Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1. Металлы платиновой группы и их характеристика 11
1.2. Использование соединений платины и палладия в медицине 15
1.3. Биологическая активность переходных металлов 19
1.4. Взаимодействие переходных металлов с нуклеиновыми кислотами и их
компонентами 28
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 40
2.1. Комплексные соединения палладия 40
2.2. Использование метода проточной цитометрии для определения цитотоксического и противоопухолевого действия соединений палладия 42
2.3. Методы определения антибактериальной активности соединений палладия 45
2.4. Определение активности лактатдегидрогеназы в присутствии соединений палладия 47
2.5. Физико-химическое исследование комплексов переходных металлов и их лигандов 52
ГЛАВА III. Результаты исследования и их обсуждение 59
3.1 Изучение цитотоксического действия соединений палладия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C 59
3.2 Определение противоопухолевого действия соединений палладия на клетки миеломы SP-2X 62
3.3. Антибактериальное действие соединений палладия на клетки штамма Escherichia соННВ-101 70
ГЛАВА IV. Изучение активности лактатдегидрогеназы в присутствии соединений палладия 79
4.1. Исследование действия водорастворимых соединений палладия на активность лактатдегидрогеназы 79
4.2. Действие жирорастворимых соединений палладия на активность лактатдегидрогеназы 82
ГЛАВА V. Взаимодействие соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом 86
5.1. Взаимодействие водорастворимых соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом 86
5.2. Определение стехиометрии связывания цитозина, аденина и аденозинтрифосфата с водорастворимыми соединениями палладия 94
5.3. Взаимодействие жирорастворимых соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом 101
5.4. Определение стехиометрии связывания цитозина, аденина и аденозинтрифосфата с жирорастворимыми соединениями палладия 109
Заключение 113
Выводы 117
Список литературы 119
Приложение 142
- Использование соединений платины и палладия в медицине
- Использование метода проточной цитометрии для определения цитотоксического и противоопухолевого действия соединений палладия
- Изучение цитотоксического действия соединений палладия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C
- Исследование действия водорастворимых соединений палладия на активность лактатдегидрогеназы
Введение к работе
В последнее время металлы платиновой группы находят широкое применение в химической, энергетической и других отраслях промышленности. Соединения этой группы используются в медицине в качестве противоопухолевых (z/wc-платин, карбплатин и др.), иммуномодулирующих (эфазол) препаратов [17-19, 51, 76, 124, 157].
Известно, что именно соединения платины являются одними из наиболее эффективных противоопухолевых препаратов. В настоящее время их широко применяют в клинической практике для лечения онкологических заболеваний головы и шеи, органов желудочно-кишечного тракта, яичек и яичников [41, 76]. Механизм противоопухолевого действия комплексов платины заключается во взаимодействии с ДНК, что приводит к остановке пролиферации и гибели опухолевых клеток. Несмотря на значительный терапевтический эффект, лекарственные препараты на основе цис-тшатина обладают побочным действием (вызывают тошноту, рвоту, расстройство функций костного мозга, являются причиной различных нервных заболеваний). Токсическое действие комплексов платины в значительной степени связано с их накоплением в почках, где они могут взаимодействовать с белками. Кроме того, существенным недостатком таких препаратов является их низкая растворимость в воде [41]. В настоящее время проводится огромная работа по поиску аналогов этих комплексов, обладающих меньшей токсичностью и более широким спектром противоопухолевой активности. Параллельно изучается биологическая активность соединений палладия с целью выявления цитотоксических и противоопухолевых свойств, которые позволят использовать соединения палладия для лечения онкологических заболеваний.
Однако направленный поиск новых лекарственных препаратов, обладающих значительным терапевтическим эффектом и не оказывающих побочного действия, возможен лишь при детальном изучении влияния различных платиноидов и их комплексов на организм человека и выяснении
механизма взаимодействия платиновых препаратов с ДНК и белками. Одним из путей установления такого механизма является изучение взаимодействия препаратов на основе металлов платиновой группы с нуклеиновыми кислотами, а также исследование влияния на каталитическую активность различных ферментов, отвечающих за протекание жизненно важных процессов в клетках.
Взаимодействие соединений палладия с нуклеиновыми кислотами и их фрагментами заключается в координации соединений палладия по атому азота N7 пуриновых оснований [203] и атому азота N3 пиримидиновых оснований (в основном, цитозина) [199].
Необходимо отметить, что в последнее время для лечения ряда онкологических заболеваний применяются нитрофурановые препараты, действие которых сводится к разрушению интенсивно делящейся ДНК супероксидным радикалом, образующимся при окислении нитрильной группы нитрофуранов клеточными оксидазами [96]. Методами кругового дихроизма и УФ-спектроскопии установлено, что нитрофураны не связываются с нуклеиновыми кислотами. В то же время комплексное соединение, содержащее нитрофуран и атом платины (или палладия), связывается с нуклеосомной и плазмидной ДНК бактериальных клеток, что установлено методом футпринтинга и электрофореза в агарозном геле [4]. В связи с этим палладийсодержащие комплексы нитрофуранов также могут использоваться для преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов.
Важным биохимическим показателем метаболизма является активность одного из центральных ферментов углеводного обмена - лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Активность ЛДГ увеличивается в сыворотке крови у онкологических больных вследствие смещения метаболических реакций опухолевой клетки в сторону протекания анаэробных процессов с последующим выходом фермента в кровь после гибели клетки [36, 39, 67].
Таким образом, изучение биологического действия палладийсодержащих соединений, применяющихся в различных отраслях промышленности и в
медицине, на центральные мишени клеток - нуклеиновые кислоты и ферменты — является одной из актуальных задач современной биохимии.
В связи с вышеизложенным была сформулирована цель настоящего исследования: изучить антибактериальное и цитотоксическое действие соединений палладия, выяснить действие соединений палладия на один из центральных ферментов гликолиза - лактатдегидрогеназу, а также изучить взаимодействие соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом.
На основании этого были поставлены задачи исследования:
изучить цитотоксическое и противоопухолевое действие водорастворимых (КгРсЮЦ, z/HC-Pd(NH3)2Cl2) и жирорастворимых (Рд(ФЗ)2СІ2, Р(і(ФК)2СІ2) соединений палладия на спленоциты линейных мышей Balb-C и клетки миеломы SP-2X; установить антибактериальное действие водорастворимых (К2РСІСІ4, z/wc-Pd(NH3)2Cl2) и жирорастворимых (Pd(0>3)2Cl2, Pd(
Pd(NH3)2Cl2 - палладиевый аналог z/wc-платина - обладает противоопухолевым действием в отношении клеток миеломы SP-2X. Жирорастворимые соединения палладия проявляют антибактериальную активность на клетки штамма Е. coli НВ-101. Препараты z/woPd(NH3)2Cl2, Pd(03)2Cl2, Pd(OK)2Cl2 ингибируют фермент гликолиза ЛДГ. Показано, что водорастворимые соединения палладия взаимодействуют с цитозином, аденином и АТФ. Жирорастворимые соединения палладия взаимодействуют только с цитозином и аденином.
Теоретическая и практическая значимость проведенной работы заключается в выявлении антибактериального и противоопухолевого действия соединений палладия, что дает возможность обоснованно рекомендовать проведение клинических испытаний данных препаратов.
Выдано свидетельство на полезную модель № 22478 «Кювета для выращивания микроорганизмов» по заявке №2001131454 от 21.11.2001 г. Заявитель Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, Министерство здравоохранения РФ.
Принято к печати учебно-методическое пособие «Структура и химические свойства нуклеотидов и нуклеозидов» с грифом Учебно-Методического Объединения по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: научно-практических конференциях «Молодые ученые - здравоохранению региона - 2002, 2003, 2004» (Саратов, 2002, 2003, 2004 г.).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Выдано свидетельство на полезную модель № 22478 «Кювета для выращивания микроорганизмов» по заявке №2001131454 от 21.11.2001 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
Соединения палладия обладают цитостатическим действием и не оказывают выраженного цитолитического действия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C, соединение */wc-Pd(NH3)2Cl2 обнаруживает противоопухолевый эффект отношении клеток миеломы SP-2X.
Жирорастворимые препараты (Pd(03)2Cl2, Pd(OK)2Cl2) оказывают антибактериальное действие на клетки штамма Е. coli НВ-101.
Препараты */wc-Pd(NH3)2Cl2, Pd(
Водорастворимые соединения палладия взаимодействуют с цитозином, аденином и АТФ. Жирорастворимые соединения палладия взаимодействуют только с цитозином и аденином.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и указателя использованной литературы. Работа изложена на 142 страницах, включает 36 рисунков и 13 таблиц. Список литературных источников содержит 215 наименований.
Использование соединений платины и палладия в медицине
В настоящее время хорошо известна роль соединений платины в лечении онкологических заболеваний: цис-платин (цис-ДДП) и карбоплатин широко используются в клиниках в качестве противоопухолевых препаратов [16, 17, 65, 157, 186, 189, 191, 192, 209]. Однако постоянно идет поиск и клинические испытания более активных и менее токсичных препаратов на основе платины, включая и перорально активные соединения платины (IV) [17, 20].
Наряду с соединениями платины всесторонне исследуются координационные соединения и других платиновых металлов. Так, была обнаружена высокая эффективность фталоцианиновых комплексов рутения при использовании в фотодинамической терапии опухолей, противоопухолевая и антиметастатическая активность комплексов рутения с имидазолом и др. [17].
В результате изучения корреляции состав-строение-биологическая активность соединений платиновых металлов у соединений палладия был открыт новый вид биологической активности — иммуноактивирующая способность.
Систематическое исследование ряда соединений палладия и производных ароматических аминов позволило разработать новый класс палладийсодержащих лекарственных препаратов, среди представителей которых эфазол является наиболее перспективным. Всестороннее изучение эфазола позволяет считать его представителем нового класса палладийсодержащих иммуномодулирующих лекарственных препаратов, облегчающих иммунный ответ при иммунодефицитных состояниях, например, после облучения, использования противоопухолевых препаратов и т.д. Установлено, что эфазол защищает только нормальные клетки организма и стимулирует восстановление радиационно поврежденных клеток, не защищает злокачественные клетки и не стимулирует их рост. Это свойство позволяет использовать эфазол для повышения эффективности радио- и химиотерапии злокачественных опухолей [19].
Антиметастатическое действие эфазола было выявлено при изучении процессов метастазирования меланомы В-16. В контрольной группе животных, имеющих метастазы, при введении эфазола число метастазированных животных уменьшалось на 41 — 69%. Количество метастазов у остальных 31 — 50 % животных понижалось на 93 - 94%. С учетом данных по частоте и интенсивности метастазирования индекс ингибирования метастазов (ИИМ) меланомы В-16 при введении 15 и 20 мг/кг эфазола составляет 97%. ИИМ карциномы легких Льюиса равен 70% [19].
Еще одним аспектом применения эфазола в онкологии является влияние на процессы гемопоэза и цитогенетическую стабильность клеток крови. Так, при облучении животных в дозе 200 рад в течение трех суток количество эритроцитов с остатками ядерного материала возрастает до 10 против 6.25 в интактной группе, что свидетельствует о повреждающем действии излучения на организм. После введения эфазола количество эритроцитов с микроядрами понижается до 7.15, что говорит о повышении цитогенетической устойчивости клеток под влиянием эфазола [19]. Таким образом, палладийсодержащий иммуномодулирующий лекарственный препарат эфазол является наиболее перспективным среди препаратов этого класса. Антибактериальное действие переходных металлов Переходные металлы можно условно разделить на две основные группы: «металлы жизни», входящие в состав ферментов и биологически активных веществ, и «чужеродные металлы», попадающие в организм из внешней среды. Первый тип элементов представляют ионы меди, кобальта, железа, марганца и т.д. [26, 46, 77, 86]. Ко второй группе можно отнести элементы, входящие в подгруппу платины: никель, палладий, платина. [4, 50]. Известно, что тяжелые металлы являются неспецифическими ингибиторами и могут оказывать многостороннее действие на метаболизм микроорганизмов [85, 89, 90, 92]. Несмотря на известную токсичность ионов и соединений переходных металлов по отношению к микроорганизмам [116, 118, 213], некоторые из них не только способны концентрировать тяжелые металлы внутри или на поверхности клеток, но и расходовать на этот процесс энергию метаболических реакций. Ярким примером может быть поведение бактериальных клеток в растворах соединений золота и меди [27, 153, 211], включение ванадия [107], транспорт меди [182] или марганца [181] клетками дрожжей и др. [14, 78].
Установлено, что соли тяжелых металлов нарушают барьерные свойства цитоплазматических мембран (ЦПМ) клеток различного происхождения [23, 141]. При этом клетки теряют значительную часть внутриклеточного калия [35], и происходит перераспределение протонов между цитоплазмой и окружающей клетку средой, а также уменьшение трансмембранного потенциала клеток [25, 35]. Концентрация ионов переходных металлов, обладающих токсическим действием на клетки, зависит от вида организма. Наиболее чувствительны к ним цианобактерии. Ионы переходных металлов можно расположить по их повреждающему действию на ЦПМ клеток в следующем порядке: для клеток Anacystis nidulans — Ag+ Cu2+ Cd2+; для клеток Escherichia coli - Ag+ Cu2+ Cd2+ Pb2+. [24, 25].
Таким образом, учитывая, что соли тяжелых металлов накапливаются в клеточных стенках и мембранах клеток различного происхождения, повреждая их, можно высказать предположение о близком механизме цитотоксического действия переходных металлов, которое заключается в угнетении метаболических процессов в бактериальных клетках и связывании с мембранными белками [24, 25, 32, 47].
Использование метода проточной цитометрии для определения цитотоксического и противоопухолевого действия соединений палладия
Используя среднее значение экстинкции при Х=222 нм (є = 8266 М см"1) [4] можно точно говорить о суммарной концентрации хлоро-, аквакомплексов соединения I, т.к. при этой длине волны (изобестическая точка) молярные экстинкции разных комплексов примерно равны друг другу: Єї [РсІС1(Н20)з] є2 [PdCl2(H20)2] - єз [PdCl3(H20)] [4].
Спектр комплекса [Р(іСЦ(Н20)о] достаточно характерен, поэтому не составит труда определить концентрацию этого комплекса в растворе при Хх=222 нм (є4=29000 М см-1) и Х2=279 нм (є4=Ю5000 M W1) [4]. Интенсивные полосы поглощения в районе 210-230 нм обусловлены полосой переноса заряда и, следовательно, количеством атомов хлора, координированных с центральным ионом металла, в основном, и будет определять тип и интенсивность спектральных полос. Все спектральные измерения проводились на спектрофотометре «Specord UV-VIS», Германия; использовались кварцевые кюветы («Sigma») с длиной оптического пути 1 см (рис. 6, 7). Следует отметить, что снимать спектр поглощения в коротковолновой области (А.=222 нм) не представлялось возможным из-за интенсивного поглощения органических растворителей при длине волны около 250 нм. Приготовление растворов и точное определение величины молярного поглощения азотистых оснований и АТФ В работе использовали азотистые основания и АТФ фирмы «Sigma». Используя метод точной навески, взвешивали 1 мг азотистого основания и АТФ, затем растворяли в 200 мкл бидистиллированной воды в пластиковой пробирке на 1 мл. Молярную концентрацию соединений определяли спектрофотометрическим методом (рис. 7), используя уравнение определения молярного поглощения соединений при соответствующей длине волны: Изучения взаимодействия соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом Изучение взаимодействия соединений палладия с цитозином, аденином и АТФ проводили спектрофотометрическим методом по Минченковой Л.Е. [42] путем титрования азотистого основания и нуклеотида соединением палладия. Для титрования использовали 2 кюветы: кювету определения и кювету сравнения (каждая кювета содержала 3 мл бидистиллированной воды). В кювету определения помещали раствор азотистого основания (нуклеотида), регистрировали спектр поглощения. Затем в обе кюветы прибавляли равные аликвоты раствора соединения палладия. После каждого прибавления содержимое кюветы перемешивали микропипеткой на 100 мкл и регистрировали спектр. Титрование раствора азотистого основания (нуклеотида) раствором соединения палладия далее будет именоваться прямым титрованием. Таким образом, при прямом титровании кюветы уравнивались по соединениям палладия, и спектрофотометр регистрировал изменение спектров азотистого основания (нуклеотида). Изменение спектров поглощения раствора азотистого основания (нуклеотида) при прямом титровании свидетельствует о структурной перестройке молекул азотистого основания (нуклеотида) и, следовательно, является доказательством взаимодействия азотистого основания (нуклеотида) и соединения палладия.
На следующем этапе проводили титрование раствора соединения палладия раствором азотистого основания (нуклеотида). Для этого также использовали кювету определения и кювету сравнения (каждая кювета содержала 3 мл бидистиллированной воды); в кювету определения помещали раствор соединения палладия. Затем в обе кюветы добавляли равные аликвоты раствора азотистого основания (нуклеотида). После каждого прибавления содержимое кюветы перемешивали микропипеткой на 100 мкл и регистрировали спектр. Титрование раствора соединения палладия раствором азотистого основания (нуклеотида) далее будет называться обратным титрованием. Следовательно, при обратном титровании кюветы уравнивались по азотистому основанию (нуклеотиду), и спектрофотометр регистрировал изменение спектров соединения палладия, что доказывало взаимодействие соединений палладия с азотистыми основаниями и нуклеотидом.
Стехиометрические характеристики комплексов соединений палладия с азотистыми основаниями и аденозинтрифосфатом
Стехиометрическим параметром процесса связывания комплексных соединений палладия с азотистыми основаниями и нуклеотидом является величина IQ — количество моль соединения палладия, взаимодействующих с 1 молем азотистого основания (нуклеотида). Значение 10 определяется из кривых титрования по точке перегиба титрующей кривой (рис. 8). В этой точке для расчета величины 10 используют следующую формулу: где In - феноменологическая величина, физический смысл которой отражает факт полного насыщения основания или нуклеотида молекулами соединений палладия; гтах — число молей азотистых оснований или нуклеотида, взаимодействующих с 1 молем соединения палладия.
В связи с этим необходимо отметить следующее: при прямом титровании концентрация азотистого основания или нуклеотида, которые титруются соединениями палладия с целью нахождения /о, должна быть такой, чтобы на начальных этапах титрования все добавленное соединение связывалось с основанием или нуклеотидом. При обратном титровании концентрация соединений палладия, которые титруются основанием или нуклеотидом для нахождения /о, должна быть такой, чтобы на начальных этапах титрования все добавленное основание или нуклеотид связывалось с соединением палладия.
Параметр In может указывать на определенные структурные перестройки в молекуле азотистого основания или нуклеотида при связывании соединения палладия и отражать тем самым нетривиальный механизм адсорбции соединения палладия на основании или нуклеотиде. Молярное поглощение є определяется как отношение величины оптического поглощения к концентрации добавленного соединения.
Изучение цитотоксического действия соединений палладия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C
Использованные в данном исследовании соединения палладия в концентрациях 10"3 - 10"6 М не оказывали значительного токсического действия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C. Общее число спленоцитов при инкубации клеток с соединениями палладия изменялось в пределах 99,5-100,2%, что соответствовало норме (табл. 5). Число диплоидных клеток после инкубации спленоцитов с соединениями палладия I и II в концентрации 4-Ю"5 М увеличивалось: с соединением I на 43 %, с соединением II - на 32 %, с соединением III в концентрации 10 М-на 34%, в то время как при инкубации с соединением IV в концентрации 10"3 М изменения числа диплоидных клеток не наблюдалось (рис. 9).
Увеличение числа диплоидных клеток (в среднем на 30%) означает, что спленоциты в присутствии соединений I, II, III не вступают в стадию митоза. Известно [93, 100, 106, 111, 157, 168, 178, 187], что соединения палладия взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, вызывая внутринитевое или межнитевое сшивание цепей ДНК за счет образования связей с атомами азота азотистых оснований. Это делает невозможным репликацию ДНК в интерфазной клетке в процессе S-фазы [62]. Вследствие этого увеличивается число интерфазных, а, следовательно, диплоидных клеток.
Важным показателем токсического действия любого препарата является число апоптозируемых клеток. При инкубации спленоцитов с соединениями палладия достоверные изменения наблюдались лишь в присутствии соединения I в концентрации 4 10"5 М (табл. 5), которое вызывало уменьшение числа апоптозируемых клеток на 37,5% (рис. 10).
Таким образом, можно заключить, что соединения палладия обладали цитостатическим действием и не оказывали выраженного цитолитического действия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C.
Жизненный цикл любой клетки включает два основных периода: подготовку клетки к делению - интерфазу - и собственно деление — митоз. Интерфаза, в свою очередь, подразделяется на три этапа: Gi, S и Gi. В течение Gi этапа происходят интенсивные процессы биосинтеза; образование митохондрий, эндоплазматического ретикулума, лизосом, аппарата Гольджи; ядрышко продуцирует мРНК, тРНК и рРНК; образуются рибосомы; клетка синтезирует структурные и функциональные белки. При этом интенсивный клеточный метаболизм контролируется ферментами. Клетка растет и образует вещества, подавляющие или стимулирующие начало следующей S-фазы. В течение S-фазы происходит репликация ДНК, синтез белков-гистонов, с которыми связывается каждая нить ДНК, каждая хромосома превращается в две хроматиды. G2 этап характеризуется интенсивными процессами биосинтеза; делением митохондрий; увеличением энергетических запасов; репликацией центриолей и началом образования веретина деления. Затем происходит ядерное деление, состоящее из четырех этапов: профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Клеточный цикл заканчивается делением цитоплазмы — цитокинезом - во время которого происходит равномерное распределение органелл и цитоплазмы между двумя дочерними клетками (рис. 11) [13].
Важным показателем противоопухолевого действия препарата является изменение числа клеток в S-фазе. Известно [43], что чем больше опухоль, тем больше клеток опухоли находятся в S-фазе. Поэтому уменьшение числа клеток в S-фазе является доказательством противоопухолевого действия препарата. ДНК-гистограммы тетраплоидных опухолевых клеток миеломы в присутствии соединений палладия (рис. 13) демонстрируют изменение числа клеток, находящихся в Gi -, S -, G2 -, М — фазах клеточного цикла, что, в свою очередь, может служить доказательством противоопухолевого действия препарата. Так, водорастворимые соединения палладия I и II в значительной мере вызывают уменьшение доли апоптозируемых клеток и клеток в S-фазе клеточного цикла (рис. 12, 14): в присутствии соединения I число апоптозируемых клеток миеломы снижается на 43%, а клеток миеломы в S-фазе митоза — на 53%; в присутствии соединения II доля апоптозируемых клеток уменьшается на 73%, а доля клеток в S-фазе клеточного цикла — на 67% соответственно (табл. 6).
Таким образом, из изученных соединений палладия наибольшее действие оказывало соединение II, которое является палладиевым аналогом цис-ДйЦ (цис-тшатии, платидиам). Соединение II в концентрации 4-Ю"5 М вызывает значительное уменьшение общего числа клеток миеломы (на 42,5%) по сравнению с другими препаратами: соединение I в концентрации 4-Ю"5 М - на 23%, соединение III в концентрации 10" М — на 39%, соединение IV в концентрации 10 М - на 41% (рис. 12).
Жирорастворимые соединения палладия III и IV не вызывали уменьшения доли клеток в S-фазе клеточного цикла и доли апоптозируемых клеток миеломы. Таким образом, можно заключить, что жирорастворимые соединения палладия III и IV не оказывали выраженного действия на пролиферацию миеломных клеток SP-2X и, следовательно, не проявляли противоопухолевого действия.
Известно [162, 164], что комплексные соединения платины и палладия, имеющие лиганды, расположенные в транс-положении, не обладают противоопухолевой активностью. Однако ранее установлено [95, 96], что нитрофурановые препараты обладают противоопухолевой активностью благодаря радикалам, образующимся при восстановлении НФ ферментами опухолевых клеток, в первую очередь, ферментами с нитроредуктазной активностью. В связи с этим, можно заключить, что жирорастворимые соединения палладия III и IV, содержащие нитрофурановые лиганды фуразонал и фуракрилин, не оказывают выраженного противоопухолевого действия, т.к. нитрофурановые лиганды расположены в комплексах в транс-положении.
Таким образом, из изученных соединений палладия наиболее выраженным противоопухолевым действием обладает соединение И, которое является палладиевым аналогом цис-платина..
Исследование действия водорастворимых соединений палладия на активность лактатдегидрогеназы
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) является индикаторным ферментом, который локализован в паренхиматозных органах, и появление его изоферментов в сыворотке крови свидетельствует о развитии определенных заболеваний. Так, увеличение содержания фракций изоферментов ЛДГ і и ЛДГг наблюдается при инфаркте миокарда, ЛДГ2 и ЛДГз — при заболеваниях почек, ЛДГ4 и ЛДГ5 — при заболеваниях печени, ЛДГ5 увеличивается при миозитах, травмах и др. Известно, что в крови онкологических больных возрастает общая активность ЛДГ [36, 39, 48, 67, 79, 97, 103, 135]. Это связано с тем, что активность ЛДГ возрастает в интенсивно пролиферирующих опухолевых клетках и после их гибели поступает в кровь. В связи с этим изучение действия соединений палладия и нитрофурановых препаратов на активность ЛДГ является актуальной проблемой, поскольку цис-ЩЩ и нитрофурановые препараты применяются при лечении ряда онкологических заболеваний [62, 95]. Мы изучали действие соединений палладия и контрольных препаратов (фуразонал, фуракрилин, ДМФА) на активность ЛДГ in vitro.
Установлено [14, 38А, 48, 85], что соли тяжелых металлов являются неконкурентными ингибиторами ферментов, действие которых направлено на связывание карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот, на разрыв дисульфидных связей. В экспериментах определяли действие соединений палладия на активность коммерческой ЛДГ in vitro. Тип ингибирования фермента можно определить с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен и графика Лайнуивера-Бэрка. При неконкурентном ингибировании снижается величина максимальной скорости реакции (Vmax). Если при этом величина константы Михаэлиса (Кт) не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Однако часто имеет место смешанный тип ингибирования (частично неконкурентный тип), при котором снижение Vmax сочетается с увеличением Кт. Максимальная скорость ферментативной реакции, катализируемой ЛДГ, составляет 3,3x10 6 моль/л-с. Кт фермента лактатдегидрогеназы составляет 0,2 х 10"2 М пирувата натрия. На графиках определения Кт ЛДГ в присутствии соединений I и II (рис. 18) следует отметить: снижение максимальной скорости реакции при добавлении в реакционную среду соединения I, с сохранением контрольного значения Km (Vmax=2,8xl0 моль/л-с; Km=0,19xl0" М пирувата натрия). На этом основании можно сделать вывод, что соединение I действует на ЛДГ как неконкурентный ингибитор. На рис. 18 наглядно видно что, соединение II действовало на ЛДГ тоже как неконкурентный ингибитор, т.к. при уменьшении максимальной скорости реакции (Vmax=3,0xl0"6 моль/л-с) наблюдалось лишь незначительное снижение Кт (Кт=0,17x10" М пирувата натрия). При добавлении соединения I активность ЛДГ снижается на 20%, в присутствии соединения II — на 30% (рис. 19). Для наглядности все полученные результаты исследования представлены в таблице 11. Таким образом, учитывая снижение максимальной скорости реакции, незначительное изменение Кт, уменьшение активности ЛДГ в присутствии водорастворимых соединений палладия I и II, можно заключить, что последние подавляют активность ЛДГ по неконкурентному типу ингибирования [38А].
Для определения активности ЛДГ в присутствии жирорастворимых соединений палладия использовали кювету определения и кювету сравнения. В кювете определения (1/15 М фосфатный буфер, рН=7,4, НАДН, пируват натрия, ЛДГ, соединение палладия) проводили исследование активности ЛДГ с добавлением нитрофурансодержащих соединений палладия III и IV, ратсворимых в ДМФА, в кювету сравнения (1/15 М фосфатный буфер, рН=7,4, НАДН, пируват натрия, ЛДГ, ДМФА) добавляли только растворитель. Таким образом, зафиксированные изменения активности ЛДГ касались только действия соединений III, IV и нитрофурановых препаратов V и VI. Отдельный эксперимент был посвящен действию ДМФА на активность ЛДГ. Графики определения Km ЛДГ в присутствии соединений III, V, а также органического растворителя ДМФА (рис. 20) демонстрируют снижение максимальной скорости реакции для соединения III (Vmax OxlO"6 моль/л-с) в сочетании с увеличением константы Михаэлиса (Km=0,55 10 2 М пирувата натрия). Следовательно, можно сделать вывод о смешанном типе ингибирования данного соединения (табл. 11). Обращает внимание увеличение максимальной скорости в присутствии ДМФА и соединения V (Vmax=3,9xl0"6 моль/л-с, Vmax=4,lxl0"6 моль/л-с соответственно) при сохранении контрольного значения Кт (в случае ДМФА и соединения V Кт=0,22хЮ"4 М пирувата натрия). При этом активность ЛДГ в присутствии данных жирорастворимых соединений III, IV либо уменьшается на 40% (соединение III) и на 30% (соединение IV) соответственно, либо увеличиваются на 10% (соединения V, VI, ДМФА) (рис. 20, 21).
Графики определения Кт ЛДГ в присутствии соединений IV, VI, а также органического растворителя ДМФА (рис. 21) иллюстрируют для соединения IV снижение максимальной скорости реакции (Vmax=2,8xl0"6 моль/л-с) и незначительное снижение константы Михаэлиса (Km=0,16xl0"4 М пирувата натрия); в случае соединения VI — увеличение Vmax в сочетании с незначительным увеличением Km (Vmax=3,8xl0"6 моль/л-с, К ОДІхЮ"4 М пирувата натрия).
Таким образом, следует отметить неконкурентное ингибирование ЛДГ соединением IV (активность ЛДГ снижается на 30%) и активирование фермента соединением VI, а также растворителем ДМФА (активирование фермента на 10% в обоих случаях) (рис. 21).
