существенное значение в регуляции обмена костной ткани имеют центральные механизмы, выяснение роли которых, в частности, системы "гипоталамус-гипофиз", имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Ключевую роль в постоянном возобновлении органического и минерального компонентов кости играют гормональные и ферментативные системы. В связи с этим актуальной представляется задача по поиску новых способов управления регенерацией костной ткани.
Для восстановления поврежденных участков кости, реконструкции ее анатомической целостности, широко используют разнообразные пластические материалы биологического (Волова Л.Т., 1986; 1988; Брус И.Г. с соавт., 1989) и неорганического (Хамраев Т.К. с соавт., 1994; Панкратов А.С, 1995; Строганова Е.Е. с соавт., 2001; Oda S. е.а., 1997; Yuan Н. е.а., 2001) происхождения. Однако в ряде случаев, когда уменьшение костной массы происходит при различных нарушениях обменных процессов в организме, возникает необходимость в нормализации костного ремоделирования на системном уровне.
За последнее десятилетие в литературе появились экспериментальные данные демонстрирующие остеогенные свойства синтетического кальций-фосфатного соединения - гидроксиапатита (ГАП) - и биосовместимых материалов на его основе (Безруков В.М., Григоръян А.С., 1996; Литвинов С.Д., 1995; Снетков А.И. с соавт., 2001; Zambonin G., Grano М., 1995; Bonucci Е. е.а., 1997; Goto Т. е.а. 2001). В ряде экспериментальных моделей на животных показано, что эктопическое введение ГАП в мышечную ткань влияет на остеоин-дуктивные процессы (Ripamonti U., 1996, 2000; Zong J. е.а., 1997; Gosain А.К. е.а., 2002). Существенным недостатком данных работ является отсутствие системного подхода в изучении реакции организма в ответ на введение композитных биоматериалов, которые существенно отличаются по химическому составу и биологическим свойствам от естественного ГАП костной ткани. Прежде всего, недостаточное внимание уделено изменениям со стороны эндокринной системы и их взаимосвязи с обменом основного белка костной ткани - коллагена -при использовании ГАП. До настоящего времени остается неясным вопрос о регулирующем влиянии гормональных и ферментативных систем на остеогенные процессы, происходящие в костной ткани.
Вышеизложенное свидетельствует о том, что применение новых видов кальций-фосфатных препаратов и изучение их влияния на обменные процессы в настоящее время заслуживает особого внимания.
В ЦНИЛ СамГМУ предложен и запатентован (Волова Л.Т., Подковкин В.Г., 2000), а в представленной работе детально разработан новый способ получения аллогенного ГАП путем выделения его непосредственно из костной ткани. Данный способ может стать звеном замкнутого цикла производства костнопластических материалов, не требующим дорогостоящего оборудования, использующегося при получении синтетических аналогов. Кроме того, предполагается, что аллогенный ГАП обладает большей биосовместимостью по сравнению с искусственными препаратами. Поэтому настоящая работа была направлена на изучение физиологических и биохимических свойств аллогенного ГАП.
Цель исследования. Разработать технологию производства аллогенного ГАП и произвести в эксперименте комплексную оценку реакции организма при эктопическом введении данного препарата в сочетании с деминерализованным костным матриксом.
Основные задачи исследования.
Разработать технологию получения аллогенного ГАП из костной ткани.
Выявить влияние эктопической имплантации аллогенного ГАП на биохимические показатели метаболизма костной ткани, функционального состояния коры и мозгового слоя надпочечников, уровень кальция в крови и перекис-ное окисление липидов в печени, селезенке и мышечной ткани.
Изучить реакцию организма животных на одновременную имплантацию ДКМ и аллогенного ГАП.
Проанализировать реакцию организма животных на имплантацию комбинированных препаратов, содержащих аллогенный ГАП и измельченный костный матрикс.
Научная новизна.
В проведенном исследовании впервые дана комплексная оценка реакции организма животных на эктопическую имплантацию аллогенного ГАП и его смеси с ДКМ на ряд жизненно важных систем. Выявлены изменения биохимических показателей метаболизма костной ткани, свидетельствующие о стимуляции остеогенеза.
Впервые проанализированы изменения гормонального фона, характеризующие состояние САС, ГГНС при внутримышечном введении ГАП и обнаружено слабовыраженное увеличение их функциональной активности.
Впервые изучено модифицирующее влияние ГАП на реакцию организма животных, которым был имплантирован ДКМ, проявившееся в угнетении перекисного окисления липидов в селезенке, печени и мышцах.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенной работы дополняют современные представления о реакции организма на костно-пластические материалы неорганической природы.
Установлено, что реакция организма на эктопическую имплантацию ГАП и его смесь с измельченным ДКМ носит комплексный характер и включает физиологические изменения ряда систем: метаболизма костной ткани, функционального состояния С АС, ГГНС, перекисного окисления липидов.
Выявлены особенности реакции ГГНС и САС на имплантацию аллоген-ного ГАП, а также изменения в обмене коллагена костной ткани после имплантации ГАП в зависимости от его типа и способа введения. Полученные данные дают дополнительное теоретическое обоснование для применения биопластических материалов при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Разработана технология получения ГАП из костной ткани, близкого по составу к минеральному компоненту кости. На его основе созданы новые костно-пластические материалы, которые в настоящее время применяются в практическом здравоохранении. Дано экспериментальное обоснование их эффективности. Установлено, что эктопическая имплантация этих материалов не вызывает отрицательных сдвигов в состоянии исследованных показателей метаболизма костной ткани, перекисного окисления липидов, периферических органов иммуногенеза, САС и ГГНС.
Основные положения, выносимые на защиту.
Эктопическая имплантация аллогенного ГАП вызывает изменения биохимических показателей метаболизма костной ткани, свидетельствующие об активизации остеогенеза. Эти изменения не выходят за пределы физиологической нормы и не приводят к нарушению гомеостаза кальция.
Гормональные показатели ГГНС и САС в ответ на имплантацию ГАП свидетельствуют о физиологической реакции организма животных, не носящей характер стрессовой.
Введение ГАП модифицирует системную реакцию организма при имплантации ДКМ, что проявляется в уменьшении выраженности изменений биохимических показателей свободнорадикального окисления в селезенке, печени и мышцах.
Морфологические исследования периферических органов иммуногенеза при имплантации смеси ГАП и измельченной деминерализованной кости не обнаруживают наличия у имплантатов иммуногенных свойств.
Апробация работы. Апробация работы проведена на кафедрах биохимии и физиологии Самарского государственного университета. Материалы диссертации доложены на международном симпозиуме по проблемам тканевых банков "Биоимплантология на пороге XXI века " (Москва, 2001); на 68-й итоговой научной сессии Курского государственного медицинского университета (Курск, 2002); на итоговых научных конференциях Самарского государственного университета и Самарского военно-медицинского института (Самара, 2002, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, получено положительное решение на выдачу патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, результатов собственных исследований, анализа и обсуждения полученных данных, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа содержит 32 рисунка и 13 таблиц. Список литературы включает 176 источников, в том числе 105 зарубежных.
Особенности строения костной ткани и применение костно пластических материалов
Большая часть процессов, связанных с функционированием различных систем организма, напрямую зависят от метаболических процессов, происходящих в соединительной ткани на молекулярном, клеточном, тканевом уровнях. Более половины от массы тела млекопитающих приходится именно на соединительную ткань, которая подобно любой ткани, наряду с межклеточным веществом содержит клетки. Отличительной особенностью расположения клеток соединительной ткани, главными из которых являются фибробласты, является отсутствие связи с базальными мембранами.
Важнейшим компонентом соединительной ткани является коллаген. Он входит в структуру кожи, костей, сухожилий, кровеносных сосудов, хрящей, зубов. Его главная функция - образование нерастворимых фибрилл высокой прочности (Попов Е.М., 1992). Коллаген является наиболее распространенным белком многоклеточных. Так, у млекопитающих он составляет по массе Ул суммарного белка.
Одним из видов соединительной ткани является костная ткань, представляющая собой сложный комплекс органических и неорганических веществ, находящихся в тесных функциональных взаимоотношениях. Костная ткань обладает активным метаболизмом и участвует в минеральном гомеостазе. Кости скелета состоят из двух компонентов костной ткани: кортикальной (компактной), составляющей 75 % веса скелета, и трабекулярной (губчатой), которая состоит из сети трабекул внутри кости. Последняя ткани принимает активное участие в обменных процессах и более чувствительна к метаболическим расстройствам по сравнению с компактной. Хотя трабекулярная костная ткань со 10
ставляет 25 % веса скелета, она дает 75 % поверхности костной ткани, включающейся в ремоделирование костей. Органический матрикс костной ткани, продуцируемый остеобластами, состоит из коллагена (более 95 % объема) и значительно меньшего количества неколлагеновых белков, мукопротеинов и сиалопротеинов (Торбенко В.П., Касавина Б.С, 1977). Основными минеральными компонентами кости являются кристаллический ГАП, имеющий эмпирическую формулу Саю(Р04)б(ОН)2, и аморфный фосфат кальция Саз(Р04)г (Ньюмен У., Ньюмен М., 1961).
ГАП - нерастворимый микрокристаллический минерал, первоначально откладывающийся в органическом матриксе в виде фосфата кальция и позднее трансформирующийся в кристаллы апатита. Кристаллы ориентированы параллельно волокнам коллагена и выглядят как короткие призматические стержни (Савельев В.И., Родюкова Е.Н., 1992) или имеют вид игольчатых или пластинчатых частиц длиной 200-500 А и толщиной 15-50 А (Подрушняк Е.П., Суслов Е.И., 1975), размещенных в матрице коллагеновых волокон и протеогликанов.
При лечении повреждений костной ткани в клинике дефекты в основном замещаются препаратами на основе естественной кости, так как искусственные костные материалы плохо приживаются. Тем не менее, естественная кость тоже имеет недостатки, связанные с нарушением ее обмена и риском инфицирования пациента. В связи с этим многими исследователями предпринимаются попытки создать искусственную костную ткань, которая по своим физико-химическим, а главное биологическим свойствам не уступала бы естественной. Однако в этом случае практически невозможно создать сложную, многокомпонентную систему со специфическими связями и обменом. Еще труднее предсказать взаимодействие синтезированной in vitro "кости" с окружающими тканями организма после трансплантации. S. Itoh е.а. (2001) синтезирован композитный материал на основе ГАП и коллагена путем одновременного титрования Са(ОН)2, Н3РО4 и коллагена. Полученное вещество имеет собственную структуру, сходную с костной, обусловленную химическим взаимодействием между ГАП и молекулами белка. Вещество проявляет те же биохимические свойства, что и пересаженная кость: ре-зорбируется путем фагоцитоза остеокласт-подобными клетками и стимулирует остеобласты к формированию новой кости в прилегающем пространстве. Таким образом, авторы пришли к заключению, что полученный на основе ГАП и коллагена композитный материал может применяться для восстановления костных повреждений.
При имплантации композитного материала на основе титана, ГАП и адсорбированного на нем морфогенетического белка в четырехглавую мышцу крыс путем гистологических исследований с применением электронной микроскопии выявлена эндохондральная оссификация. Эксперимент показал, что белок сохраняет биологическую активность после адсорбции на неорганическом матриксе и может быть использован для увеличения скорости процессов косте-образования (Cole B.J. е.а., 1997).
Новые данные свидетельствуют о существовании сложных взаимоотношений между органическими и неорганическими частями кости. Кроме того, в костях находят другие ионы: карбонаты, магний, натрий, калий, фтор, которые имеют значение для формирования структуры и активно участвуют в метаболизме. Минеральные вещества накапливаются как в кортикальной компактной, так и в трабекулярной части костей и имеют решающее значение в устойчивости к механическому воздействию на кость.
В исследованиях S. Oda е.а. (1997) установлено, что ГАП с адсорбированным на нем морфогенетическим белком вызывает образование костных структур при эктопической подкожной имплантации. В этом случае ГАП играет роль носителя белка. Аналогичную функцию может выполнять и ДКМ, о чем свидетельствует работа Н. Iwata е.а. (2002).
При подкожной имплантации крысам ГАП с адсорбированным рекомби-нантным морфогенетическим белком происходит формирование костных элементов на внутренней поверхности пор ГАП. В этом случае повышается активность ЩФ и уровень остеокальцина в имплантатах. Выявлена зависимость индуцированного костеобразования от геометрии пор ГАЛ, которая является фактором васкуляризации (Jin Q.M. е.а., 2000).
Известно, что мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга имеют потенциальные возможности для образования и развития различных видов соединительной ткани. D.P. Lennon с сотр. (2000) установил, что такие клетки, будучи "загруженными" вместе с фибробластами в пористую ГАП-содержащую керамику, при подкожной имплантации проявляют положительную реакцию на ЩФ и кальций. В исследованиях Н. Ohgushi е.а. (1989) и Т. Yoshikawa е.а. (1997) показана стимулирующая роль клеток костного мозга в процессах остеогенеза на поверхности пористой фосфатной керамики при эктопической имплантации.
В работах U. Ripamonti (1996, 2000) изучены возможности эктопического костеобразования у некоторых видов животных при имплантации ГАП в прямую мышцу живота. Через 90 дней после операции животные умерщвлялись, имплантаты выделялись из мышечной ткани и подвергались гистологическим и гистоморфометрическим исследованиям. Минимальное костеобразование наблюдалось в имплантатах кроликов и собак, более значительное - в образцах, извлеченных из мышц обезьян вицаРаріо ursinus.
Предполагается, что пористый ГАП может играть роль своего рода растворимой матрицы для адсорбции, хранения и контроля над выделением циркулирующих или локально синтезированных костных морфогенетических белков, инициирующих местное костеобразование.
Нейроэндокринная регуляция минерального обмена
Одной из функций костной ткани является участие в поддержании фос-форно-кальциевого гомеостаза организма. Поэтому минеральный обмен организма напрямую зависит от состояния многих тонко сбалансированных факторов, среди которых ведущее значение принадлежит центральным и периферическим механизмам нервной регуляции, а также гормонам. В условиях, когда поддержание кальциевого гомеостаза является задачей многих органов и систем организма, быстрая и эффективная реакция на эндо- и экзогенные изменения в содержании кальция может протекать только при наличии их скоординированной деятельности. Это особенно важно для обеспечения той высокой эффективности регуляции кальциевого обмена, которая свойственна высшим животным.
Ведущую роль в регуляции обмена кальция и фосфора осуществляют па-ращитовидные железы, выделяющие ПТГ, и щитовидная железа, в парафолли-кулярных клетках которой синтезируется кальцитонин. Заметную роль играет также кальцитриол, синтезируемый в почках.
В хронических опытах на собаках и кроликах показано существование связи между кальцийрегулируюшей функцией паращитовидных желез и корой головного мозга (Каплан П. М., 1961). Раздражая двигательную зону коры одного из полушарий головного мозга и определяя концентрацию кальция в ушных сосудах, автор получил следующие результаты. После нанесения длительного одностороннего коркового раздражения концентрация кальция в крови симметричных ушных сосудов уменьшалась на 0,8 — 2,0 мг% по сравнению с концентрацией кальция в противоположной стороне головы. Если у животного удаляли паращитовидные железы со стороны нанесения коркового раздражения, его концентрация в крови увеличивалась на 0,2 — 0,8 мг%. Изменения концентрации кальция при раздражении двигательных зон коры одного из полушарий головного мозга на фоне предварительно вызванной гиперкальциемии были более значительными.
В связи с анализом центральной регуляции кальциевого обмена интерес представляет гипоталамо-гипофизарная система. Гипоталамус относится к структурам мозга, в которых находятся важнейшие центры регуляции эндокринных желез, интеграции вегетативных функций и соматических реакций организма. Гипоталамическая область включает ядерные образования, осуществляющие через гипофиз регуляцию эндокринных желез и обмен веществ.
Если принять во внимание общеизвестный факт, что гипофизарные гормоны оказывают влияние практически на все эндокринные железы, то можно предположить участие гипоталамо-гипофизарной системы в кальциевом обмене. Возможны различные пути воздействия на метаболизм кальция: это прямое влияние нейросекреторных гормонов на тканевые и клеточные структуры, способные к накоплению и отдаче кальция; опосредованное воздействие через другие эндокринные железы, и в первую очередь - через паращитовидные и щитовидные железы. Хотя в литературе отсутствуют прямые указания о наличии функциональной связи между парафолликулярными клетками щитовидной железы, вырабатывающими кальцитонин, и состоянием системы гипоталамус-гипофиз, отдельные данные все же подтверждают существование взаимосвязи в деятельности указанных железистых образований. У гипофизэктомированных животных содержание кальцитонина в парафолликулярных клетках резко падает, а введение в общий кровоток кальция не стимулирует инкреторной деятельности этих клеток (Care A.D. е.а., 1968). Введение крысам или другим животным неочищенного гипофизарного экстракта вызывает быстрое понижение концентрации кальция в крови, что дает основание предполагать образование тканью гипофиза вещества, стимулирующего выделение парафолликулярными клетками гипокальциемического гормона (Zileli е а., 1968). Функциональная связь паращитовидных желез с гипоталамической областью выявляется в опытах при экспериментальном ее разрушении, в результате чего в железистом аппарате паратиреоидной железы обнаруживаются повышенная вакуолизация, внутриклеточные липоидные включения и другие деструктивные изменения. Одновременно с этим в костях скелета развиваются изменения, характерные для остеопороза или начальных этапов рахита (Кахана М.С., 1961). Имеются и другие данные, свидетельствующие о влиянии гипоталамуса на обмен кальция в организме животных и человека. Ю. Н. Бордюшкова с соавт. (1962) установили, что электрическое раздражение гипоталамической области у крыс с помощью вживленных электродов повышает концентрацию кальция в крови. Если до нанесения раздражения содержание кальция в плазме крови колебалось в пределах 7,4 - 12,4 мг%, то после нанесения раздражения оно повышалось до 10,0 - 15,2 мг%. Смещение электродов в область ядер таламуса или ствола мозга вызывало такой же эффект, как и гипоталамические раздражения. На основании этих наблюдений высказано предположение об участии указанных зон мозга в механизме центральной регуляции кальциевого обмена. В опытах на крысах (Романенко В.Д., 1967) установлено, что под влиянием симпатикотропных веществ (адреналин, норадреналин) увеличивается содержание кальция в крови, ткани печени и желчи. Аналогичный эффект на других пищеварительных железах получен при раздражении симпатических волокон электрическим током. Блокада передачи нервных импульсов через нервные ганглии приводит к существенным изменениям обмена кальция в печени. При этом его выделение с желчью резко уменьшается или полностью прекращается (Бельченко Д.И., 1962). В последнее время появляются данные о способности различных структур головного мозга (гиппокампа, таламуса, обонятельных луковиц, мозжечка) вырабатывать фермент, подавляющий активность ПТГ. Авторы полагают, что данный фактор оказывает регулирующее влияние на кальциевый гомеостаз центральной нервной системы (Tonomura А. е.а., 2002). На основании изложенного выше можно заключить, что регуляция кальциевого гомеостаза - одна из наиболее сложных интегративных реакций организма человека и высших животных, в осуществлении которой ведущая роль принадлежит нервной системе и железам внутренней секреции. Важнейшим регулятором кальциевого гомеостаза и костного метаболизма является ПТГ. Он вырабатывается главными клетками околощитовидных (па-ратиреоидных) желез. Это полипептид, состоящий из 84 аминокислот (Potts J.Т. е.а., 1982). Органами-мишенями для него являются кости, кишечник и печень. Основное действие - поддержание гомеостаза кальция; главный стимулятор секреции - снижение уровня ионизированного кальция в крови. Взаимодействие между паращитовидными железами и кальцием крови относится к саморегулирующейся системе, действующей по принципу обратной связи (Potts J.Т. е.а., 1982; Care A.D., 1989). Основанием этого утверждения может служить следующий опыт. Перфузия концентрированным раствором глюконата кальция передней камеры глаза, в которую предварительно трансплантировали паращитовидную железу, вызывала снижение уровня кальция в крови крыс, а при замене перфузата раствором, содержащим незначительное количество кальция, содержание данного элемента в крови повышалась (Dale D.C. е.а., 1965). Кроме того, продукцию ПТГ стимулируют снижение содержания магния в сыворотке крови, гистамин, кортизол, дофамин, секретин.
Технология получения аллогенного гидроксиапатита
При выполнении первой серии экспериментов нами была поставлена задача проанализировать в динамике возможные изменения неироэндокриннои реакции организма и интенсивность метаболизма костной ткани крыс после внутримышечных инъекций суспензий аллогенного ГАП двух видов (нейтральный и щелочной) при одновременной либо раздельной имплантации аллогенного ДКМ. В соответствии с этим оценивали влияние введения суспензий ГАП на состояние ГГНС и САС, определяя уровни 11-ОКС в надпочечниках и плазме крови, адреналина - в надпочечниках. Для получения более четкого представления о метаболизме 11-ОКС было исследовано содержание данных гормонов в печени. Оценку функционального состояния костной ткани проводили, определяя в плазме крови свободный и белковосвязанный оксипролин, в сыворотке - активность ЩФ, концентрацию неорганического фосфата и Са . Также определяли интенсивность процессов перекисного окисления липидов в различных органах по содержанию малонового диальдегида, диеновых кетонов и коньюгатов.
Для осуществления поставленной задачи мы одновременно имплантировали ДКМ и однократно делали внутримышечные инъекции суспензий ГАП, полученного при значениях рН 12 (1 группа) и рН 7 (2 группа) из деминерали-затов компактной костной ткани крыс. Животным третьей опытной группы делали только инъекции щелочного ГАП (рН 12). Наконец, чтобы выявить, какое влияние оказывает внутримышечное введение ДКМ на исследуемые стороны метаболизма костной ткани и реактивность регулирующих систем гомеостаза, мы осуществляли имплантацию только костного матрикса в 4 группе. Определение биохимических показателей проводили через месяц и два месяца после операций. Реакция организма на инъекции ГАП и имплантацию ДКМ характеризовалась различными по интенсивности изменениями состояния ГГНС, САС, а также метаболизма костной ткани. Причем эти изменения находились в зависимости от сроков проведения опытов. Так, нами отмечены характерные закономерности в обмене коллагена, маркером которого является оксипролин. Следует отметить общую тенденцию в повышении содержания белковосвязанной формы аминокислоты и уменьшение количества свободного оксипролина в плазме крови животных через два месяца. Это подтверждается следующими данными. Как видно на рис. 3, концентрация белковосвязанного оксипролина через месяц в плазме крови незначительно повышалась на 2-10%, оставаясь на уровне контрольного значения во всех экспериментальных группах. Весьма несущественными оказались колебания концентрации свободной аминокислоты (рис. 4). Достоверное снижение показателя в плазме на 30% наблюдалось через месяц в единственной группе крыс, подвергавшихся комбинированному воздействию (имплантация ДКМ и инъекции ГАП рН 12), что говорит о замедлении процессов деструкции органического матрикса кости. В целом, подобный вид операций не оказывает значительного влияния на обмен коллагена через месяц.
По прошествии двух месяцев нами обнаружено достоверное повышение на 13% уровня связанного с белком оксипролина в плазме крыс с имплантированным ДКМ, а также у животных, которым на фоне введения ДКМ делалась однократная инъекция ГАП рН 7. Функциональное состояние костной ткани характеризовалось в этот период снижением катаболических процессов, что проявлялось в уменьшении в 1,4 - 1,8 раза содержания свободного оксипролина в плазме всех крыс. Следует подчеркнуть, что инъекции щелочного ГАП инги-бировали процессы биодеградации коллагена.
Таким образом, инъекции аллогенного ГАЛ и имплантация ДКМ в мышцы способствовали снижению уровня катаболизма основного белка костной ткани. Вероятно, данный факт связан с изменением активности тканевой колла-геназы, которая осуществляет специфическую фрагментацию молекул коллагена, после чего распад пептидных фрагментов до свободных аминокислот может осуществляться другими пептидгидролазами.
Изменение реактивности костной ткани характеризовалось также выраженными колебаниями активности ЩФ в сыворотке крови. Активность фермента является важным фактором минерализации костной ткани, поскольку именно этот фермент отщепляет фосфат от органических субстратов (в первую очередь от глицерофосфата), после чего неорганический фосфат может встраиваться в кристаллическую решетку ГАП, либо образовывать более растворимый аморфный фосфат кальция.
Через месяц после операций наблюдались выраженные изменения активности ЩФ в сыворотке крови (рис. 5). Достоверное повышение показателя происходило только в первой экспериментальной группе животных, которым имплантировали ДКМ и делали инъекции ГАП (рН 12). В трех других группах происходило значительное снижение (на 32%-80%) активности фермента, причем минимальные значения зафиксированы в сыворотке крови крыс, которым делали только инъекции ГАП. Через два месяца активность ЩФ, напротив, существенно возрастала во всех группах на 46%-108% по сравнению с контрольным значением.
Наименьшие изменения касались группы крыс с имплантированным ДКМ, в которой наблюдалась общая тенденция снижения активности ЩФ через месяц после операций и повышение спустя два месяца, но эти изменения не явились статистически значимыми.
Эффект применения комбинированных препаратов, содержащих гидроксиапатит и измельченную кость
На следующем этапе работы мы использовали в качестве имплантатов ДКМ, а также комбинированные образцы, включающие аллогенный нейтральный ГАП и измельченный лиофилизированный костный матрикс в соотношении 1:1 и 2:1 по массе.
Эксперименты проводили по следующей схеме. Животным первой опытной группы в обе бедренные мышцы вводили гранулированные имплантаты, содержащие ГАП и измельченную кость в соотношении 1:1. Крысам второй группы - ДКМ и комбинированные имплантаты, содержащие ГАП и измельченную кость в соотношении 2:1.Определение исследуемых показателей проводили через два месяца после операций.
Реакция организма на внутримышечную имплантацию комбинированных гранулированных образцов (ГАП + измельченная кость 1:1) носила комплексный характер и включала изменения показателей метаболизма костной ткани, физиологического состояния ряда систем (рис. 13). В первую очередь необходимо отметить выраженную ответную реакцию костной ткани. В наших экспериментах отмечено изменение метаболизма коллагена. Происходило увеличение в 1,5 раза уровня белковосвязанного оксипролина в плазме крови. Данный показатель, как известно, характеризует интенсивность процессов регенерации соединительной ткани. Одновременно зафиксировано снижение концентрации свободного оксипролина в 1,7 раза по сравнению с контролем. Полученные результаты свидетельствуют о стимуляции биосинтеза коллагена над процессами его био деградации.
Об изменении реактивности костной ткани свидетельствует также трехкратное увеличение активности ЩФ, что сопровождалось значительным повышением уровня неорганического фосфата в сыворотке крови. Одновременное возрастание данных показателей на фоне указанного выше увеличения содержания белковосвязанного оксипролина свидетельствует об активизации ростовых процессов костной ткани, сопровождающихся усилением синтеза коллагена, образованием органической матрицы и ее дальнейшей минерализацией.
Наряду с изменением реактивности костной ткани необходимо отметить выраженную ответную реакцию ГГНС на введение имплантатов, что свидетельствует о системной реакции организма. В наших исследованиях отмечено возрастание содержания 11-ОКС в надпочечниках в 2,4 раза, а в плазме - в 3,4 раза. Известные биохимические и физиологические эффекты глюкокортикои-дов в данных условиях могут увеличить обеспечение регенерирующих тканей пластическим и энергетическим материалом.
На основании вышеизложенного можно заключить, что введение измельченного костного матрикса в состав имплантатов изменяло их физико-химические и биологические свойства, что проявилось в стимулирующем биосинтез коллагена влиянии.
При исследовании метаболизма животных второй группы, которым внутримышечно имплантировали как комбинированные образцы, содержащие ГАП и измельченную кость в соотношении 2:1, так и ДКМ, нами выявлена аналогичная тенденция в изменениях показателей, хотя и в меньшей степени по сравнению с результатами в первой группе (табл. 6 прилож.). Так, если в плазме крыс первой группы уровень белковосвязанного оксипролина повышался до 380,2±8,0 мкмоль/л, то у животных второй группы показатель также достоверно увеличивался до значения 291,6±11,9 мкмоль/л при контроле 251,3+5,9 мкмоль/л. Менее выраженным было снижение концентрации свободного оксипролина до 15,18±0,37 мкмоль/л при контрольном значении 18,79±1,37 мкмоль/л, в то время как двухмесячная имплантация комбинированных ораз-цов, содержащих ГАП и измельченную кость в соотношении 1:1 вызывала более значительное снижение показателя до 11,02+0,77 мкмоль/л. Как видно из данных рис. 14, активность ЩФ в сыворотке первой и второй опытных групп увеличивалась до 11,46±1,00 мкмоль/чл и 7,55+0,90 мкмоль/чл соответственно. Сходная тенденция отмечена при определении концентрации неорганического фосфата в сыворотке. Процентные изменения показателей продемонстрированы на рис. 14.
Содержание 11-ОКС в плазме животных второй группы увеличивалось до 7,55+1,22 мкмоль/л против 14,40±2,04 мкмоль/л в первой. В надпочечниках данный показатель во второй группе нарастал до 218,6±23,7 мкг/г, а в первой более значительно - до 353,7+34,0 мкг/г. Контрольные значения при этом составили 4,25±0,82 мкмоль/л и 149,1±8,1 мкг/г соответственно для концентрации 11-ОКС в плазме и надпочечниках. В печени уровень стероидов, напротив, достоверно понижался до 6,50+0,65 мкг/г при контроле 8,99+0,87 мкг/г. Помимо этого у крыс второй группы отмечено достоверное повышение содержания ад-реналина в надпочечниках. Что касается содержания Са в сыворотке, малонового диальдегида в печени и мышцах, то данные показатели оставались на уровне контрольных значений.
