Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
Глава 1 Физиологические и биохимические аспекты токсического действия тяжелых металлов и его модификация биологически активными соединениями у высших растений 7
1.1.1 Роль тяжелых металлов в жизни живых организмов 7 '
1.1.2 Механизмы детоксикации тяжелых металлов 10
1.2.1 Участие регуляторов роста в формировании ответных реакций растений на действие тяжелых металлов 16
1.2.2 Влияние регуляторов роста на аккумуляцию тяжелых металлов 29
2 Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1 Объекты исследования 40
2.2 Постановка опытов 40
2.3 Оценка параметров роста растений 41
2.4 Оценка частоты аберраций хромосом в анафазе-телофазе митоза в клетках корневой меристемы Allium fistulosum 42
2.5 Морфометрическое определение количества и размера ядрышек 43
2.6 Определение содержания фитогормонов в растениях 44
2.7 Анализ содержания свободных аминокислот в растениях 45
2.8 Определение локализации кадмия в тканях растений при действии биорегуляторов с использованием гистохимического метода 46
2.9 Оценка содержания кадмия в растениях методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии 47
2.10 Оценка экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса 48
2.11 Статистическая обработка результатов 49
3 Результаты исследований и их обсуждение
Глава 3. Биохимические и физиолого-генетические аспекты действия стифуна на культурные растения 50
3.1 Влияние стифуна на морфометрические параметры растений 51
3.2 Цитологический анализ ростовых процессов при действии стифуна 52
3.3 Влияние стифуна на баланс фитогормонов растений пшеницы 56
3.4 Морфологические характеристики ядрышек меристематических клеток пшеницы при действии стифуна 61
3.5 Содержание свободных аминокислот у растений пшеницы при действии стифуна 64
3.6 Влияние стифуна на цитогенетические показатели клеток корневой меристемы
лука-батуна 69
Глава 4 Протекторные свойства стифуна в условиях кадмиевого стресса : 78
4.1 Морфометрические параметры растений при применении биорегуляторов в условиях токсического действия кадмия 78"
4.2 Стабилизирующее действие стифуна на митотическую активность клеток пшеницы и параметры ядрышек при действии ацетата кадмия 81
4.3 Цитогенетическая оценка действия кадмия на растениях лука-батуна при применении регуляторов роста 85
4.4 Гормональный статус растений пшеницы при применении стифуна в условиях стрессового действия кадмия 101
4.5 Гистохимическая оценка распределения кадмия в тканях растений кукурузы и риса при действии регуляторов роста 106
4.6 Аккумуляция кадмия у растений кукурузы, пшеницы, риса при применении регуляторов роста : 114
4.7. Влияние регуляторов роста на экспрессию гена фитохелатинсинтазы (PCS1)
риса при действии ацетата кадмия 120
Заключение 124
Выводы 126
Список литературы 127
- Роль тяжелых металлов в жизни живых организмов
- Объекты исследования
- Влияние стифуна на морфометрические параметры растений
- Морфометрические параметры растений при применении биорегуляторов в условиях токсического действия кадмия
Введение к работе
Актуальность. К настоящему времени накоплен большой объем информации о фитотоксическом действии тяжелых металлов (ТМ) [Феник и др., 1995; Барсукова, 1997; Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999; Hall, 2002]. В связи с широким распространением в биосфере ТМ в результате естественных природных процессов и антропогенной деятельности актуален поиск средств, уменьшающих как негативное действие ТМ на рост культурных растений, так и их накопление в растениеводческой продукции. Следует отметить значительный рост в последние годы количества публикаций, в которых обсуждается возможность модификации действия тяжелых металлов на культурные растения при применении регуляторов роста [Башмаков 2002; Лукаткин и др., 2003; Kaur, Bhardwaj, 2003; Серегина, 2004; Ульяненко и др., 2004; Janeczko et al., 2005; Drazic et al., 2006; Sharma, Bhardwaj, 2007 и др.]. Установлены протекторные свойства регуляторов роста растений в условиях токсического действия ТМ, при применении некоторых из них выявлено уменьшение накопления тяжелых металлов. С другой стороны применение ряда соединений в условиях действия ТМ может напротив приводить к усилению накопления и/или токсического действия металлов на растения. Таким образом, исследование механизмов действия регуляторов роста растений в условиях стресса, вызываемого ТМ, в настоящее время является актуальным.
В Институте биохимии и генетики УШД РАН разработан препарат стифун
- регулятор роста растений с антистрессовой активностью на основе
метаболитов растений семейства злаковых [Патент РФ № 2076603, 1997].
Показано, что стифун обладает ростстимулирующим действием, выраженными
фунгицидными свойствами, способностью повышать устойчивость растений к
водному дефициту и хлоридному засолению [Яхин, 1999; Yakhin et al., 1998,
1999,2000].
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — исследование механизмов действия стифуна и его протекторных свойств в условиях кадмиевого стресса. Были поставлены следующие задачи:
оценить влияние стифуна на процессы деления и растяжения клеток, морфологические характеристики ядрышек меристематических клеток, содержание свободных аминокислот, эндогенных фитогормонов АБК, ИУК и различных форм цитокининов у растений пшеницы;
провести цитогенетический анализ действия стифуна на растениях Allium
5 fistalosum;
исследовать ответные реакции растений пшеницы в условиях действия токсических концентраций ацетата кадмия при применении стифуна, оценивая влияние на морфометрические параметры, митотическую активность и элонгацию клеток, содержание фитогормонов, а также провести цитогенетическую оценку действия кадмия (Cd) при применении данного регулятора роста на растениях лука-батуна;
изучить влияние стифуна на распределение кадмия в' тканях и его аккумуляцию у растений кукурузы, пшеницы, риса;
- оценить влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса PCS J
при действии кадмия.
Научная новизна. Результаты исследований вносят вклад в понимание механизмов действия регулятора роста растений стифуна. Активация роста растений под его влиянием обусловлена усилением интенсивности деления и растяжения клеток. Важную роль в проявлении рострегулирующего действия стифуна играет изменение содержания цитокининов - изопентениладенозина, зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида. В условиях токсического действия ацетата кадмия применение стифуна и эпина-экстра приводит" к уменьшению уровня хромосомных нарушений, стифун стабилизирует митотическую активность растительных клеток. Стифун и эпин-экстра уменьшают поглощение кадмия у растений кукурузы, пшеницы, риса. Снижение содержания кадмия в побегах риса под влиянием стифуна при экспозиции проростков на растворе ацетата кадмия сопровождается меньшей экспрессией гена фитохелатинсинтазы PCS1.
Практическая значимость работы. Выявлена способность биорегуляторов стифуна и эпина-экстра повышать устойчивость культурных растений к токсическому действию кадмия и уменьшать его аккумуляцию в растениях. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 2-й Всеукраинской конференции молодых ученых (Харьков, 2001), Международной конференции «Стедентська молодь і науковий прогрес в АПК» (Львов, 2001), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002), X международном конгрессе ШРАС (Basel, 2002), XIII конгрессе FESPB (Heraclion, 2002), конференции «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), международной научно-практической конференции «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (Уфа, 2003), V и VI съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007),
б
II международной конференции «Онтогенез растений в природных и измененных условиях окружающей среды: физиологические, биохимические и экологические аспекты» (Львов, 2004), международной научной конференции «Фитопатогенные бактерии. Фитонцидология. Аллелопатия» (Киев, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), IV международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень, рекомендуемый ВАК РФ. Структура и объем работы. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 283 наименования.
Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю к.б.н. Олегу Ильдусовичу Яхину за постоянное внимание при проведении экспериментов и ценные замечания при написании рукописи и публикаций, особую благодарность за' консультации и ценные замечания научному консультанту д.б.н. проф. Чемерису А.В., особую благодарность за методическую помощь при проведении ряда экспериментов к.б.н. И.А. Яхину, к.б.н. Р.А. Фатхутдиновой, н.с. Постриганю Б.Н., к.б.н. Т.Н. Архиповой, д.б.н. проф. Кругловой Н.Н., за постоянное внимание к работе к.б.н. Гилязетдинову Ш.Я., д.б.н. проф. Шакировой Ф.М., д.б.н. проф. Вахитову В.А.
Роль тяжелых металлов в жизни живых организмов
Химические элементы с атомной массой свыше 50 (плотность более 5.0 г/см ), обладающие свойствами металлов или металлоидов, относят к тяжелым металлам (ТМ). Многие металлы играют значимую роль в регуляции метаболизма растений. Они необходимы для активации различных ферментов, принимающих участие в важных биохимических и физиологических процессах, в том числе фотосинтеза и дыхания, минерального питания, процессах синтеза, роста и развития. Например, для цитохромов, пероксидазы, каталазы, ферредоксина необходимым элементом является железо (Fe), фосфотрансферазы, пируваткарбоксилазы, пируваткиназы — магний (Mg), нитратредуктазы - молибден (Мо), аскорбатоксидазы - медь (Си). Цинк (Zn) присутствует во всех 6 классах ферментов, и является структурным элементом в факторах транскрипции [Broadley et al., 2007; Guerinot, Eide, 1999 цит. по Roelofs et al., 2007]. Mg занимает центральное положение в порфириновом ядре хлорофилла. Большое количество Fe, Mg,- Zn, Си содержат хлоропласты растений, в состав митохондрий входят К, Са, Mg. Такие металлы, как, например, Си, Мп и Zn являются необходимыми для функционирования рецепторов фитогормонов [Романов, 2002; Napier, 2004]. Это лишь краткое перечисление возможных функций металлов, тем не менее, из которого следует, что металлы имеют большое значение в метаболизме живых организмов. Рассмотренные выше металлы исследователи относят к эссенциальным элементам. В то же время выделяют металлы, которые не являются необходимыми для живых существ — неэссенциальные. Как эссенциальные, так и неэссенциальные элементы могут оказывать токсическое действие на живые организмы, к таким ТМ относят кадмий (Cd), медь (Си), никель (Ni), ртуть (Hg), свинец (РЬ), цинк (Zn), хром (Сг), кобальт (Со) и др. Негативные эффекты ТМ на растения обусловлены их концентрацией, биодоступностью, зависящей от рН среды, присутствия различных органических соединений, окислительно-восстановительного потенциала, температуры и концентрации других элементов [Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999; Серегин, Иванов, 2001]. Следует отметить, что некоторые элементы, такие как алюминий (А1) и мышьяк (As) не относятся по своим характеристикам к типичным ТМ, но часто их токсические эффекты на растения рассматривают наряду с действием ТМ [Jentschke, Godbold 2000; Довгалюк и др., 2001 a; Sharma, Dietz, 2006]. Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами привлекает все больше внимания в последние несколько десятилетий [Elayeb et al., 2006]. Атмосфера, почвы, воды загрязняются ТМ в результате естественных природных процессов, а также антропогенной деятельности [Ильин, 1991; Алексеенко и др., 1992; Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999]. Объемы техногенного поступления ТМ возрастают за счет промышленных выбросов в биосферу, что особенно актуально для крупных городов [Ильин, 1991; Шихова, 1997; Гладков, 2007]. Опасность ТМ заключается в том, что они надолго входят в круговорот органического вещества [Лукаткин и др., 2007].
Накапливаясь в растениях до определенного момента ТМ могут не оказывать угнетающего действия на растения и не вызывать токсических симптомов, но их концентрации могут достигнуть уровней, которые являются токсичными для млекопитающих [Herren, Feller, 1997; Головатый и др., 2000]. У млекопитающих при хроническом воздействии ТМ могут проявлять канцерогенные, генотоксические и цитотоксические эффекты [Джохадзе, Лежава, 1994; Hartvig, 1995; Гераськин и др., 1996; Привезенцев и др., 1996; Valverde et al., 2001; Celik et al., 2005]. Так,, мутагенное действие ионов Cd2+ может быть связано с дестабилизацией спирали ДНК и изменением регуляции работы отдельных генов [Гераськин и др., 1996]. Исследователи предполагают, что индукция генотоксичности и канцерогенности Cd и РЬ может быть вызвана не прямыми взаимодействиями металлов с молекулой ДНК, а опосредована окислительным стрессом за счет увеличения уровня свободных радикалов под влиянием металлов [Hartvig, 1995; Valverde et al., 2001]. В то же время исследователи отмечают, что ТМ могут непосредственно взаимодействовать с ДНК, и ферментами, вовлеченными в метаболизм ДНК, в частности, ТМ могут ингибировать ферменты репарации [Гераськин и др., 1996; Привезенцев и др., 1996; Серегин, Иванов, 2001]. Металлы способны индуцировать аберрации хромосом в эритроцитах и лимфоцитах млекопитающих, увеличивать количество микроядер в эритроцитах, что может свидетельствовать об индукции однонитевых разрывов ДНК [Berces et al., 1993; Джохадзе, Лежава, 1994; Привезенцев и др., 1996; Celik et al., 2005].
Следует отметить, что ТМ могут оказывать как токсическое, так и стимулирующее действие на живые организмы [Титов и др., 2007]. Стимуляция ростовых процессов ТМ на начальных этапах роста не является феноменом и представлена во многих работах исследователей. Так, в корнях кукурузы, выращенной 3 ч в присутствии 20 и 250 мкМ Cd, наблюдалась стимуляция роста (на 12.5% и 6.6%, соответственно) [Wojcik, Tukendorf, 1999]. Замачивание растений гороха в растворах CdCb (10"4-10 5 М) стимулировало энергию прорастания, всхожесть семян и начальные этапы роста [Мельничук, 1990]. Механизм стимулирующего действия Cd по данным исследователей заключался в активации синтеза РНК и белка в период Gi-фазы первого клеточного цикла меристемы корня гороха, в результате чего происходило синхронное вступление большего числа клеток в первый митоз. По мнению исследователей, активирующее действие Cd на ранних этапах прорастания было связано с изменением баланса эндогенных гиббереллинов, в частности за счет перехода связанных гиббереллинподобных веществ в свободное состояние, которые стимулируют синтез полиаминов [Мельничук, 1990]. На культуре клеток млекопитающих было показано, что очень низкие концентрации Cd (до 100 пМ) существенно стимулировали рост клеток и синтез ДНК, тогда как более высокие концентрации (1 мкМ) - ингибировали рост клеток [Von Zglinicki et al., 1992]. Несмотря на то, что Cd является одним из наиболее токсичных ТМ [Lesko et al., 2002; Zengin, Munzuroglu, 2006], исследователи, основываясь на выявленном факте экспрессии Cd-специфичной карбоангидразы, которая особенно в условиях дефицита цинка может замещать Zn-содержащий фермент TWCA1 при реализации его механизма концентрирования углерода, обсуждают его возможную биологическую роль в карбоангидразе морской диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii [Lane, Morel, 2000].
Объекты исследования
Семена растений промывали водой, стерилизовали в 70%-ном этаноле в течение 1—2 мин, промывали дистиллированной водой до исчезновения запаха спирта и использовали для посева. В работе использовались различные способы применения биорегуляторов: обработка семян или проростков пшеницы, кукурузы, риса их водными растворами в течение 60, 120 мин, проращивание семян в чашках Петри на фильтровальной бумаге, увлажненной раствором биорегулятора в течение 2, 3, 4 сут при 24 С - 27С, выращивание растений в водной культуре в течение 14 сут на плотиках из пробкового материала с отверстиями, на которые размещали проклюнувшиеся семена, предварительно. проращенные в термостате в течение 24 часов при температуре 24С. Применение ацетата кадмия включало экспозицию растений на его растворах в течение 2,-3, 4, 5 сут. При установлении зависимости «время-эффект» перед экспозицией на растворе ацетата кадмия 2 сут растения лука-батуна обрабатывали биорегуляторами в течение 1 ч, в экспериментах «доза-эффект» использовали экспозицию на растворе биорегулятора, а также совместную экспозицию с ацетатом кадмия. 2.3 Оценка параметров роста растений Оценивали линейные размеры, сырую и сухую массу корней и побегов, проводили цитологический анализ процессов деления и растяжения клеток.
Митотическую активность меристематических клеток растений оценивали по методике [Паушева, 1988]. Кончики корней срезали вместе с корневым чехликом длиной до 2 мм, вскрывали колеоптили и извлекали первичный лист. Меристематические ткани растений фиксировали в фиксаторе Кларка, через сутки их отмывали в проточной водопроводной, а затем в дистиллированной воде и помещали для хранения в 70% этанол. Образцы отмывали от этанола в 3-х водах по 5 минут, отделяли зону деления у корешков. Образцы (конус нарастания первичного листа и участок зоны деления корешков) помещали в эппендорфы (2 мл) с 5%-ной смесью пектиназы и целлюлазы (1:1) в термостат при температуре 37С. Затем ферменты разбавляли водой, центрифугировали на микроцентрифуге (type-320a, Poland) в течение 6 минут, супернатант удаляли, к осадку добавляли 3-4 капли 45% уксусной кислоты. Из приготовленного материала готовили давленые препараты. На предметное стекло наносили каплю материала из эппендорфов, добавляли 2 капли кармина, приготовленного на 45% -ной уксусной кислоте, и помещали в термостат при 37С на 3-4 минуты. После этого, накрывали покровным стеклом (18x18 мм) и просматривали под микроскопом Amplival («Carl Zeiss», Германия) при различных увеличениях. Площадь клеток, закончивших рост в зоне растяжения корней пшеницы рассчитывали на основании замеров их длины и ширины с помощью окуляр-микрометра МОВ-1х15 не менее чем в 500 клетках. Фиксация, мацерация и приготовление временных давленых препаратов для определения площади клеток в зоне растяжения проводились так же, как и для подсчета МИ. Окрашивание проводили красителем «лихтгрюн».
Митотическую активность меристематических клеток корней лука-батуна определяли по методике [Методические рекомендации..., 1992]. 2-х сут проростки фиксировали через 18, 36 и 54 ч после обработки биорегуляторами и экспозиции на кадмии для изучения зависимостей «доза-эффект» и «время-эффект». Растения для фиксации помещали в пенициллиновые флаконы, содержащие фиксатор Кларка на 24 ч при температуре 4С. После этого их отмывали от фиксатора в проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной. Образцы хранили в 70%-этаноле при температуре 4 С. Гидролиз материала после отмывания от спирта проводили в 3 н НС1 при комнатной температуре в течение 20 минут, далее трижды тщательно отмывали корешки от кислоты и переносили в 45%-ю уксусную кислоту на 10 минут, затем на 30 минут и снова, сменив кислоту, - на 3 часа. Кислоту сливали и помещали материал на окрашивание в реактив Шиффа на 30 минут, промывали в воде и готовили временные давленые или постоянные препараты из зоны меристемы корней лука. Приготовленные препараты меристематических клеток лука-батуна использовали для оценки митотического индекса (МИ), фазового индекса (ФИ), а также уровня хромосомных нарушений (раздел 2.4). МИ считали по формуле [Методические рекомендации, 1992]:
Влияние стифуна на морфометрические параметры растений
Как было показано ранее, стифун рекомендован для применения в растениеводстве в качестве регулятора роста растений с антистрессовой активностью при подобранной по совокупности оптимальной ростстимулирующей и фунгицидной активности концентрации 33 мг/л, способ обработки - предпосевная обработка семян [Яхин и др., 1999]. На первом этапе наших исследований на растениях пшеницы при другом способе обработки -экспозиции на растворах стифуна был выявлен стимулирующий эффект в широком диапазоне концентраций 0.033-330 мг/л, проявлявшийся в увеличении линейных размеров, сырой и сухой массы (табл. 1). Следует отметить, что у 2 сут растений четко выделялась одна наиболее эффективная в стимуляции всех ростовых показателей концентрация 0.033 мг/л. Мы не выявили узко специфического стимулирующего влияния у стифуна на рост побегов и корней. Балуева Н.П. [2000] классифицировала подобное действие биорегуляторов эмистим, агат-25К, крезацин, активирующее рост как корней, так и надземной части растений, как универсальное. Рострегулирующее действие стифуна может быть обусловлено стимуляцией ростовых процессов за счет активации деления и растяжения клеток, в связи с чем задачу следующего этапа исследований составил цитологический анализ роста проростков пшеницы при действии стифуна. Митотическая активность меристематических клеток корней пшеницы в динамике после обработки 2 сут растений стифуном (33 мг/л) - Статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (Р 0.05) Исследователи отмечают важность дифференцированного учета отдельных фаз и их соотношения в митозе, что позволяет судить об изменении соотношения фаз митоза, длительности той или иной фазы, и выявлять специфичность реакции каждой фазы к действию различных агентов [Араратян, 1989]. Известно, что увеличение МИ может происходить как за счет вступления в деление большого числа клеток, так и в результате блокирования фаз митоза [Методические рекомендации, 1992; Нефедьева, Хрянин, 2000]. Так, ингибирующее действие ИУК (10"7 М) на корнях арабидопсиса сопровождалось повышенным количеством меристематических клеток на стадии метафазы митоза [Kim et al., 2001].
Влияние различных концентраций стифуна на соотношение фаз митоза в клетках меристемы корней пшеницы сорта Жница через 48 ч от начала замачивания в растворах биорегулятора
Анализ соотношения фаз митоза (рис. 3) показал, что при действии различных концентраций стифуна, в том числе и повышающих митотическую активность меристематических клеток корней пшеницы, соотношение фаз по сравнению с контролем существенно не изменялось, что может свидетельствовать об отсутствии нарушений митоза биорегулятором. В работе Клицов и др. [2000] повышение митотического индекса клеток корневой меристемы озимой пшеницы при действии фузикокцина выше уровня контроля не сопровождалось изменением длительности фаз митоза. Как для фузикокцина, так и для гексафлората было показано, что повышение митотической активности меристематических клеток при действии биорегуляторов не сопровождалось изменениями в распределении клеток по фазам митоза, в свою очередь эмистим не влиял на пролиферативную активность клеток меристемы [Артемьева, 1997]. При оценке влияния различных факторов на процесс растяжения клеток корней могут возникать методические трудности, так как должна измеряться площадь клеток, закончивших рост растяжением, а при действии таких факторов может происходить значительное ингибирование или стимуляция роста, в результате возникает проблема идентификации зоны, из которой нужно брать для анализа клетки. Следует отметить, что в ряде работ при исследовании влияния физиологически активных соединений на ростовые процессы, наряду с анализом митотической активности оценивали площадь клеток [Безрукова и др., 2002; Shakirova et al., 2003; Кильдибекова и др., 2004]. Важно, что увеличение линейных размеров при действии этих соединений, стифуна не было драматическим. При применении стифуна наблюдалось увеличение площади клеток зоны растяжения корней 2 сут проростков пшеницы в концентрациях 0.033 - 330 мг/л за счет их растяжения в длину (рис. 4). При изучении действия агглютинина зародыша пшеницы (АЗП) на Т. aestivum в условиях засоления исследователями было показано, что при засолении происходило уменьшение площади клеток, в то время как обработка АЗП восстанавливала рост клеток в зоне растяжения [Кильдибекова и др., 2004]. Предварительная обработка салициловой кислотой семян приводила к стимуляции роста проростков мягкой пшеницы, выражавшейся в увеличении клеточных делений и площади клеток зоны растяжения за счет элонгации клеток корня [Shakirova et al., 2003].
Влияние стифуна на площадь клеток зоны растяжения корней проростков пшеницы сорта Жница через 48 ч от начала замачивания в растворах биорегулятора. - Статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (Р 0.05)
Таким образом, рострегулирующее действие стифуна может быть обусловлено стимуляцией ростовых процессов за счет. активации деления и растяжения клеток. Следует отметить, что, в частности, у фузикокцина было выявлено сочетание эффекта ауксина (вызывающего усиление растяжения клеток) и цитокинина (стимулирующего деление клеток), обнаруживающего сходство с гиббереллином [Артемьева, 1997]. Учитывая, что эндогенные фитогормоны играют ключевую роль в регуляции роста растений, далее мы исследовали влияние стифуна на их баланс у растений пшеницы.
Морфометрические параметры растений при применении биорегуляторов в условиях токсического действия кадмия
При оценке влияния биорегуляторов на морфометрические параметры растений в условиях токсического действия ацетата кадмия на растениях пшеницы выявлено, что стифун предотвращал ингибирование линейных размеров побегов и корней пшеницы сорта Жница на 19% и 55%, соответственно (табл. 4, 5). Для сырой и сухой массы наблюдалось возрастание по сравнению с действием кадмия на 14% и 12% (побеги), и 29% и 19% (корни), соответственно (табл. 4). Индекс устойчивости, измеряемый как отношение массы растения в опыте (поллютант присутствует) к массе растения в контроле [Барсукова, 1997] у 3-х сут растений пшеницы при действии кадмия и стифуна в условиях токсического влияния кадмия составил, соответственно, 0.70 и 0.81. При оценке потенциала устойчивости растений пшеницы на ранних этапах развития к присутствию ионов кадмия в среде Барсуковой выявлено, что индекс устойчивости растений может варьировать от очень низкого (0.21) до супервысокого (1.2) [Барсукова, 1997]. При концентрации ацетата кадмия 378 мкМ снижалась оводненность растений. Стйфун предотвращал снижение оводненности в проростках на 22%. В этой постановке опытов мы использовали также эпин-экстра (д.в. эпибрассинолид). Эпин-экстра в выбранной нами концентрации проявил тенденцию к снижению ростингибирующего действия высокой концентрации кадмия на морфометрические параметры и массу проростков пшеницы (табл. 5). Индекс устойчивости при действии эпина-экстра составил 0.79.
В другой постановке опытов предотвращение ингибирующего действия ацетата кадмия стифуном составило 19% и 9% при измерении длины побегов, 44% и 20% на 2 сортах пшеницы (Жница и Ирменка), соответственно (табл. 5). Сырая и сухая массы побегов- и корней при действии стифуна были больше по сравнению с действием только кадмия на 22% и 14%, 33% и 21% (Жница), 16% и 9%, 20% и 21% (Ирменка) (табл. 5). Оводненность проростков была выше на 28% и 19% (Жница и Ирменка, соответственно) по сравнению с действием только кадмия. Стйфун увеличивал индекс устойчивости в условиях токсического действия кадмия на 17% (Жница) и 11% (Ирменка). Эпин-экстра увеличивал длину, сырую, сухую массу на 26%, 17%, 10% (побеги) и 22%, 20%, 8% (корни) - на сорте Жница и на 12%, 14%, 7% (побеги) и 17%, 2%, 4% (корни) - на сорте Ирменка по сравнению с действием кадмия (табл. 5). Применение эпина-экстра при действии кадмия предотвращало уменьшение оводненности, вызванное кадмием на 20% (Жница) и 16% (Ирменка).
Стифун и эпин-экстра на растениях кукурузы также способствовали уменьшению ингибирующего влияния ацетата кадмия как в вариантах с пшеницей. В литературе известен ряд фактов, указывающих на протекторное действие брассиностероидов в условиях токсического действия ТМ. Так, реорганизация митотического аппарата клеток брассиностероидами может приводить к восстановлению нормального роста растений [Catterou et al., 2001]. При применении эпина на яровой пшенице сорта Лада в условиях действия 5 и 50 мг/кг почвы кадмия, происходило стабилизирующее действие на формирование продуктивности и структуру урожая [Серегина 2004]. Опрыскивание раствором 28-гомобрассинолида проростков Cicer arietinam (L.) предотвращало уменьшение сырой и сухой массы растений, количества клубеньков, вызываемых действием хлорида кадмия [Hasan et al., 2008].
Для оценки протекторных свойств стифуна в условиях кадмиевого стресса мы использовали концентрацию кадмия 1 мМ (рис. 10 и 11). Стифун при ингибирующем действии кадмия увеличивал МИ клеток корневой меристемы пшеницы до уровня контроля, при этом следует отметить, что МИ при действии кадмия был меньше на 20% по сравнению с контролем, а при действии только стифуна в данной концентрации МИ возрастал на 13% (рис. 10 А). Стифун стабилизировал фазовый индекс до уровня контроля при негативном действии кадмия, особенно сильно уменьшая долю профазных клеток и увеличивая - телофазных, при этом биорегулятор не вызывал изменений в соотношении фаз митоза по сравнению с контролем (рис. 10 Б). При действии ацетата кадмия возрастало число клеток на стадии профазы. Ионы кадмия блокируют деления, по-видимому, вследствие нарушения цитокинеза [Мельничук, 1990]. Формирование профазно — метафазного блока косвенно может свидетельствовать о замедлении прохождения митоза [Довгалюк и др., 2001] в результате чего задерживается переход к анафазе [Бессонова, 1991]. Исследователи связывают увеличение количества профаз с формированием своеобразной защитной реакции, обусловленной необходимостью избегания повреждений, связанных с нарушением ахроматинового веретена [Садовниченко и др., 2002]. Увеличение доли клеток в профазе может рассматриваться как адаптивная реакция апикальной меристемы корня на стрессовое воздействие поллютантов, направленная на компенсацию гибели клеток в результате патологических митозов и тем самым на поддержание пролиферативного пула клеток [Буторина и др., 2000]. Таким образом, стифун стабилизировал митотическую активность в условиях кадмиевого стресса практически до уровня контроля.
Похожие диссертации на Механизмы действия регулятора роста растений стифуна и его протекторные свойства в условиях кадмиевого стресса
