Введение к работе
Актуальность темы.
До настоящего времени не расшифрованы механизмы, посредством которых клетки принимают и передают внешние информационные сигналы, а также биохимические реакции, обеспечивающие преобразование сигнала.
Полипептидные гормоны и факторы роста представляют собой класс регуляторов пролиферации и диффереицировки клеток, обладающих специфическими рецепторами на плазматической мембране (ПМ) (Кусень СИ. и др., 1985; Веренинов А.А. и 1986; Ullrich et al., 1990). Помимо ведущей роли в клеточном метаболизме инсулин является важнейшим универсальным фактором клеточной пролиферации (Rechler et al., 1974; Hayashi et al., 1978; Rosengurt, 1980; King et al., 1981, 1983; Balk et al., 1982; Brodshaw et al., 1983; Kan et al., 1982; Libry et al., 1983; Sun et al., 1985; Soler et al., 1989).
Долгосрочные эффекты инсулина на внутриклеточный метаболизм хорошо невесты, и показано широкое разнообразие пострецепторных путей гормонального сигнала (Кучеренко Н.Е., 1986; Мертвецов Н.П., 1986; King et al., 1981, 1983; Lamer et al., 1982; Kahn et al., 1988, 1989; Rosen, 1989; Ullrich et al., 1990). Однако, самые ранние события, протекающие в ПМ клетки-мишени при взаимодействии инсулина с клеточным рецептором, в настоящее время недостаточно изучены. Специализированный механизм инсулин-рецепторного взаимодействия расшифрован не полностью, тем не менее неоспоримо доказано, что в нем не принимают участие известные вторичные мес-сенджеры: сАМР, кальций, иновитолтрифосфат и диацилглицерол (Берридж М.Д., 1985). Поэтому выявление плазмамембранных медиаторов, непосредственно возникающих при взаимодействии инсулина с клеточным рецептором, представляет большой интерес.
В литературе имеются сообщения о неоднородности распределения АТР как в клеточных (Jones, 1986), так и во внутриплазмамембранных (Aw et а)., 1985) комлартментах, а в трансформирующихся клетках концентрация АТР вблизи ПМ падает до нуля (Anafi et al., 1992). При исследовании ии-сулинового рецептора показано, что тироэин-киназа р-субъединицы обладает АТР-связывающим центром, по не имеет доступа к цитоплаэматическому АТР (Van Obberghen et al., 1984).
В 1979 году А.А.Карелин предположил, что в каскаде биохимических реакций, происходящих в ПМ клетки после формирования инсулин-рецепторного комплекса, должен присутствовать химический посредник и/или промежуточный эффекторный элемент, обеспечивающий трансмембранное сопряжение внешнего стимула с клеточным ответом. Экспериментально был показан быстрый - в течение первой минуты взаимодействия - синтез АТР в обогащенных плазматическими мембранами частицах (ОПМЧ) из скелетных мышц крысы при взаимодействии с инсулином (Карелин А.А., 1979, 1979(a), 1981, 1982, 1983).
Это предположение нашло свое подтверждение в серии работ группы Карелина А.А. за 1985-1993 годы по изучению феномена образования АТР при взаимодействии родственных инсулину полипептидных факторов с ПМ различных тканей-мишеней. Показано, что интактные ПМ обладают базальним синтезом АТР до 10 нмоль/мг белка - мин-!, а при действии полипептидных факторов роста уровень биосинтеза АТР увеличивался в среднем до 30 нмоль/мг белка мин~1. Этот стимулированный АТР получил название плаэмамембранного "сигнального" АТР (псАТР).
ПМ клеток нельзя выделить без контаминации другими внутриклеточными мембранами, поэтому трудно утверждать, что полученные А.А. Карелиным результаты отражают только плазмамембранные эффекты. Оставались невыясненными точная клеточная топография, природа и механизм синтеза
псАТР, а также возможное клинико-диагностическое значение определения уровня псАТР при различных заболеваниях. Эритроциты лишены внутриклеточных мембран, а их плазматическая мембрана обладает интегральными свойствами ПМ животных клеток (Blank, 1980) и имеет специфические инсу-линовые рецепторы (Gambhir, 1978, 1988). Поэтому ПМ эритроцитов были выбраны в качестве объекта исследования для изучения механизма инсулин-стимулируемого синтеза псАТР в норме и при различных патологических состояниях.
Цель исследования.
Изучить условия и возможный механизм синтеза плазматическими мембранами эритроцитов человека плазмамембранного АТР после взаимодействия инсулина со специфическими рецепторами.
Задача исследования.
-
Экспериментально установить адекватность объекта исследования -плазматической мембраны эритроциты человека - для изучения плазмамембранного инсулинстимулируемого синтеза АТР.
-
Изучить роль плазматической мембраны эритроцита в синтезе плазмамембранного АТР.
-
Определить условия, необходимые для биосинтеза АТР плазматическими мембранами эритроцитов и выбрать оптимальные значения концентрации инсулина, температуры и длительности инкубации.
-
Изучить роль ионов (Н+ и Na+) в процессе биосинтеза АТР плазматическими мембранами эритроцитов человека при специфическом взаимодействии инсулина с рецепторами.
-
Изучить возможность сопряжения инсулинстимулируемого синтеза АТР и функционирования редокс-цепи плазматических мембран эритроцитов (с использованием техники ингибнторного анализа).
6) Провести сравнительное изучение биосинтеза плаэмамембранного "сигнального" АТР плазматическими мембранами эритроцитов здоровых доноров и больных с различными видами патологических состояний, отягощенных интоксикационным синдромом.
Научная новизна работы.
В представленной работе впервые изучены условия и возможный механизм биосинтеза плаэмамембранного "сигнального" АТР в процессе взаимодействия инсулина с рецепторами плазматических мембран эритроцитов, что имеет важное значение для понимания ранних (первая минута) изменений, протекающих в клеточной мембране.
Доказано существование инсулинстимулируемого биосинтеза плаэмамембранного "сигнального" АТР из ADP и неорганического фосфата в условиях аэробного NAD-H-зависимого окисления, сопряженного с переносом ионов через ПМ эритроцита человека.
Впервые с помощью ингибиторного анализа удалось установить сопряжение функционирования редокс-цепи и синтеза псАТР в ПМ животной клетки. Изучена роль ионов Н+ и Na+ в процессе биосинтеза АТР. Показано, что при разрушении протонного градиента высокими концентрациями FCCP (10-4-Ю-Зм) и при удалении Na+ионов из среды инкубации происходит полное исчезновение наблюдаемого накопления АТР.
Показано, что ПМ эритроцита человека сохраняет способность синтезировать псАТР у больных с интоксикационным синдромом при различных патологических состояниях, однако уровень биосинтеза псАТР у больных значительно ниже, чем у здоровых доноров.
Практическая ценность диссертации.
Изучен возможный механизм инсулинстимулируемого биосинтеза плаз-мамембранного "сигнального" АТР ПМ эритроцита, как вероятного универсального низкомолекулярного мессенджера при трансмембранной передаче внешнего полипептидного сигнала внутрь клетки.
Предложен клинико-диагностический тест на определение эффективности процедуры лечебного плазмафереза у больных с интоксикационным синдромом по измерению уровня биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов.
Апробация работы.
Основные положения и материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988); на VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментных процессов" (Петрозаводск, 1988); на 19й конференции ФЕБО (Рим, Италия, 1989); на Всесоюзном совещании "Молекулярные механизмы энергетического обмена" (Пущино, 1990); на Всесоюзной школе "Биологические мембраны" (Пущино, 1990); на Всесоюзной школе-конференции "Проблемы мембраной биоэнергетики" (Пущино, 1991); на симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, 1993); на симпозиуме "Неспеци-фическиЙ аорто-артериит с поражением ветвей дуги аорты и висцеральных ветвей брюшной аорты" (Ташкент, 1993), на Первой конференции Московского общества гемафереза" (Москва, 1993), на симпозиуме "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, 1993).
Публикации.
Основные материалы диссертации опубликованы в центральных журналах и сборниках в 8 печатных работах.
2-750І
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 116 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4х глав, отражающих методы и результаты собственного исследования, обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка литературы. Основной материал иллюстрирован 20 таблицами и 22 рисунками. Литературный указатель включает 5І, отечественных и 3*7 зарубежных публикаций. Работа выполнена в клинико-биохимической лаборатории Института хирургии им А.В.Вишневского РАМН, руководитель - профессор, доктор биологических наук А.А.Карелин.
