Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Ацетилхолинэстераза, ее функции и строение 11
2. Бутирилхолинэстераза и ее функции 33
3. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы 27
Материалы и методы 47
Результаты и обсуждение 60
1. Определение первичной нуклеотидной последовательности и интронно-экзонной структуры гена ache Rattus norvegicus 60
2. Различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache органов и тканей Rattus norvegicus 65
3. Влияние гликозилирования ацетилхолинэстеразы на обеспечение чувствительности к производным 6-метилурацила 73
Заключение 88
Выводы 93
Список литературы
- Бутирилхолинэстераза и ее функции
- Ингибиторы ацетилхолинэстеразы
- Различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache органов и тканей Rattus norvegicus
- Влияние гликозилирования ацетилхолинэстеразы на обеспечение чувствительности к производным 6-метилурацила
Введение к работе
Актуальность. Ацетилхолинэстераза (ацетилхолин-ацетилгидролаза, АХЭ, К.Ф. 3,1,1,7) - фермент семейства сериновых гидролаз, играющий ключевую роль при передаче возбуждения в центральной и периферической нервной системе. Известно, что АХЭ играет важную роль в патогенезе таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, черепно-мозговые травмы, сосудисто-мозговые патологии, миастения Гравис и т.д (Jeffrey & Cummings, 2000; Jones et al, 2011; Shakil et al, 2011). Эти заболевания сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, нарушением коммуникаций в нейронных сетях и контролируемых ими функций. Известно, что одним из основных принятых методов терапии является применение антихолинэстеразных (анти-ХЭ) препаратов. В настоящее время имеется большой выбор препаратов с анти-ХЭ действием. Однако, большинство из них характеризуются недостатками, наиболее важным из которых является неселективность действия применяемых препаратов по отношению к подвергающимся действию (препарата) органов, в том числе - не требующих коррекции. Неселективность действия известных препаратов приводит к развитию широкого спектра тяжелых побочных явлений и является причиной частых патологических или смертельных исходов (Сосюкин и др., 2005; Lester et al, 2010).
Особую актуальность и значимость приобретает поиск и определение механизма действия новых высокоселективных, тканеспецифичных ингибиторов АХЭ. В лаборатории химико-биологических исследований Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (ИОФХ) были синтезированы производные урацила, классифицированные как новый класс необратимых и высокоселективных ингибиторов АХЭ (Резник и др., 1998; Аникиенко и др., 2001). К этому классу соединений относится и исследуемый нами ингибитор С-547 (далее по тексту С-547), проявляющий избирательность действия по отношению к АХЭ разных органов и тканей (Аникиенко и др., 2001; Petrov et al., 2006, 2009). Однако в литературе отсутствуют данные о механизмах действия С-547, приводящих к избирательному ингибированию АХЭ, что необходимо для оптимизации процессов синтеза новых высокоселективных анти-АХЭ препаратов на основе 6-метилурацила.
На основании вышеизложенного, целью настоящей работы явилось выявление основных факторов, определяющих избирательное влияние ингибитора С-547 на активность ацетилхолинэстеразы в разных тканях и органах Rattus norvegicus.
В соответствии с поставленной целью требовалось решение следующих задач:
1. Определить нуклеотидную последовательность 5' и 3' участков гена
ацетилхолинэстеразы (ache) R. norvegicus и построить модель его интронно-
экзонной структуры;
2. Выявить различия в экспрессии мРНК изоформ гена
ацетилхолинэстеразы (ache) в органах и тканях R. norvegicus;
3. Установить различия в экспрессии мРНК гена бутирилхолинэстеразы
(bche) в органах и тканях R. norvegicus;
4. Провести сравнительную оценку влияния ингибитора С-547 на
активность различных форм ацетилхолинэстеразы, отличающихся по степени
гликозилирования и наличию якорных субъединиц (коллаген Q и богатый
пролином мембраносвязанный белок - PRiMA).
Научная новизна. Впервые определена нуклеотидная
последовательность 5' и 3' недостающих участков гена ache R. norvegicus и на ее основе построена интронно-экзонная структура гена. Данные депонированы в международную базу данных GeneBank (GQ338831 и GQ338832). Впервые разработаны праймеры для ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan, позволяющие оценить уровень экспрессии мРНК изоформ гена ache в разных органах и тканях организма. Впервые разработаны вектора экспрессии для гена ache R. norvegicus, содержащие нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования.
Научно-практическая значимость работы. Данные об интрон-экзонной структуре гена ache R. norvegicus имеют важное теоретическое и практическое значение, позволяют провести сравнительный анализ в строении гена ache разных видов животных, исследовать процессы альтернативного сплайсинга, выяснить взаимосвязи между регуляторными последовательностями гена и различными внешними и внутренними факторами, их влияние на избирательную экспрессию гена ache в разных органах и тканях. Практическая значимость заключается в разработке специфических праймеров и гибридизационных зондов для оценки экспрессии изоформ АХЭ, амплификации фрагментов гена, создании плазмидных и вирусных векторов, несущих ген ache. Полученные нами данные об уровне экспрессии мРНК АХЭ органов и тканей R. norvegicus расширяют представление о разнообразии изоформ фермента в синапсах, что необходимо при разработке и установлении механизмов действия новых лекарственных препаратов-ингибиторов АХЭ. Данные об уровне экспрессии мРНК гена bche необходимы при исследовании ее компенсаторной роли в различных органах и тканях и роли при различных патологических процессах. Созданные генетические конструкции для
экспрессии гена ache, содержащего нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования в различных комбинациях, позволяют оценить влияние гликанов на биологическую активность АХЭ, транспорт к клеточной мембране, стабилизацию функциональной конформации, на функционирование головного мозга в норме и патологии (например, при болезни Альцгеймера), а также в исследовании других заболеваний, в патогенезе которых принимает участие АХЭ. Результаты исследований будут полезны для практического применения при разработке новых лекарственных препаратов селективного действия, свободных от недостатков ныне применяемых препаратов. Положения, выносимые на защиту:
1. Структура гена ацетилхолинэстеразы (ache) Rattus norvegicus
гомологична структуре гена ацетилхолинэстеразы (ache) Mus musculus;
2. Уровень экспрессии мРНК гена бутирилхолинэстеразы (bche) в
поперечно-полосатой мускулатуре задних конечностей Rattus norvegicus ниже,
чем в тканях сердца, головного мозга и диафрагмы;
3. Различная степень гликозилирования ацетилхолинэстеразы и
образование гетероолигомеров в комплексе с якорными белками (коллаген Q и
богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA) не влияет на степень
ингибирования АХЭ производным 6-метилурацила (С-547).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена при поддержке грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (07-04-12097 офи-м), Правительства Республики Татарстан по подготовке и переподготовке кадров в зарубежных научных центрах и «Пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан» в номинации Молодежный инновационный проект «МИП» (Государственный контракт № р/14180). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008, 2009); конкурсе «50 лучших инновационных идей для Республики Татарстан» (Казань, 2010); конкурсе «У.М.Н.И.К»-2010; научной конференции, посвященной 35-летию кафедры генетики КФУ «Современные проблемы генетики» (Казань, 2011); ежегодных научных отчетных конференциях сотрудников КФУ (Казань, 2010, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных и зарубежных
рецензируемых журналах: Ученые записки Казанского университета, секция естественные науки и British Journal of Pharmacology.
Место выполнения работы Казанский (Приволжский) федеральный университет.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 11 таблиц. Библиография содержит 190 наименований, в том числе 177 - зарубежных.
Бутирилхолинэстераза и ее функции
Основной структурно-функциональной единицей организации нервной системы является нейрон. Взаимодействия между нейронами осуществляются посредством синапсов, обеспечивающих передачу сигнала при помощи химических и электрических импульсов (Lester et al., 2011). В синаптическои передаче задействованы специальные механизмы. Так, для ее выполнения в химических синапсах используется нейромедиаторы (у-аминомасляная кислота, глицин, глутаминовая кислота, адреналин, норадреналин, дофамин, ацетилхолин и т.д.). Химические синапсы обеспечивают сложное взаимодействие клеток, а также связаны с рядом патологических процессов и изменяют свои свойства под воздействием ряда химических веществ. Химическая передача нервного импульса в холинергическом синапсе происходит в 4 этапа: первые два этапа - синтез нейромедиатора и его освобождение из нервного окончания -пресинаптические, вторые два этапа - взаимодействие с постсинаптическими рецепторами и освобождение синапса от медиатора - постсинаптические (Monte-Millan et al., 2006; Martinez-Репа et al., 2011; Lester et al., 2011). Нейромедиатор ацетилхолин (AX) представляет собой сложный эфир холина и уксусной кислоты, который легко поддается гидролизу ферментом ацетилхолинэстеразой (АХЭ) в водных растворах. Биосинтез АХ осуществляется в теле нервной клетки с помощью ацетил-КоА и холинацетилтрансферазы (Ordentlich et al., 1992; Grutter & Changeux 2001; Yao et al., 2011). Синтезированный AX накапливается в везикулах, где вступает в связь со специфическим белком - везикулином (Ordentlich et al., 1992; Grutter & Changeux 2001; Monte-Millan et al., 2006). Выход AX из везикул, так же как и его накопление, происходит квантами. Когда нервный импульс доходит до нервного окончания и деполяризует мембрану, везикулы вступают в контакт с пресинаптической мембраной, и ацетилхолин путем экзоцитоза поступает в синаптическое пространство. Освобождение АХ из синаптических везикул возрастает при возбуждении, таким образом, в период протекания нервного импульса выделяется от 100 до 300 квантов АХ. Достигнув постсинаптической мембраны, АХ вступает во взаимодействие с холинорецепторами (ХР) в результате чего в постсинаптической мембране открываются ионные каналы и проходящие через них токи изменяют мембранный потенциал постсинаптической мембраны, что приводит к деполяризации и возникновению потенциала действия. Действие АХ в синаптической щели лимитировано действием АХЭ, которая разрушает его до холина и уксусной кислоты, тем самым предотвращая гиперполяризацию постсинаптической мембраны. Значение данного фермента для синаптической передачи хорошо заметно при воздействии ингибиторами АХЭ. Так, при воздействии эзерином, потенциал концевой пластинки нарастает дольше, чем в норме, достигая более высокого уровня, поскольку АХ взаимодействует с рецепторами необычно долго и в повышенной концентрации. При взаимодействии медиатора с АХЭ, катионная часть АХ в результате электростатического притяжения соединяется с анионным участком каталитического фермента, что приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, который далее расщепляется на ацетилированный фермент и холин. В свою очередь, ацетилированный фермент гидролизуется водой на уксусную кислоту и свободный фермент (Grutter & Changeux2001, Cea-del Rio et al., 2011; Blundon et al, 2011).
Альтернативный сплайсинг и регуляция экспрессии АХЭ существует в виде множественных изоформ, имеющих одинаковые каталитические свойства, но значительно различающихся характером сборки субъединиц, скоростью седиментации, а также типом ассоциации с клеточной мембраной (Li et al., 1991). Наиболее подробно структура гена ache исследована на примере гена Mus musculus (домовая мышь) и Homo sapiens (человек). Известно, что ген ache Н. sapiens расположен в хромосоме 7q22, ген М. musculus - в 5 (Li et al., 1991, 1993; Getman et al., 1992).
Исследования интронно-экзонной структуры гена ache млекопитающих показали, что ген ache компактен, длиной около 6-7 т.п.н. Короткие интроны обнаружены в инвариантно сплайсирующейся последовательности между 1-м, 2-м, 3-м и 4-м экзонами. Кроме того присутствуют 2 или 3 интрона, в зависимости от вида, возле 3 конца гена, образующего АХЭ, с различными С-концевыми последовательностями. Дивергенция между С-концевыми последовательностями, влияя на олигомеризацию фермента и на его мембраносвязывающие свойства, напротив, не влияет на его каталитические свойства (Legay et al., 1993, 2000; Camp et al.,2008).
Полиморфизм АХЭ возможен благодаря таким процессам, как альтернативный сплайсинг 3 конца и посттрансляционные модификации, в частности, N-гликозилирование и олигомеризация. В литературе описаны три канонические изоформы АХЭ, отличающиеся по вариабельности С конца и возникающие в процессе альтернативного сплайсинга. Каталитический домен или кор, свойственный всем изоформам АХЭ, образуется путем сплайсинга 2-го, 3-го и 4-го экзонов и состоит из 543 аминокислотных остатков. В результате сплайсинга экзонов, образующих каталитический домен, с 6 экзоном образуется С-концевая или «Т» последовательность, которая образует АХЭ, локализующуюся преимущественно в мышцах и мозге (Legay et al., 1995; Rotundo, 2003). При трансляции данной мРНК происходит удлинение основного домена на С конце за счет примерно 40 аминокислотных остатков, богатых цистеином, необходимое для образования димеров. Это так называемая синаптическая форма АХЭ. Ее С-концевой Т-пептид имеет свободный цистеин вблизи С конца и амфифильную а-спираль, что определяет образование множества четвертичных структур - как амфифильных (Gla, G2a и G4a), так и ассиметричных мономеров, димеров и тетрамеров (А формы), которые могут взаимодействовать с якорными белками ColQ (коллаген Q)H РШМА(богатый пролином мембраносвязанный белок), а также растворимого тетрамера (G4na). В каждом тетрамере каталитические субъединицы соединены между собой дисульфидными мостиками и ковалентно прикреплены с помощью дисульфидных связей к одной из нитей хвоста. (Grisaru et al.,1999; Legay, 2000; Rotundo, 2003).
При сплайсинге с 5-м экзоном, кодирующим 43 аминокислотных остатка, образуется изоформа «Н» с гликофосфатидилинозитольным концом (GPI). GPI-конец может интегрироваться в мембраны эритроцитов и заякоревать фермент на мембране. Несмотря на то, что эта изоформа у млекопитающих встречается только в клетках гематопоэтического происхождения, у рыб, амфибий и рептилий она присутствует в нервной и мышечной тканях (Ordentlich et al., 1992; Grisaru et al., 1999).
Ингибиторы ацетилхолинэстеразы
Антихолинэстеразные средства являются обширной группой среди биологически активных веществ. В состав этой группы входят лекарственные препараты (донепезил, ривастигмин, галантамин и т.д.), используемые в клинической практике, инсектициды (карбоматы и фосфорорганические соединения) и отравляющие вещества. Ингибиторы АХЭ традиционно применяются в медицинской практике для лечения заболеваний, патогенез которых требует продления времени действия медиатора в синаптической щели (Cummings, 2000; Yoon & Choi 2003; Yoon et al., 2005; Roelants et al, 2006). Так, АХЭ играет важную роль в патогенезе таких заболеваний как миастения Гравис, глаукома, атония кишечника и мочевого пузыря, прогрессирующая мышечная дистрофия, бульбарные параличи, боковой амиотрофический склероз, параличи и парезы при периферических невритах, а также в восстановительном периоде после травм ЦНС, менингита, энцефалита, полиомиелита (Cummings, 2000; Radina et al., 2001; Johnson et al., 2003; Yoon et al., 2005; Roelants et al., 2006; Feng et al., 2011).
В настоящее время имеется довольно большой выбор препаратов с антихолинэстеразным действием. Они различаются активностью, способностью проникать через тканевые барьеры, длительностью действия, наличием раздражающих свойств, токсичностью. Самым первым известным ингибитором ХЭ был алкалоид физостигмин, известный также как эзерин, выделенный из калабарских (судилищных) бобов. Многочисленными работами ученых рубежа XIX - XX веков были выявлены основные свойства физостигмина, такие какспособность усиливать перистальтику кишечника, антиглаукоматозный, антимиастенический и антикурарный эффекты. В 20 30-х годах XX века изучен механизм действия физостигмина и было установлено, что его эффект на сердце лягушки сопровождается торможением гидролиза АХ (Radina et al., 2001; Johnson et al., 2003; Giacobini, 2004). С тех пор круг ингибиторов АХЭ значительно расширился. Все известные ингибиторы АХЭ способны взаимодействовать с анионным (прозерин, физостигмин) или эстеразным (ДФФ) сайтами, бывают короткого (эдрофоний), среднего (прозерин) и длительного (ДФФ) действия, по принципу взаимодействия бывают необратимого (армии, фосфакол) и обратимого действия (физостигмин, галантамин и т.д.) (Jarvie et al., 2008; Wille et al., 2010; Salamone et al., 2011; Ronco et al., 2011). Анти-ХЭ ингибиторы обратимого действия вызывают временное, обратимое угнетение активности АХЭ. В результате происходит накопление АХ в синаптических окончаниях холинергических нервов и усиливается его действие на органы и ткани. Эффект таких средств относительно непродолжителен. После прекращения их (средств) взаимодействия с ферментом активность АХЭ восстанавливается. Антихолинэстеразные средства необратимого действия образуют с ферментом прочный комплекс, фосфорилируя при этом Ser 203, входящий в каталитическую триаду, и если не применяются специальные реактиваторы, то активность фермента не восстанавливается (Farlow et al., 1992; Woodruff-Pak et al., 2001; Johnson et al., 2003; Shan et al., 2011). Нормальный же процесс гидролиза АХ начнется лишь тогда, когда произойдет биосинтез новой ХЭ. Особенностью реакций ингибиторов, образующих ковалентную связь (ФОС, карбаматы) с ХЭ, является наличие двух стадий реакции. В первую стадию реакция осуществляется по типу обратимой конкурентной, а во вторую стадию - в результате установления ковалентной связи ингибитора с серином ХЭ в эстеразном сайте, становится необратимой (Cummings, 2000; Yoon & Choi 2003; Yoon et al., 2005; Roelants et al., 2006; Guarisco et al., 2009). Вместе с тем значительное количество антихолинэстеразных веществ, в частности карбаматы, хотя и вызывают временное, обратимое торможение ХЭ, но являются необратимыми ингибиторами, разрушающимися на поверхности фермента. Так, при сильном угнетении активности АХЭ происходит перенакопление АХ в синаптических щелях, вызывающее нарушения синаптической передачи, что приводит к тяжелым последствиям вплоть до смерти. В частности, в нервно мышечном синапсе при угнетении АХЭ резко замедляется временное течение постсинаптических ответов и нарушается способность мышц удерживать тетанус (Jarvie et al., 2008; Salamone et al., 2011). Механизм этого нарушения заключается в том, что в условиях сильного ингибирования АХЭ удаление АХ из синаптической щели происходит в основном за счет диффузии. При этом в щели накапливается негидролизованный АХ, спады ритмически следующих ПКП суммируются, что вызывает устойчивую деполяризацию постсинаптической мембраны, инактивацию Na+ каналов и неспособность мышечного волокна генерировать потенциалы действия (Кривой и др., 1987; Knapp et al, 1994; Morris et al., 1998; Cummings, 2000; Tian et al., 2011). В клинической же практике применяют только обратимые ингибиторы ХЭ.
В последние годы наиболее эффективно обсуждаются механизмы действия вновь синтезированных и уже принятых в клинической практике веществ, обладающих способностью ингибировать АХЭ (Cummings, 2000; Woodraff-Pak et al, 2001; Yoon & Choi 2003; Yoon et al., 2005; Tian et al., 2011). В настоящее время имеется большой выбор препаратов с антихолинэстеразным действием. Они различаются активностью, способностью проникать через тканевые барьеры, длительностью действия, наличием раздражающих свойств, токсичностью. Так, галантамин, ривастигмин, донепезил хорошо проникают через ГЭБ и используются для лечения когнитивной дисфункции (Raskind et al., 1999; Samochocki et al., 2003; Svoboda et al., 2005; Головкова и др. 2007). Прозерин, оксазил, калимин действуют на периферии (Lindstrom & Lambert 1978, Cummings, 2000; Jarvie et al., 2008; Salamone et al., 2011). Среди препаратов этой группы препарат ипидакрин обладает как центральным, так и периферическим механизмом действия, что обусловлено оригинальным механизмом действия препарата (Букатина и др., 1991; Jarvie et al., 2008; Salamone et al., 2011).
Широкому применению данных препаратов препятствует существенный недостаток - полное отсутствие избирательности по отношению к ферменту разных органов и тканей. Одновременно с воздействием на пораженные органы, происходит ингибирование фермента в органах, функционирование которых не требует коррекции (Cummings, 2000;Yoon & Choi 2003; Jarvie et al., 2008; Bosgra et al., 2009; Salamone et al., 2011). В связи с чем, могут наблюдаться побочные явления, связанные с гиперактивностью холинергических процессов: усиление слюноотделения, усиление перистальтики и спастические боли в животе, диарея, частое мочеиспускание, судорожные реакции, тошнота, нарушение работы дыхательной мускулатуры и, кроме того, развиваются брадикардия, нарушения атриовентрикулярной проводимости, аритмия, бронхоконстрикция. Вышеописанных недостатков могли бы быть лишены фармакологически безопасные органо- и тканеспецифичные ингибиторы ацетилхолинэстеразы, способные оказывать целевой эффект в отдельных органах, в далеких от смертельных дозах (Yoon et al., 2005; Roelants et al., 2006; Jarvie et al., 2008; Haigh et al., 2008; Salamone et al., 2011).
Различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache органов и тканей Rattus norvegicus
Поскольку производное 6-метилурацила является избирательным ингибитором АХЭ (Anikienko et al., 2008), то активность БХЭ может компенсировать недостаток активности АХЭ. Следует отметить, эксперименты по исследованию полного ингибирования БХЭ в присутствии С-547 выявили увеличение чувствительности диафрагмы к производному 6-метилурацила. Однако, это не устраняло полностью различий между мышцей EDL и диафрагмой (Petrov et al., 2009). Таким образом, должен существовать другой механизм, который обеспечивает устойчивость дыхательных мышц, сердца и головного мозга к алкиламмониевым производным 6-метилурацила.
Большинство известных ингибиторов АХЭ действуют по двум основным мишеням белка - по активному и периферическому (ПАС) сайтам. Взаимодействующие с активным центром ингибиторы предотвращают связывание молекулы субстрата, ее гидролиз посредством занятия сайта молекулой с высокой аффинностью (такрин), или путем обратимого взаимодействия с серином, входящим в каталитическую триаду (органофосфаты и карбаматы). Ингибиторы, которые связываются ПАС, включают небольшие молекулы, такие как пропидий и пептидные токсины, например - фасцикулин. Бисчетвертичные ингибиторы, такие как декаметоний и другие, одновременно связываются с активным и периферическим сайтами, полностью занимая, таким образом, все ущелье (Ronco et al., 2011; Pametti et al., 2011; Fenget al., 2011; Shan et al., 2011).
Несмотря на то, что производное 6-метилурацила С-547 принадлежит к семейству тетраалкиламмониевых ингибиторов, в число которых входят декаметоний и BW284c51, способные взаимодействовать с ПАС, сложная разветвленная структура строения исследуемого соединения, а также наличие в стуктуре урацила, являющегося структурным аналогом фрагмента некоторых коферментов говорит о том, что данное соединение способно взаимодействовать с АХЭ подобно неконкурентному ингибитору, вызывая при этом изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Как известно, неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Так как С-547 относится к разряду псевдонеобратимых ингибиторов неконкурентного действия (Аникиенко и др., 2001), а время жизни комплекса «лиганд-АХЭ» может превышать период полуобновления фермента, поиск особенностей строения АХЭ, обеспечивающих разную чувствительность к производным 6-метилурацила, мы продолжили на уровне различий в пострансляционной модификации белка. По данным литературы, посттрансляционной модификацией АХЭ является N-гликозилирование. N гликозилированию подвергаются остатки аспаргина в белке. АХЭ содержит три потенциальных сайта N-гликозилирования. Известно, что посттрансляционное гликозилирование может влиять на биологическую активность АХЭ, транспорт к клеточной мембране, стабилизацию функциональной конформации и защищает белок от протеолитической деградации. N-гликозилирование изоформы «Т» играет важную роль в процессе биосинтеза и секреции фермента (Cohen et al., 2001; Chitlaru et al., 2002; Chen et al., 2011). Сложная разветвленная структура ингибитора свидетельствует о потенциально большом количестве контактных точек в образующемся комплексе, в связи с чем высказано предположение, что алкил аммониевое производное 6-метилурацила (С-547) теоретически способно вступать во взаимодействие с N-гликанами. Исходя из анализа аминоксилотной последовательности АХЭ R. norvegicus сайты гликозилирования (позиция 296, 381 и 495) расположены в относительной близости от сайтов, образующих активный центр фермента (позиция 234, 365 и 478) и при образовании третичной структуры находятся в непосредственной близи от активного центра. Таким образом, взаимодействие С-547 с N-гликанами вероятно приводит к существенным конформационным перестройкам молекулы АХЭ, связанным с пространственными изменениями в N-гликанах, затрагивающими активный центр и приводящими к потере ферментативной активности.
Для проверки данной гипотезы с помощью сайт-направленного мутагенеза мы провели аминокислотные замены Asn в позициях 296, 381 и 495 на Gin (Рис. 12), по отдельности и в разных комбинациях с последующей экспрессией рекомбинантных АХЭ в культуре клеток и определением степени ингибирования С-547. Корректность замены аминокислотных остатков оценивали с помощью теста Айзенберга (программа 3D_Profiles). В основе метода лежит описание окружения каждого аминокислотного остатка модели и вычисление значения функции совместимости (S) в его окружении. Для общей оценки структуры вычисляли величину функции совместимости для всей последовательности, как сумму величины S по всем остаткам (Bowie et al., 1991).
Влияние гликозилирования ацетилхолинэстеразы на обеспечение чувствительности к производным 6-метилурацила
Для определения взаимодействия между ферментом и ингибитором, нами определена нуклеотидная последовательность на 5 и 3 областях гена ache. На основании полученных данных нами построена компьютерная модель интронно-экзонной структуры гена ache R. norvegicus. Данные об интронно-экзонной структуре гена ache R. norvegicus имеют важное теоретическое и практическое значение, позволяя провести поиск потенциальных сайтов сплайсинга и сравнительный анализ продуктов альтернативного сплайсинга в разных органах и тканях.
Так как нам не удалось обнаружить дополнительных интронов и экзонов в нуклеотидной последовательности гена ache R. norvegicus, это позволило сделать вывод об отсутствии дополнительных изоформ АХЭ, образующихся в процессе альтернативного сплайсинга и способных объяснить избирательность действия производного 6-метилурацила по отношению к ферменту разных органов и тканей. В дальнейшем полученные данные легли в основу выполненного нами сравнительного анализа продуктов альтернативного сплайсинга гена ache R. norvegicus.
Известно, что экспрессия мРНК изоформ гена ache происходит в большинстве тканей организма, включая скелетную мускулатуру, различные типы нейронов центральной и периферической нервной системы. В поперечно-полосатой мускулатуре и в ЦНС основная масса АХЭ представлена в виде «Т» изоформы, в крови - «Н», a «R» возникает в процессе воздействия на организм различных, вызывающих стресс, факторов. Экзоны 2, 3 и 4-й образуют при альтернативном сплайсинге каталитический домен, свойственный всем изоформам АХЭ. В результате сплайсинга экзонов, образующих каталитический домен, с 6 экзоном возникает изоформа «Т», локализующуюся преимущественно в мышцах и мозге. Изоформа «R» («readthrough») или прямой транскрипт образуется при сплайсинге консервативных экзонов и 5-гоэкзона, без вырезания 4-го интрона.
Сравнительный анализ продуктов альтернативного сплайсинга гена ache R. norvegicus показал высокий уровень экспрессии изоформы «Т» в мышце EDL по сравнению с остальными исследуемыми органами. Полученные данные могут свидетельствовать о присутствии в синапсах тканей диафрагмы, сердца и головного мозга других холинэстреаз, выполняющих компенсаторную роль при воздействии ингибиторов. Так, известно, что уровень синаптической АХЭ не остается постоянным, а меняется под воздействием различных факторов эндогенной и экзогенной природы, что приводит к изменениям в сплайсинге пре-мРНК, в результате чего происходит сверхэкспрессия изоформы «R» с более длительным периодом полужизни вместо «Т». В результате проведенного нами анализа выявлено присутствие мРНК изоформы «R» во всех исследуемых образцах. При этом уровень экспрессии мРНК изоформы «R» был в 2 раза меньше по сравнению с изоформой «Т» в мышце EDL, в то время как в остальных органах уровень экспрессии мРНК этих изоформ был одинаков. Таким образом, втканях сердца, диафрагмы и головного мозга помимо основной изоформы «Т» присутствует высокий уровень изоформы «R» которая, вероятно менее подвергается влиянию С-547 и выполняет, таким образом, частично компенсаторную роль.
Также нами проверена компенсаторная роль БХЭ в исследуемых органах. Анализ уровня экспрессии мРНК bche показал высокий уровень мРНК bche в сердце. Установленная отрицательная зависимость уровня экспрессии мРНК гена ache по отношению к мРНК bche говорит о функциональной значимости БХЭ в синапсах диафрагмы, сердца и головного мозга в отличие от мышцы EDL. Таким образом, несомненно, компенсаторную роль может также играть и БХЭ, делая тем самым диафрагму, сердце и головной мозг менее чувствительными к воздействию производного 6-метилурацила. Несмотря на то, что производное 6-метилурацила С-547 принадлежит к семейству тетраалкиламмониевых ингибиторов, способных взаимодействовать с периферическим анионным сайтом, известно, что С-547 может взаимодействовать с АХЭ подобно неконкурентному ингибитору, вызывая при этом изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Однако С-547 практически необратимо ингибирует АХЭ теплокровных без образования ковалентных связей с ней, что не характерно для неконкурирующего типа ингибирования. Возможно, С-547 не взаимодействует с функциональными группами АХЭ, а оказывает влияние на конформацию фермента за счет взаимодействия с N-гликанами, что приводит к потере ферментативной активности. Полученные нами данные показывают отсутствие влияния степени гликозилирования на активность АХЭ в присутствии С-547.
Таким образом, в случае ингибирования АХЭ мышцы EDL С-547 играют роль процессы, лишь опосредованно связанные с конформацией активного центра, хотя и оказывающие сильное регуляторное действие. Следует отметить, что регуляция трехмерного пространственного расположения АХЭ в гетероолигомере, образованном с якорными белками ColQ и PRiMA является одним из вариантов регуляции активности фермента. Известно, что в синапсе основные формы АХЭ представлены ассиметричными формами (А), тетрамером (G4), ассоциированным с ColQ или с PRiMA (Belbeoc h et al., 2004; Dvir et al., 2004; Zhang et al., 2005; Bernard et al., 2011). Хотя в нервно-мышечном синапсе основной пул функционального нейромедиатора представляет собой коллаген ассоциированная форма, форма, ассоциированная с PRiMA, также присутствует. Количество формы G4 зависит от активности скелетной мускулатуры. Якорные белки взаимодействуют с мономерами, димерами, тримерами и тетрамерами АХЭ образуя комплекс [АХЭ]„якорный белок.
Вероятно, разное распределение молекулярных форм АХЭ может отражать их различную роль в регуляции концентрации АХ в синаптической щели (Aldunate et al., 2004; Meshorer & Soreq 2006; Massoulie & Millard 2009). С целью проверки гипотезы о регуляции активности АХЭ в гетероолигомере, образованном с якорными белками, мы провели анализ влияния якорных субъединиц PRIMA и ColQ на значения ингибирования АХЭ С-547. В результате проведенного нами биохимического анализа установлено, что наличие якорных субъединиц не оказывает влияния на избирательность действия С-547 по отношению к АХЭ.
Из данных литературы известно, что в окружении активных центров ферментов расположены обширные и малоизученные зоны, содержащие полярные группы и циклические фрагменты, способные к разнообразным, в том числе к стекинговым взаимодействиям с лигандами (Bourne et al., 2005; Da Silva et al., 2006; Tseng et al., 2009). Таким образом, следует заключить, что при взаимодействии фермента и ингибитора, вероятно, задействованы другие механизмы, выполняющие опосредованную роль в работе фермента, но оказывающие критическое значение при ингибировании. Также, следует отметить особое строение молекулы С-547, которая может принимать огромное количество пространственных конформаций, что делает затруднительным предсказание вероятных точек взаимодействия лиганда с ферментом. Сложная организация межсинаптического пространства, в котором происходит взаимодействие ингибитора и АХЭ, также может опосредованно влиять на процесс ингибирования.
Запланированные цели исследования достигнуты. Полученные нами данные об интронно-экзонной структуре гена acheR. norvegicus имеют важное теоретическое и практическое значение для дальнейших исследований в различных областях биохимии, молекулярной биологии и генетики. В литературе отсутствуют работы по комплексной оценке уровня экспрессии мРНК изоформ гена ache в различных органах и тканях для млекопитающих. Таким образом, проведенные нами исследования имеют важную теоретическую и практическую значимость, расширяя представление о разнообразии изоформ фермента в органах и тканях R. norvegicus. При этом, особый интерес представляет собой изоформа «R», значимость которой при исследовании ингибиторов избирательного действия может быть высока. Также обнаруженный нами высокий уровень мРНК гена bche в тканях диафрагмы, сердца и головного мозга указывает на важное функциональное значение БХЭ в этих органах, что может в дальнейшем помочь при рассмотрении ее компенсаторной роли под воздействием новых ингибиторов. Разработанные нами вектора экспрессии для гена ache, содержащего нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования в различных комбинациях имеют как фундаментальное (исследование влияния гликанов на активность, процессы транспорта к мембране, исследование заболеваний, в патогенезе которых принимает участие АХЭ и т.д.), так и прикладное значение - для разработки на их основе вирусных векторов и клеточных тест-систем для скрининга анти-АХЭ препаратов.
