Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы
1.1. Окислительный стресс и антиоксиданты
1.2. Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры .
2. Материалы и методы
2.1. Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro.
2.2. Способы индукции окислительного стресса
2.3. Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС .
3. Результаты и обсуждение
3.1. Морфологическая характеристика клеточной культуры PC12, дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGFb.
3.2. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF .
Заключение
Выводы
Список литературы
- Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры
- Способы индукции окислительного стресса
- Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС
- Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF
Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры
Механизм развития окислительного стресса, а также оценка нейропротекторного действия резличных препаратов, изучается на различных биологических объектах как в экспериментальных исследованиях на различных животных (таких как нокаутированные мыши, крысы), а также на многочисленных клеточных культурах, включая первичные культуры нейронов, имеющие свойства стволовых клеток. Исследование гипоксических/ишемических повреждений мозга крыс осложняется тем, что после гипоксического/ишемического эпизода у животных, как правило, не выявляется неврологической симптоматики, что затрудняет как сопоставительную оценку метаболических нарушений, так и эффективности нейрофармакологических препаратов. Комбинация гипобарической гипоксии, отягощенной нарушением энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3-нитропропионовой кислоты (3-НПК), приводит к более выраженным нарушениям двигательной активности и выявлению характерной неврологической симптоматики. Введение карнозина повышало активность митохондриальной супероксиддисмутазы и предотвращало развитие окислительного стресса в ткани мозга, что коррелировало с улучшением неврологической симптоматики, снижением смертности и восстановлением двигательной активности, а также с улучшением процессов памяти животных. (Boldyrev et al, 1996; Stvolinsky et al, 2000).
Глобальная (3-х сосудистая) ишемия головного мозга, отягощенная систематическим введением 3-НПК, позволила выявить выраженную неврологическую симптоматику, коррелирующую со значительными метаболическими сдвигами и высокой смертностью животных. Курсовое введение карнозина в постишемическом периоде на фоне 7-14 дневной реперфузии защищает мозг от окислительных повреждений, что сопровождается снижением неврологической симптоматики и смертности животных (Федорова Т.Н. и др., 2002).
Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснять молекулярные механизмы этого процесса, одним из таких подходов является использование линии животных, для метаболизма которых характерен стационарно высокий уровень АФК, приводящий к ускоренному накоплению старческих признаков и уменьшению продолжительности жизни (Hosokawa M., 2002; Bulygina E. et al. 1999). Эта уникальная линия животных, выведенная путем близкородственного скрещивания, носит название SAM (Senescence Accelerated Mice - клон Prone (SAMP) и контрольная к ней линия SAMR1 (Resistant), выведенные из одной и той же линии JR/K путем близкородственного отбора) (Takeda et al., 1994).
Характерной особенностью животных этой линии является то, что они нормально развиваются до 4-месячного возраста, после чего наступает стадия ускоренного накопления старческих признаков. В их мозге активирована МАО В и подавлена активность СОД, причем это подавление связано с повреждением как цитозольной Cu/Zn-содержащей СОД, так и (главным образом) Mn-содержащей (митохондриальной) СОД, в то время как активность пероксисомальной Cu/Zn-содержащей СОД не отличается от этого показателя у мышей контрольной линии. Таким образом, в мозге этих мышей был выявлен дисбаланс между образованием и нейтрализацией АФК, приводящий к окислительному стрессу.
Получены новые данные о патогенезе нейродегенерации при исследовании этой уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone). Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение МРТР. Установлено, что у мышей SAMP1 после введения МРТР имеют место выраженные нейрохимические нарушения, сопровождающиеся развитием окислительного стресса в мозге. Нарушение поведенческих реакций в результате воздействия МРТР свидетельствует о возникновении повреждений в области черной субстанции и в связанной с ней дофаминергической системе мозга (Сорокина Е.В., 2003) .
Окислительный стресс и его патофизиологические проявления в ткани мозга быстростареющих мышей с экспериментальным паркинсонизмом предотвращается курсовым введением карнозина, препятствующего угнетению двигательной активности животных и развитию мышечной ригидности. Нейропротекторный эффект карнозина позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, а также защищать белки и липиды от окислительной модификации (Сорокина Е.В. и др., 2003; Багыева Г.Б., 2009). Гранулярные клетки мозжечка. Изучение повреждения нервной ткани в результате окислительного стресса часто проводят на гранулярных клетках мозжечка, потому что являются самой большой гомогенной нейрональной популяцией мозга млекопитающих. Исследования, проводимые на гранулярных клетках мозжечка, выявляют механизмы и факторы способствующие выживанию или гибели гранулярных клеток мозжечка, молекулярные основы взаимоотношений на уровне генной экспрессии, которую играют некоторые нейротрофические факторы, а также NMDA подтип глутаматных рецепторов (Joe N,2013; Frilot C 2nd et al., 2013) Роль некоторых ключевых генов семейства Bcl, некоторых киназ и транскрипционнох факторов продолжает изучаться на этой культуре и появляются всё новые и новые данные, открывающие новый взгляд на изучаемую проблему (Minchevaasheva S et al., 2013). Наконец, использование гранулярных нейронов первичной культуры нацелено на изучение причины нейродегенерации и фармакологической нейропротекции, отдельное внимание обращается на так называемую «разделительную полосу» между некрозом и апоптозом, на экзайтотоксическое нейрональное повреждение. Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что гранулярные нейроны мозжечка занимают особенную позицию в современной нейронауке как одна из самых удобных моделей для изучения нейронального развития, функционирования и патологии. (Contestabile A., 2002)
Одной из известных культур, на которых исследуется действие веществ с различными механизмами действия, является клеточная культура PC-12. Эта клеточная линия впервые была выделена в 1976 году из опухоли хромаффинных клеток надпочечника (Greene L., Tischer A., 1967). С тех пор она стала очень популярным объектом для изучения сигнальных путей при выживании клеток, пролифирации и дифференцировки. В зависимости от экспериментальных условий клетки высвобождают такие факторы как дофамин, норадреналин, ацетилхолин и содержит Na+-, K+- и Ca2+-каналы и другие мембранные рецепторы, сопряжённые с G-белками. Кроме того, в процессе дифференцировки в клетках сменяют друг друга различные подтипы Ca-каналов. Поэтому, клетки PC-12 представляют собой модель для изучения нарушения химических процессов, ассоциированных с нейрональной дифференцировкой, синтезом, запасанием и выбросом нейротрансмиттеров, функции и регуляции ионных каналов и воздействие друг на друга внутри- и внеклеточных соединений с мембраносвязанными рецепторами. Интересной чертой клеток PC-12, которая была описана учёными в самом начале использования этой культуры в качестве модельной клеточной линии, является их способность к образования нейритов или нейрон- подобных клеток в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischer A., 1967). Рост нейритов может быть также спровоцирован cAMF и он сопровождается кроме обычного нейронального фенотипа такими признаками как остановка пролифирации, экспрессией нейрональных маркёров и секрецией нейротрансмиттеров (Vandry D. et al., 2002; Weterlink R. and Ewing A., 2008). Поскольку PC-12 очень легко культивируется, она позволяет осуществлять гораздо проще те же задачи, которые выполняются исследователями на нейрональных культурах.
Способы индукции окислительного стресса
Перекись водорода при повышенном образовании в клетке вызывает окислительный стресс. Некоторые ферменты, например глюкозоксидаза, образуют в ходе окислительно-восстановительной реакции перекись водорода, которая может играть защитную роль в качестве бактерицидного агента. В клетках млекопитающих нет ферментов, которые бы восстанавливали кислород до перекиси водорода. Однако, несколько ферментных систем (ксантиноксидаза, НАД(Ф)H-оксидаза, циклоксигеназа и др.) продуцируют супероксид, который спонтанно или под действием супероксиддисмутазы превращается в перекись водорода. В данной работе мы использовали перекись водорода для индукции неспецифического окислительного стресса, т.е. окислительного стресса, индуцированного внесением эндогенного оксиданта, который закисляет клетку не через рецепторный механизм действия, а влияет прямым образом, как донор активных форм кислорода. Клеткам давали перекись водорода в концентрации 5 мМ. Время инкубации составляло 30 мин. После инкубации с перекисью водорода клетки отмывали и измеряли количество активных форм кислорода, а также долю мёртвых клеток. Протокол эксперимента: 1. интактные клетки (контроль), 2. интактные клетки + 1 мМ карнозин, 3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом, 4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин, 5. введение в культуру клеток 5 мМ H2O2 , 6. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H2O2, 7. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H2O2, 8. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H2O2. Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 5 мМ H2O2 составило 0,5 часа.
Для стимуляции специфического окислительного стресса, запускаемого через механизм, опосредованный рецепторами, использовали N-метил-D-аспартат (NMDA) в концентрации 1 мМ. N-метил-D-аспартат - это агонист NMDA-рецепторов. Он вызывает гиперактивацию рецепторов и экзайтотоксический эффект, развитие которого обусловлено резким увеличением концентрации внутриклеточного Ca2+ в цитоплазме нейронов, что влечет за собой накопление активных форм кислорода, инициацию перекисного окисления липидов и клеточную смерть.
Для изучения механизма действия NMDA на клетки PC-12, мы использовали блокаторы NMDA-рецепторов: MK-801 и D-AP5. Протокол эксперимента: 1. интактные клетки (контроль) 2. интактные клетки + 1 мМ карнозина 3. введение в культуру клеток 1 мМ NMDA 4. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA 5. введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA 6. введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 1 мМ NMDA составило 0,5 часа.
Гомоцистеиновая кислота, метаболит гомоцистеина, обладает экзайтотоксическими свойствами, стимулируя NMDA-рецепторы. При этом происходит избыточное поступление ионов кальция в клетки и образование большого количества свободных радикалов. Мы добавляли гомоцистеиновую кислоту в пробы в концентрации 500мкМ. Пробы инкубировались в течение 1 часа. Затем проводили измерения. Протокол эксперимента: 1. интактные клетки (контроль) 2. интактные клетки + 1 мМ карнозина 3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом 4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин 5. введение в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты. Измерения проводили через 5, 15, 30 и 60 минут инкубации 6. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты, инкубировавшейся полчаса с клетками 7. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин) 8. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин) 9. введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин) 10. введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)-10.
В работе использовали спермин, спермидин и путресцин. Путресцин образуется при декарбоксилировании бактериями аминокислоты орнитина. В тканях организма путресцин — исходное соединение для синтеза двух физиологически активных полиаминов — спермидина и спермина. Полиамины добавляли к клеткам в концентрации по 50, 100 и 500 мкМ каждый. Инкубация клеток с полиаминами происходила в течение 1 часа при 370С. Протокол эксперимента: 1. интактные клетки (контроль) 2. интактные клетки + 1 мМ карнозина 3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом 4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин 5. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина 6. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина 7. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина 8. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина 9. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина 10. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина 11. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина 12. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина 13. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина 14. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина 15. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина 16. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина
Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС
В качестве нанокострукций использовали липосомы, состоящие из 95,3% фосфолипидов, 2,5% неполярных липидов, и содержащие 1,2% L-карнозина, стерилизованные автоклавированием при избыточном давлении 1 атм. в течение 45 минут. Средний диаметр липосомальных частиц составлял 150-160 нм. 2.3.4. Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по диазореакции (Практикум по биохимии. Издательство Московского университета) Реактивы: 1. Сульфаниловая кислота – раствор содержит 0,9 г сульфаниловой кислоты, 9 мл концентрированной HCl, воды до 100 мл. 2. NaNO2-5%ный раствор, свежеприготовленный. 3. Диазотированная сульфаниловая кислота. В колбу, стоящую во льду, помещают 6 мл раствора сульфаниловой кислоты, приливают туда 6 мл свежеприготовленного раствора NaNO2 , перемешивают и оставляют на 5 мин. Прибавляют при помешивании еще 24 мл NaNO2 и через 5 мин доливают водой до 100 мл. Каждый раз готовят свежий раствор (на льду хранится в течение 5-6 ч). 4. NaCO3 безводный – 10%ный раствор. 5.Карнозин- стандартный раствор 0,5 мг/мл. Карнозин содержащие нанолипосомы после упаривания на роторном испарителе растворяют в 1-2 мл воды. Отбирают различные количества этого раствора, доводят водой до 2мл, приливают 3 мл диазореактива, хорошо премешивают и оставляют на 5 мин. Затем добавляют 3 мл 10%-ного раствора соды, перемешивают и через 10 мин колориметрируют при 490 нм. Следует убедиться в том, что интенсивность образующейся краски пропорциональна количеству исследуемого раствора, взятого для определения. Количество карнозина рассчитывают с помощью калибровочного графика, построенного по стандартному раствору карнозина, содержащему от 0,05 до 0,5 мкмоль в пробе. Рассчитывают количество карнозина в микромолях на 1 г ткани.
Карнозин. Раствор карнозина, в концентрации 0,5 мг/мл готовили из сухого реактива. К сухому веществу приливали раствор среды для культивирования клеток PC-12, RPMI, содержащей все компоненты, кроме телячьей сыворотки (состав среды см. выше), объёмом 10 мл. После этого в среде подводили pH до значения, равного 7,4. Растворы хранили в холодильники не более 1 месяца, проверяя pH каждый раз перед экспериментом по окраске среды (в ней содержится феноловый красный, который является индикатором pH) Пероксид водорода. Концентрированный раствор пероксида водорода брали в аптеке. В экспериментах использовался водный раствор с конечной концентрацией 5 мМ. Плотность перекиси проверялась непосредственно перед проведением эксперимента, т.к. жидкость нестабильна.
NMDA, Гомоцистеиновая кислота. NMDA и гомоцистеиновая кислота в концентрации 1мМ и 500мкМ соответственно были приготовлены из сухого реактива, исходя из молекулярной массы каждого - соответственно. Сухое вещество растворяли в тёплом готовом растворе Хэнкса, затем приводили pH к стандартному значению 7,4. Раствор гомоцистеиновой кислоты выходит за границы буферной ёмкости при pK2, то есть при значении константы диссоциации аминогруппы, что осложняет подведение pH до стандартных значений, поэтому мы готовили раствор на буфере (р-р Хенкса).
Полиамины. Полиамины (спермин, спермидин, путресцин) готовили на дистиллированной воде. Исходная концентрация составляла 5 мМ. Акролеин. Акролеин в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ готовили под тягой на основе дистиллированной воды. Исходная концентрация составляла 1 мМ. MK-801, DAP5 готовили на основе дистиллированной воды. Исходная концентрация составляла 1 мМ Конечная концентрация составила 10 мкМ и 50 мкМ соответственно. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих мышах линии SAM (Senescence Accelerated Mice, клоны SAMR1 - resistance и SAMP1 - Prone) SPF-категории. Мыши выращены в Питомнике экспериментальных животных в Пущино-на-Оке. Все эксперименты проводились с соблюдением регламента работы с экспериментальными животными, описанными в русскоязычной версии издания Guide for the Care and Use of Laboratory Animals - Russian Version, National Academy Press, Washington. DC, 1996.
Окислительный стресс in vitro создавали инкубацией суспензии выделенных гранулярных клеток мозжечка с 3,5 мМ перекиси водорода в течение 30 мин при 37ОС в присутствии и в отсутствие карнозинсодержащих нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ.
Выделение гранулярных клеток мозжечка. Опыты in vitro проводили на суспензии гранулярных клеток мозжечка. Выделение гранулярных клеток мозжечка проводили из 10-12 дневных быстростареющих мышей (Sureda F. et al., 1998). Животных декапитировали, выделяли мозжечок, промывали его ледяным физиологическим раствором, удаляли крупные кровеносные сосуды и измельчали скальпелем. Для разрыхления межклеточного вещества использовали раствор коллагеназы, приготовленный на основе буфера Тироде (Wako collagenase, 2 mg/ml/1 животное). Измельченные фрагменты ткани мозжечка инкубировали при 32оС в течение 20 мин, не перемешивая. После инкубации декантацией удаляли раствор коллагеназы, трижды отмывали осадок частично диссоциированных тканей мозжечка раствором Тироде. Далее к осадку добавляли раствор Тироде из расчета 1мл на 1 животное и диссоциировали клетки с помощью пастеровской пипетки до получения опалесцирующей суспензии. Полученную суспензию пропускали через фильтр с размером пор 60 мкм для удаления крупных фрагментов ткани, после чего в 1 мл суспензии проводили подсчет клеток в камере Горяева, число которых не должно быть меньше 106/мл. Затем в выделенной суспензии нейронов индуцировали окислительный стресс.
Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии. Острую гипобарическую гипоксию (ОГГ) создавали в барокамере проточного типа для предотвращения развития эффекта гиперкапнии (Boldyrev A.А. et al., 1997). Опыты выполнены на 8-месячных мышах линий SAMR1 (n=25) и SAMP1 (n=25), самцы: самки - 50:50%, весом 25-30 г. Мышей из каждой линии делили на 2 группы по 12-13 особей в каждой. Животным одной из групп за 1 час до гипоксического воздействия вводили внутрибрюшинно раствор карнозинсодержащих липосом (48 мг/кг массы тела), животным другой группы (контрольной) – физиологический раствор.
Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF
NMDA рецепторы содержат несколько субъединиц. В настоящей главе мы изучали наличие NR1-канальной субьединицы и NR2- регуляторной субьединицы в культуре клеток РС12. При исследовании экспрессии NMDA рецепторов под влиянием дексаметазона или NGF мы использовали протоколы активации клеток, описанные в разделе «Материалы и Методы». На рис. 4.3 представлены достоверные отличия в экспрессии NR1 субъединицы у интактных клеток и у клеток, стимулированных различными химическими агентами. Данные для NR2 субъединицы также достоверно отличаются. Количество NR1 субьединиц вырастает приблизительно от 2% до 10% в случае клеток, стимулированных дексаметазоном и растет до 17% у клеток, стимулированных фактором роста нервов. NR2b субьединица растёт от 1% до 5% и 14% - соответственно. Подробные данные о соотношении экспрессии субьединиц в клетках представлены в таблице 3.1. Анализ полученных нами в эксперименте данных показывает, что NMDA рецепторы экспрессируются в клетках феохромоцитомы как в интактном состоянии, так и в стимулированном дексаметазоном или NGF. Также полученные нами данные показывают, что экспрессия проходит по обеим субъединицам - канальной и регуляторной, что важно. С точки зрения функции данных рецепторов можно было предположить, что субъединицы данных глутаматных рецепторов экспрессируются больше в нейрон-подобных клетках, т.к. преимущественно эти рецепторы присущи нервным клеткам. Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что в NGF стмулированных клетках NMDA рецепторов достоверно больше, чем в клетках, стимулированных дексаметазоном. Исходя из данных, представленных на рисунке 3.4 можно предположить, что количество субъединиц NR1 и NR2b растёт пропорционально друг другу, однако данные представленные в таблице 3.1 опровергают эту гипотезу.
Знак соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p 0,05
Данные, представленные в таблице 3.1, показывают, что соотношение субъединиц при активации клеточной интактной культуры РС-12 разными дифференцирующими агентами отличается. Так, при активации клеток дексаметазоном количество NR1 и NR2b возрастает пропорционально исходному количеству данных субъединиц, присутствующих в интактной культуре. Это отношение приблизительно равно 8. При активации клеток NGF, канальная субъединица(NR1) экспрессируется в 12 раз больше, чем в интактной культуре, а регуляторная (NR2b)- в 28 раз. Это свидетельствует о том, что безусловно NR1-субъединица NMDA-рецептора является обязательной для формирования канал-рецепторного комплекса, она выполняет каналообразующую функцию. Но реализация функций рецептора осуществляется с помощью NR2b субъединицы.
Таким образом, в интактных клетках PС-12 мы обнаружили канальную и регуляторную субьединицы NMDA рецепторов, однако их количества настолько малы, что возможность их работы минимальна. В клетках, активированных фактором роста нервов содержится в 11,9 раз большее количество NR1 субьединицы и в 27,6 раз большее количество NR2b субьединицы. Однако, несмотря на то что количество субьединиц в нейрон-подобных клетках оказалось большим чем, в интактных клетках, нам необходимо убедиться в том, что эти рецепторы функционально активны и работают так же как в нейронах. Для этого мы сравним ответ нейрон-подобных клеток и интактных клеток на перекись водорода и специфический агонист NMDA. А также посмотрим, каков будет ответ нейрон-подобных клеток при блокаде рецепторов при помощи агониста- MK-801 и DAP-5 и одновременном действии NMDA. Результаты данных экспериментов представлены в следующей главе.
В данном фрагменте работы мы моделировали окислительный стресс двумя способами: с помощью специфического лиганда, активирующего NMDA рецепторы и с помощью экзогенного источника активных форм кислорода- пероксида водорода.
Далее мы анализировали способность специфического и неспецифического активатора развития окислительного стресса стимулировать выброс АФК при помощи подсчёта количества клеток с большей и меньшей флуоресценцией DCF и сравнивали среднюю флуоресценцию субпопуляций клеток, находящихся в состоянии окислительного стресса. Далее определяли, функциональны ли NMDA-рецепторы в исследуемой культуре. В случае, если рецепторы не отвечают на действие лиганда повышением уровня АФК, проверяли при помощи действия пероксида водорода, способны ли клетки отвечать повышенной продукцией активных форм кислорода на окислительный стресс, созданный неспецифическим путём. Результаты представлены ниже.
