Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Орпитиндекарбоксилаза и ее роль в клетках и тканях млекопитающих на действие различных факторов 11
1.1.1 Полиамины и их физиологическая роль 11
1.1.2 Орнитиндекарбоксилаза: структура, ингибиторы активности и деградация ОДК 16
1.1.3 Регуляция фермента орнитиндекарбоксилазы... 20
1.1.4 Влияние гормонов и физических факторов на ферментативную активность орнитиндекарбоксилазы в органах и тканях млекопитающих 23
1.2 Гинометаболические состояния млекопитающих 27
1.2.1 Естественный гипобиоз при гибернации млекопитающих 27
1.2.2 Искусственный гипобиоз млекопитающих 33
1.3 Стресс: общее понятие, гормоны стресса. Холодовой стресс клеток млекопитающих 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Объекты исследования 41
2.1.1 Якутские длиннохвостые суслики Spermophilus undulatus 41
2.1.2 Крысы Wistar 43
2.1.3 Подготовка органов и тканей млекопитающих к экспериментальным исследованиям 43
2.2 Методы исследования 45
2.2.1 Охлаждение крыс методом «закрытого сосуда» 45
2.2.2 Определение ферментативной активности орнитиндекарбоксилазы 46
2.2.3 Определение белка по методике Лоури 47
2.2.4 Метод проточной цитофлюориметрии 48
2.2.5 Подсчет клеток лимфоидных тканей 49
2.2.6 Определение содержания гемоглобина в селезенке 50
2.2.7 Статистическая обработка результатов исследования 50
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 51
3.1 Активность орнитиндекарбоксилазы в органах и тканях сусликов Spermophilus undulatus 51
3.1.1 Активность ОДК в печени сусликов в летний период и в сезон гибернации 53
3.1.2 Активность ОДК в селезенке сусликов в летний период и в сезон гибернации 55
3.1.3 Активность ОДК в почках сусликов в летний период и в сезон гибернации 62
3.1.4 Активность ОДК в слизистой оболочке тонкого кишечника сусликов в летний период и в сезон гибернации 64
3.1.5 Активность ОДК и распределение клеток по фазам клеточного цикла в костном мозге сусликов в летний период и в сезон гибернации 67
3.2 Активность орнитиндекарбоксилазы в органах и тканях крыс в условиях искусственного гипобиоза 74
3.2.1 Физиологическая характеристика крыс в условиях искусственного гипобиоза 75
3.2.2 Активность ОДК в органах и тканях крыс в условиях искусственного гипобиоза и в разные сроки после окончания воздействия гипотермии-гипоксии-гиперкапнии 77
3.2.3 Влияние гипотермии-гипоксии-гиперкапнии на инволюцию лимфоидных органов 85
3.2.4 Влияние искусственного гипобиоза на распределение клеток активно пролиферирующих тканей по фазам клеточного цикла 86
3.3 Сравнительная характеристика изменения активности ОДК в органах и тканях млекопитающих при гибернации и искусственном гипобиозе 89
Выводы 93
Заключение 94
Библиографический список 96
Приложения 117
- Орнитиндекарбоксилаза: структура, ингибиторы активности и деградация ОДК
- Естественный гипобиоз при гибернации млекопитающих
- Подготовка органов и тканей млекопитающих к экспериментальным исследованиям
- Активность ОДК в селезенке сусликов в летний период и в сезон гибернации
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование адаптивных возможностей человека и животных к экстремальным факторам окружающей среды. В этом плане зимоспящие млекопитающие являются уникальными объектами для изучения резервных приспособительных способностей теплокровных животных путем гибернации. В сезон гибернации (лат. hibernatio — зимовка, зимняя спячка, от hibemus — зимний) состояние оцепенения позволяет млекопитающим значительно экономить энергетические ресурсы организма за счет радикального снижения уровня физиологических и обменных процессов. Важно, что за короткий период пробуждения зимоспящие способны полностью восстановить, измененный во время баута, метаболизм [Lyman С.Р: et al., 1982; Колаева С.Г., 1996]. Изучение гипометаболических состояний — перспективное направление современной фундаментальной науки и медицины. Состояние сниженной жизнедеятельности для незимоспящих млекопитающих возможно создать в условиях гипотермии с использованием гипокси-гиперкапнических газовых сред. При этом незимоспящие животные впадают в состояние так называемого «холодового наркоза», гипобиоза [Игнатьев Д.А. и др., 2006].
Полагают, что по набору генов естественные гибернанты не отличаются от незимоспящих млекопитающих [Carey H.V. et al., 2003]. В связи с этим на первый план выдвигается задача исследования филогенетически выработанной биохимической адаптации зимоспящих млекопитающих к экстремальным условиям [Hampton М., Andrews М.Т.,
2007; Storey К.В., 2009]. Показано, что в ходе гибернации происходит изменение активности ряда ферментов на разных стадиях их новообразования и функционирования [Carey H.V. et al., 2003].
Предполагается, что аналогичные изменения имеют место и при гипометаболических состояниях незимоспящих млекопитающих, которые связаны с процессами биохимической адаптации организма [Andrews М.Т., 2007; Storey К.В., 2009]. В этом отношении особый интерес представляет исследование короткоживущих и динамично регулируемых ферментов млекопитающих, одним из которых является орнитиндекарбоксилаза (ОДК, КФ 4.1.1.17). Регуляция ОДК осуществляется на уровне транскрипции, стабилизации мРНК, трансляции, деградации фермента, а также индукции специфичных белков-регуляторов. Резкое повышение активности ОДК -одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клетки, готовящейся к росту и делению, дифференцировке или активному выполнению специализированной функции [Hayashi S., Murakami Y., 1995; Pegg A.E., 2006]. На уровне целого организма активность ОДК регулируется неироэндокриннои системой, что важно для оценки системных адаптивных реакций организма на воздействия факторов внешней среды. Отмечено, что ОДК принимает участие в процессах адаптации млекопитающих к низким температурам окружающей среды и перехода в состояние гипобиоза [Мельничук Д.О. и др., 2000]. Разнообразные изменения в регуляции фермента в конечном итоге сводятся к изменению его активности. Поэтому, представляет интерес осуществить приоритетные исследования вовлечения фермента биосинтеза полиаминов в механизмы биохимической адаптации по изменению активности ОДК в органах и тканях млекопитающих.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Цель работы;
Показать роль фермента биосинтеза полиаминов -орнитиндекарбоксилазы - в адаптации естественных гибернантов к действию факторов окружающей среды, а также вовлечение фермента в механизмы адаптации при искусственном гипобиозе незимоспящих млекопитающих.
Задачи исследования:
Показать участие фермента ОДК в биохимической адаптации сусликов Spermophilus undulahis в различных физиологических состояниях в период гибернации;
Изучить вовлечение фермента ОДК в механизмы биохимической адаптации крыс Wistar при искусственном гипобиозе;
3.Исследовать распределение клеток активно пролиферирующих тканей сусликов Spermophilus undulatus и крыс Wistar по фазам клеточного цикла с целью сопоставления с изменениями активности ОДК как маркера пролиферации.
Научная новизна работы
Впервые показано, что развитие естественного и искусственного гипобиоза сопровождается специфическими изменениями активности фермента биосинтеза полиаминов - орнитиндекарбоксилазы - в органах и тканях млекопитающих. В костном мозге сусликов в состоянии оцепенения, а также в тимусе крыс после окончания воздействия гипотермии-гипоксии-гиперкапнии изменения активности фермента ОДК соотносятся с изменениями темпа клеточной пролиферации (по критерию распределения клеток по фазам клеточного цикла). В костном мозге у крыс искусственный гипобиоз не сопровождается изменениями в распределении клеток по фазам клеточного цикла при наличии угнетения активности ОДК. Для сусликов 5". undulatus показано наличие положительной корреляции между ингпбированием и восстановлением специализированных функций органов и тканей млекопитающих и соответствующими модификациями ферментативной активности ОДК. По критериям активности ОДК и распределению клеток по фазам клеточного цикла обнаружены отличия между состоянием искусственного гипобиоза у крыс Wistar и стадией оцепенения у сусликов S undulatus.
Научная и практическая значимость работы
Диссертационная работа имеет фундаментальное и практическое значение в области биологии и медицины. Из анализа результатов следует, что ключевой фермен г биосинтеза полиаминов — ОДК — принимает участие в биохимической адаптации естественных гибернантов к действию факторов окружающей среды, а также включается в механизмы адаптации при искусственном гипобиозе у незимоспящих млекопитающих.
Определение активности фермента орнитиндекарбоксилазы перспективно в качестве функционального биохимического теста при разработке способов получения управляемых гипометаболических состояний у высших теплокровных животных и выбора для этих целей фармакологических препаратов.
Апробация работы
Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на следующих конференциях: на 11-й; 12-й; 13-й; 14-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007, 2008, 2009, 2010); на 20-й; 21-й зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009); на 16-й международной конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); на 12-м всероссийском конгрессе биологов с международным участием «Симбиоз
Россия 2009» (Пермь, 2009); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, 3 статьи в сборниках и 11 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 13 таблиц и 4 приложения. Список цитируемой литературы включает 215 источников.
Орнитиндекарбоксилаза: структура, ингибиторы активности и деградация ОДК
. ОДК - один из самых быстро обменивающихся, короткоживущих и динамично регулируемых ферментов. Период полужизни (ti/2) фермента в нормальных тканях составляет 10-30 мин [Бердинских Н.К., Залеток СП., 1985]. О скорости обмена ОДК впервые было сообщено в 1969 г Russel и Snyder. Индукция ОДК - это одно из наиболее ранних молекулярных проявлений активирования метаболизма клетки. В покоящихся клетках активность этого фермента сохраняется достаточно низкой, но под влиянием различных пролиферативных стимулов, включающих гормоны и органную регенерацию, активность орнитиндекарбоксилазы кратковременно резко возрастает. "На клеточном уровне это говорит о переходе клеток из фазы Gj в фазу S клеточного цикла" [цитировано по Букин Ю.В., 2000] (приложение А). В отличие от воздействия нормальных физиологических стимулов, канцерогены вызывают резкое повышение активности ОДК, что может привести к злокачественной трансформации клеток [Clifford A. et al., 1995; Auvinen М. et al., 1998; Букин Ю.В., Драудин-Крыленко В.А., 2000].
Пути регуляции активности фермента орнитиндекарбоксилазы многообразны и зависят от типа клеток, тканей, характера воздействия. Количество фермента регулируется на уровне транскрипции, деградации мРНК, трансляции мРНК и деградации фермента [Hayashi S., Murakami Y., 1995; Wallon U.M. et al., 1995; Pegg A.E., 2006]. Кроме того, орнитиндекарбоксилаза специфично ингибируется антизимом ОДК и является объектом негативной регуляции полиаминами по типу обратной связи. Экзогенное добавление полиаминов подавляет индукцию ОДК в ответ на разные стимулы, и вызывает быстрый спад активности уже индуцированной ОДК. Среди природных полиаминов спермидии является наиболее, а путресцин наименее эффективными для подавления активности ОДК [Hayashi S., Murakami Y., 1995; Mitchell J.L. et al., 1996; Yuan Q. et al., 2001].
В клетке часть молекул фермента орнитиндекарбоксилазы может находиться в неактивном состоянии в комплексе со специфическим ингибитором «ОДК антизимом». Индуцированный полиаминами антизим связывается с ОДК, что приводит к снижению уровня внутриклеточных полиаминов. Используя клеточные линии Murakami и соавторы [Murakami Y. et al., 1994] показали, что клеточное время полужизни комплекса ОДК— антизим менее 5 мин. Отделение орнитиндекарбоксилазы от комплекса с антизимом може г осуществляться с помощью добавления ингибитора антизима или необратимым связыванием фермента с помощью а-ДФМО. Ингибитор антизима связывается строго с антизимом и высвобождает ОДК из комплекса ОДК-антизим замещением, тем самым регулируя гомеостаз внутриклеточных полиаминов [Mangold U., 2005, 2006; Albeck S. et al., 2008]. При введении в организм специфического ингибитора а—ДФМО происходит ингибирование активности ОДК, что также приводит к падению внутриклеточного содержания полиаминов и ингибированию роста.
Орнитиндекарбоксилаза регулируется на уровне транскрипции и трансляции [Shantz L.M., 1999, 2004; Pegg А.Е., 2006].
Промотор одк гена содержит последовательности, которые позволяют отвечать на гормоны и ростовые факторы, включая область ответа на цАМФ. Индукция одк гена может играть роль в сигнальных путях некоторых онкогенов. ОДК является транскрипционной.мишенью онкогенов с-тус и ras [Bello-Fernandez С. et al., 1993; Репа A. et al., 1993]. Активация ras влияет как на содержание мРНК ОДК, так и на ее трансляцию [Shantz L.M., 2004]. Из литературных данных известно, что снижение скорости синтеза ОДК может не сопровождаться снижением содержания мРНК ОДК, что доказывает регуляцию синтеза ключевого фермента биосинтеза полиаминов на уровне трансляции [Kahana С. et al., 1985; Persson L., 1986].
Трансляция мРНК ОДК возможна как по механизму сканирования, так и по кэп — независимому механизму благодаря наличию IRES — последовательностей (области внутренней посадки рибосом) в мРНК орнитиндекарбоксилазы [Pegg А.Е., 2006; Pyronnct S. et al., 2000]. IRES (internal ribosome entry sites) - последовательности представляют собой определенные протяженные последовательности на 3 конце 5 UTR, создающие сложную вторичную структуру. Интересно отметить, что многие белки, синтез которых экспрессируется с помощью 5 UTR, являются протоонкогенами. Сложный механизм кэп — зависимой инициации трансляции имеет много «уязвимых мест». Наиболее часто трансляция подавляется за счет инактивации факторов eIF4E, eIF4G и eIF2. Однако сам факт существования стресс - зависимой инактивации кэп-зависимой трансляции подсказывает возможную биологическую роль внутренней инициации трансляции. Действительно, в большинстве случаев для работы IRES не требуются некоторые из факторов инициации. Следовательно, в случае стрессовой инактивации этих факторов, РНК, содержащие IRES, будут продолжать транслироваться. Таким образом, клетка получает дополнительную степень свободы - может сохранить экспрессию некоторых матриц на фоне остановленной трансляции остальных мРНК [Vagner S. et al., 2001; Скулачев MB., 2005; Lopez-Lastra M. et al., 2005]. Например, в условиях клеточного холодового стресса транслируются преимущественно мРНК, несущие IRES - последовательности [Al-Fageeh М.В. et al., 2005; Al-Fageeh M.B., Smales СМ., 2006].
Важным фактором, влияющим на трансляцию мРНК ОДК, является внутриклеточное содержание полиаминов. Избыток полиаминов ингибирует трансляцию большинства мРНК ОДК. Ингибирование ОДК трансляции происходит при относительно низком уровне полиаминов. Спермидин и спермин более важные регуляторы трансляции ОДК мРНК in vitro, чем путресцин. Стимуляция ОДК синтеза полиаминами является оптимальной при 200 цМ, а ингибирование происходит при концентрации свыше 400 иМ [Persson L. et al., 1986; Ito К. et al., 1990].
Естественный гипобиоз при гибернации млекопитающих
Искусственный гипобиоз, способы его достижения. Состояние сниженной жизнедеятельности возможно и для незимоспящих млекопитающих в специальных условиях, например, в условиях гипотермии. Гипотермия — снижение температуры тела ниже нормальной. Состояние гипотермии приводит к снижению уровня метаболизма и возникновению гипобиоза. Диапазон температур тела, при котором может быть достигнуто гипометаболическое состояние у незимоспящих млекопитающих находится в интервале от 15С до 23С [Майстрах Е.В., 1964]. При этом охлаждение негибернирующих млекопитающих, например, крыс ниже 15С уже не совместимо с жизнью из-за угнетения ЦНС, паралича дыхательных центров, фибрилляции сердца и т.д. [Майстрах Е.В, 1964; Иванов К.П., 1996; 2007]. У человека сердце перестает выполнять свои функции, когда температура тела падает до 25-23 С [Майстрах Е.В, 1964].
Гипотермия может быть вызвана охлаждением организма, а также различными фармакологическими веществами, которые используются для подавления функций ЦНС и скелетной мускулатуры. При этом если снижение температуры тела вызвано фармакологическими агентами, то гипотермное состояние является вторичным по отношению к гипобиозу. И, наоборот, при достижении гипобиоза охлаждением теплокровного организма, состояние гипотермии является первичным [Тимофеев Н.Н., Прокопьева Л.П., 1997].
Состояние глубокой гипотермии млекопитающих без применения фармакологических средств можно получить путем охлаждения организма с использованием гипокси-гиперкапнических газовых сред [Игнатьев Д.А. и др., 1989]. Важно, что при данном способе охлаждения начинает функционировать ряд характерных для гибернации естественных механизмов. При охлаждении незимоспящих животных в условиях гипоксии-гиперкапнии подавляется активность центра терморегуляции гипоталамуса и теплопродукция организма [Иванов К.П., 1968]. Снижение температуры животных в условиях гипоксии-гиперкапнии увеличивает поглощение углекислого газа кровью, что понижает рН тканей; закисление жидкой среды подавляет тканевый обмен [Geinisman Y. et al., 2001], облегчаяпротекание гипоксии. Ионы Са" являются важнейшими регуляторами процессов метаболизма в клетке. В норме концентрация «внутриклеточного» Са2+ примерно на четыре порядка ниже по сравнению с межклеточной средой, поддержание этого соотношения достаточно энергоемко. Снижение температуры замедляет работу Са -обменного насоса; увеличение внутриклеточного Са"+ в этих условиях является одной из основных причин нарушения жизнедеятельности клеток. Понижение рН тканей ингибирует aвходящий в клетку Са" -ток [Накипова О.В. и др., 1989], способствуя выживанию клеток в условиях низких температур. Гиперкапния облегчает диссоциацию оксигемоглобина и расширяет кровеносные сосуды, что улучшает снабжение тканей мозга кислородом [Майстрах Е.В., 1964]. Накопление С02 оказывает наркотическое действие, облегчая вход в состояние гипобиоза. Гипоксия способствует накоплению ГАМК -основного тормозного медиатора центральной нервной системы [Nilsson G.E., Lutz P.L., 1993]. Известно, что скорость потребления кислорода мозгом в 10-30 раз выше по сравнению с другими тканями организма [Mink J.W. et al., 1981].
Изолированное действие гипоксии и гиперкапнии было бы менее благоприятно, чем сочетание этих факторов: дыхание и сердцебиение крыс могли бы остановиться при более высокой температуре, чем использованная при сочетании данных условий [Miller J.A., Miller F.S., 1959].
Вход в гипобиоз и поддержание этого состояния проходит под общим контролем ЦНС. Развитие гипотермии у незимоспящих как и у зимоспящих начинается с торможения нервной деятельности высшего отдела ЦНС -неокортекса, постепенно распространяющегося затем и на подкорковые структуры; выход из гипотермии происходит в обратной последовательности [Майстрах Е.В., 1964; Игнатьев Д.А. и др., 1998].
Вход незимоспящих млекопитающих в состояние гипотермии без применения фармакологических средств осуществляется в две стадии. На первой стадии происходит активация сократительного термогенеза (дрожь, судороги) с выбросом гормонов надпочечников — катехоламинов (адренергическая стадия). После истощения пула катехоламинов отключается сократительный термогенез и наступает вторая стадия -холинергическая или несократительный термогенез, обусловленный процессами нефосфорилирующего тканевого дыхания, связанного со свободным теплообразованием. Холодовую блокаду процессов сократительного термогенеза принято считать состоянием «холодового наркоза» [Тимофеев Н.Н., Прокопьева Л.П., 1997].
Создавая состояние искусственной зимней спячки, можно добиться чрезвычайного замедления всех физиологических процессов в организме и изменения его реактивности, что делает организм более устойчивым к разнообразным патологическим процессам: травмам, интоксикациям, кислородной недостаточности и т.д. Было показано, что состояние гипотермии увеличивает устойчивость млекопитающих к ионизирующему излучению. Этот эффект отмечен как у млекопитающих в состоянии естественного гипобиоза - зимней спячки, так и у обычных теплокровных, искусственно введенных в гипотермию [Константинова М.М., 1961; Гордейчева Н.В., Строкова Т.П., 1968; Гордон Р.Я. и др., 2006]. Так, исследования влияния гипотермии на радиоустойчивость крыс показало высокие радиозащитные свойства искусственной гипотермии. При дозе 8 Гр наблюдается 100% выживаемость животных, подвергнутых облучению в состоянии холодового наркоза, средняя продолжительность жизни крыс, облученных в состоянии нормотермии, составила 8,3 сут. Фактор изменения дозы (ФИД) равен 1,4 [Игнатьв Д.А. и др., 2006]. Изучение природных адаптационных механизмов открывает новые перспективы практического использования искусственного гипобиоза в плане решения важных прикладных задач, связанных, например, с температурной адаптацией, повышением возможности выживания человека в экстремальных условиях; расширением возможностей практической медицины при лечении ряда заболеваний. [Тимофеев Н.Н., Прокопьева Л.П., 1997; Тимофеев Н.Н., 2005].
Подготовка органов и тканей млекопитающих к экспериментальным исследованиям
Исследуемые органы и ткани после декапитации млекопитающих извлекали и замораживали в жидком азоте, где хранили до момента исследования активности ОДК (не более 3-х недель).
У сусликов для исследования активности ОДК использовали: селезенку, печень, почку, костный мозг плечевой кости, слизистую оболочку тонкого кишечника. У крыс извлекали: кору больших полушарий (неокортекс), тимус, селезенку, печень, почку, костный мозг бедренной кости, слизистую оболочку тонкого кишечника.
Слизистая оболочка тонкого кишечника. После декапитации и вскрытия животного извлекали тонкий кишечник. Для биохимических исследований использовали участок тонкого кишечника длиной 20 см, следующий за двенадцатиперстной кишкой. Все операции с тканью проводили в емкостях, помещенных в лед. Необходимую для исследования часть кишечника сразу после извлечения из животного помещали в раствор 0,9% NaCl. Тонкий кишечник вскрывали ножницами и промывали 4 раза в 70 мл 0,9% NaCl; 5-й раз в 0,9% NaCl с 1мМ ДТТ. Соскабливание слизистой оболочки тонкого кишечника проводили с помощью двух предметных стекол на крышке чашки Петри, помещенной на лед. Полученную массу слизистой оболочки тонкого кишечника замораживали в жидком азоте.
Неокортекс. Сразу после декапитации животного вскрывали черепную коробку и извлекали головной мозг. Кору больших полушарий головного мозга снимали с помощью скальпеля на крышке чашки Петри, помещенной на лед. Неокортекс фильтровальной бумагой очищали от кровеносных сосудов и замораживали в жидком азоте.
Костный мозг. После декапитации животного извлекали плечевую (для сусликов) или бедренную (для крыс) кость, скальпелем очищали от мышечной ткани и с помощью ножниц удаляли эпифизы. Все операции проводили при температуре не выше 4С. Оставшуюся часть кости вдоль диафиза разрезали ножницами, с помощью скальпеля выделяли красный костный мозг и сразу замораживали в жидком азоте.
Тимус, селезенка, почка, печень. После декапитации и вскрытия животного извлекали тимус (для крыс), селезенку, левую почку, часть правой доли печени (около 1 гр.). С помощью фильтровальной бумаги и ножниц исследуемые органы очищали от кровеносных сосудов, жировой и соединительной ткани и замораживали в жидком азоте. 2.2 Методы исследования
Для охлаждения животных использовали метод «закрытого сосуда» в условиях гипоксии-гиперкапнии [Игнатьев Д.А. и др., 19891. Крыс выдерживали в герметичной камере объемом 5 л (рис.7) при температуре среды 1-2С в течение 3,0-3,5 ч, что в условиях нарастающей в процессе дыхания гипоксии-гиперкапнии вводило животных в состояние холодового наркоза с понижением температуры тела до 14,4-17,8С.
После помещения в обычную газовую среду крысы самостоятельно возвращались в состояние нормотермии в течение 3-3,5 ч и в последующем не обнаруживали отклонений в поведении. После охлаждения и извлечения из камеры у крыс измеряли температуру тела и ЧС
В работе использовали меченый L—[1—14С]орнитин фирмы Amersham International, дитиотрейтол, L-орнитин, Трис фирмы Sigma, пиридоксаль-5 -фосфат от Ferak, №2-ЭДТА фирмы Acros, остальные реактивы отечественного производства квалификации не ниже «х.ч».
Для определения активности ОДК ткани взвешивали, размораживали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 1 мин при 4,0С в 2-4 объёмах 0,1М Трис-HCl буфера (рН 7,5), содержащего 5 мМ дитиотрейтола, 0,5 мМ ЭДТА, и 40 мкМ предварительно нейтрализованного пиридоксаль—5 -фосфата. Гомогенат центрифугировали при 20000xg в течение 30 мин при 4С и в супернатанте определяли активность ОДК. Активность ОДК ткани по величине Vmax определяли радиоизотопным методом по освобождению 14С02 из меченого L-[l— 14С]орнитина [Janne J. et al., 1971] с некоторыми модификациями [Slozhenikina L.V. et al., 1999]. Реакцию проводили в общем объёме 0,5 мл, содержащем 0,1М трис-HCl буфер (рН 7,2), 5 мМ дитиотрейтол, 0,3 мМ ЭДТА, 0,2 мМ пиридоксаль-5 -фосфат, 0,16 мМ L-орнитин, 1,85 кБк (0,05 мкКи) Ь-[1-14С]орнитин с удельной радиоактивностью 2 ГБк/мМоль и 3-15 мг белка пробы. Для поглощения выделяющегося 14С02 использовали полоски фильтровальной бумаги Ватман Whatman 3 ММ, смоченные 50 мкл 0,4М Ва(ОН)2 в 20% NaOH. Инкубацию продолжали в течение 1 ч при 37С, реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 40% трихлоруксусной кислоты. Для каждого образца реакцию проводили в 2-х повторностях. Радиоактивность фильтров определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике SL-30 (Intertechnique, Франция). Активность фермента корректировали против нулевой пробы, вместо супернатанта добавляли аликвоту среды гомогенизации. Результаты выражали в пмоль С02х(чхмг белка)"1.
Активность ОДК в селезенке сусликов в летний период и в сезон гибернации
Результаты по распределению клеток костного мозга по фазам клеточного цикла, полученные методом проточной цитофлюориметрии, хорошо согласуются с литературными, где была сделана оценка синтетической активности костного мозга по параметру а (соотношение количества активной РНК на единицу ДНК в целой клетке). Отмечено снижение параметра а в костном мозге сусликов, находящихся в состоянии оцепенения и несколько большее значение у межбаутных активных сусликов по сравнению с активными животными в летний период. У пробуждающихся сусликов параметр а достоверно выше, чем у спящих животных [Карнаухова Н.А. и др., 2008].
Следовательно, снижение и восстановление активности фермента биосинтеза полиаминов в костном мозге совпадает с экспериментальными данными по изменению доли клеток в S-фазе клеточного цикла и с данными литературы по остановке и возобновлению митозов.
Таким образом, на протяжении всего периода гибернации в разных органах и тканях зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus показаны специфические изменения активности фермента ОДК. Из анализа результатов следует наличие положительной корреляции между ингибированием и восстановлением специализированных функций органов и тканей и соответствующими модификациями ферментативной, активности ОДК. Известно, что в ходе гибернации происходит изменение активности ряда ферментов на разных стадиях их новообразования и функционирования [Carey H.V. et al., 2003; Andrews M.T., 2007]. Биохимическая регуляция механизмов, контролирующих снижение скорости метаболизма у зимоспящих млекопитающих, включает: 1) индукцию определенных генов, несмотря на общее подавление метаболизма; 2) обратимое фосфорилирование белков, которое приводит к изменению активности ферментов или функционирования белков; 3) защиту и стабилизацию макромолекул для обеспечения быстрого выхода из торпидного состояния [Storey К.В., Storey J.M., 2004; Woods А.К., Storey K.B., 2007; Storey K.B., 2009]. Наиболее интенсивно при гибернации регулируются АТФ-зависимые клеточные процессы, например, ионный транспорт, транскрипция генов и трансляция белков. Обратимое фосфорилирование Ма /К+-АТФ-азы и Са2+-АТФ-азы снижает функционирование ионных каналов на 50% у спящих млекопитающих по сравнению с нормотермными активными животными [Storey К. В., 2009]. Подавление трансляции белков обусловлено инактивацией факторов инициации и элонгации путем их фосфорилирования. Обратимым фосфолилированием ингибируются также ферменты катаболизма углерода, например, гликогенфосф ори лаза, фосфофруктокиназа, гексокиназа, пируватдегидрогеназа. Однако на фоне общего подавления метаболизма все же сохраняется активность некоторых генов и синтез белков. Показано повышенное образование а— макроглобулина, некоторых ингибиторов сериновых протеаз, белков связывающих жирные кислоты (FABPs), ингибитора пируватдегидрогеназы; при вхождении в состояние оцепенения и на раннем этапе торпора показан синтез белков теплового шока [Andrews М.Т. et al., 1998; Carey H.V. et al., 2003; Storey K.B., 1997, 2009; Morin Jr. P., Storey K.B., 2009]. Исследование, проводимое на мозге Spermophilus lateralis, показало повышение экспрессии транскрипционных факторов (генов раннего ответа) c—fos, c—jun, jimB на поздней стадии оцепенения и при пробуждении млекопитающих [O Hara B.F. et al., 1999]. Кроме того для зимоспящих млекопитающих показана посттрансляционная модификация белков по механизму SUMO-лирования. Small Ubiquitin—like Modifier (SUMO) - это семейство белков, которые с помощью ковалентной связи обратимо присоединяются к белкам в клетке, изменяя их свойства. SUMO-лирование — модификация, которая вовлечена во многие клеточные процессы, такие как ядерно-цитозольный транспорт, транскрипционная регуляция, апоптоз, стабилизация белков, прохождение клеток по клеточному циклу, стрессовые реакции. На зимоспящих сусликах, находящихся в состоянии оцепенения, показано увеличение количества SUMO-связанных белков в мозге, печени и почках; при пробуждении число таких конъюгатов снижается [Storey К.В., 2009]. Биологический смысл SUMO-лирования, по-видимому, заключается в стабилизации белковых молекул и предотвращении их деградации в течении торпора. При пробуждении происходит разрушение комплекса белок-SUMO, что приводит к активации белковых молекул. По такому механизму, например, происходит ингибирование/активация транскрипционных факторов [Morin Jr.P., Storey К.В.,2009].
Таким образом, все вышеописанное отражает стратегию биохимической адаптации зимоспящих млекопитающих к экстремальным факторам окружающей среды. В мировой литературе высказано положение о том, что ферменты, активность которых изменяется при гибернации, принимают участие в филогенетической адаптации млекопитающих [Andrews М.Т., 2007]. Анализ результатов исследования указывает на то, что ОДК относится к числу ферментов, активность которого в органах и тканях млекопитающих специфически изменяется при гибернации. Можно предположить, что фермент биосинтеза полиаминов - ОДК - участвует в биохимической адаптации млекопитающих при естественном гипобиозе во всех исследованных органах и тканях (печень, селезенка, почки, слизистая оболочка тонкого кишечника, костный мозг), направленной на увеличение устойчивости организма. При этом регуляция активности ОДК возможна на всех уровнях: транскрипции, стабилизации мРНК, трансляции, деградации фермента.
