Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Исследование биохимических основ действия химических веществ - обязательный этап при их токсикологической оценке 8
1.1. Химическая природа и особенности биологического действия метилбензоата, паратолуилового эфира и некоторых производных органических кислот ароматического ряда 8
1.2. Характеристика симпатической системы передачи и ее избирательная чувствительность к воздействию химических агентов 15
1.3. Изучение обмена нуклеиновых кислот при интоксикации химическими веществами - важнейший биохимический критерий оценки их действия 25
Экспериментальная часть 34
Глава 2. Материалы и методы 34
- Определение доз метилбензоата и паратолуилового эфира для проведения токсикологического эксперимента 34
- Химический синтез метилбензоата 35
- Химический синтез паратолуилового эфира 35
- Изучение поведения крыс 36
- Изучение условно-рефлекторной функции 37
- Изучение работоспособности мышц 37
- Определение диффузного проникновения веществ через искусственные фосфолипидные мембраны . 38
- Выделение синаптосомально-митохондриальной франции мозга крыс 41
- Активность Мс+, JVa+, К*- АТФ-азы 42
- Определение общей холинэстеразной активности 42
- Определение содержания дофамина 42
- Определение содержания норадреналина 42
'- Определение содержания 5-оксииндолуксусной кислоты 42
- Определение содержания серотонина 42
- Тест на определение видовой продолжительности жизни дрозофил 43
- Определение содержания белка 43
- Определение содержания нуклеиновых кислот . 43
- Определение синтеза ДНК 43
- Выделение изолированных ядер печени 43
- Определение РНК-синтезирующей способности изолированных ядер печени І . 43
- Метод электронной микроскопии 44
- Статистическая обработка экспериментальных данных 44
Результаты и обсуждение
Глава 3. Дозовая зависимость токсического эффекта метилбензоата и паратолуилового эфира .45
Глава 4. Биохимическая оценка защитно-приспособительной реакции организма экспериментальных животных под действием исследуемых токсических веществ 59
4.1. Изучение диффузного проникновения метилбензоата и паратолуилового эфира через искусственные фосфолипидные мембраны 59
4.2. Влияние исследуемых соединений на М<г , Na+, К+-АТФ-азу мембранных структур мозга крыс 67
4.3. Влияние метилбензоата и паратолуилового эфира на активность ацетилхолинэстеразы в динамике токсикологического эксперимента 71
4.4. Влияние метилбензоата и паратолуилового эфира на показатели серотонинергической медиации. 84
4.5. Влияние метилбензоата и паратолуилового эфира на показатели адренергической медиации 95
Глава 5. Влияние метилбензоата и паратолуилового эфира на генетическую информацию клетки и ее передачу, как показатель прогнозирования отдалежыхпоследствий 108
5.1. Влияние метилбензоата на обмен нуклеиновыхкислот
5.2. Влияние паратолуилового эфира на обмен нуклеиновых кислот 118
5.3. Молекулярные исследования ультраструктуры печени, пораженной метилбензоатом и паратолуиловым эфиром 124
Заключение 130
Выводы 136
Литература
- Химическая природа и особенности биологического действия метилбензоата, паратолуилового эфира и некоторых производных органических кислот ароматического ряда
- Определение доз метилбензоата и паратолуилового эфира для проведения токсикологического эксперимента
- Дозовая зависимость токсического эффекта метилбензоата и паратолуилового эфира
- Изучение диффузного проникновения метилбензоата и паратолуилового эфира через искусственные фосфолипидные мембраны
- Влияние метилбензоата на обмен нуклеиновыхкислот
Химическая природа и особенности биологического действия метилбензоата, паратолуилового эфира и некоторых производных органических кислот ароматического ряда
Одной из актуальнейших задач биохимической науки является изучение связи между строением химических соединений и их токсическим действием. Химическая структура молекул определяет большую часть биологических свойств состоящих из них веществ. Познание этих свойств имеет как научное, так и практическое значение и связано с решением проблем промышленной токсикологии. Среди биологически активных веществ выделяются производные ароматического ряда. Задачей нашего исследования явилось изучение особенностей биологического действия метилбензоата и паратолуилового эфира, широко применяемых в современной промышленности.
Метилбензоат \__/\л г и ниобовое масло - ме тиловый эфир бензойной кислоты - CgHgCOOHq - представляет собой маслянистую бесцветную жидкость с молекулярной массой 136,15. Температура плавления - 12,5С, температура кипения - 199,бС. Растворимость в 100 мл воды при 30С составляет 0,0157 г. Это вещество высокорастворимо в эфире, бензоле, метаноле и других органических растворителях /101/.
Метилбензоат и паратолуиловый эфир являются промежуточными продуктами производства синтетического полиэфирного волокна "лавсан". Если не производится их утилизация, при сбросе в сточные воды они загрязняют естественные водоемы хозяйственного, культурного и питьевого назначения, что имеет негативные экологические последствия /71/.
Данные специальной литературы о токсичности изучаемых химических веществ весьма немногочисленны.
Эти вещества относятся к соединениям ароматического ряда, которые являются токсическими веществами, действующими, как правило, направленно на нервную систему /28/.
Клиническая картина отравления метилбензоатом в летальной дозе характеризуется возбуждением, затем нарушением координации движения, учащением дыхания, судорогами и наступлением смерти от остановки дыхания /56/. При введении малых доз метилбензоата у экспериментальных животных наблюдается нарушение условно-рефлекторной деятельности, понижена холинэстеразная активность сыворотки крови /20/. Метилбензоат вызывает нарушения со стороны клеточных элементов периферической крови /увеличение количества лейкоцитов, эозинофилов, моноцитов и ретикулоцитов, а также нарушения со стороны ткани печени /20/.При патогистологических исследованиях внутренних органов у животных, получивших абсолютно смертельные дозы метилбензоата, в легких отмечено полнокровие тканей, расширение сосудов, местами обнаружены участки везикулярной эмфиземы с разрывом альвеолярных перегородок, В ткани печени выявлено резкое расширение сосудов. В мозге и надпочечниках патологических изменений не обнаружено /56/.
Определение доз метилбензоата и паратолуилового эфира для проведения токсикологического эксперимента
Эксперименты выполнены на лабораторных белых беспородных крысах-самцах, весом 140-160 г, содержащихся на стандартном рационе вивария, согласно существующим нормативам. Животные приобретались в центральном питомнике МЗ СССР "Столбовая" и предварительно содержались 2 недели на предопытном карантине.
Величины доз, сроки воздействия исследуемых соединений были избраны согласно рекомендаций по проведению санитарно-токсикологического эксперимента / 32/.
Введение исследуемых веществ - паратолуилового эфира /ПТЭ/ и метилбензоата /МБ/ - в связи с их низкой растворимостью в воде проводилось оригинальным методом. Готовилась водная эмульсия изучаемых веществ на дистилированной воде методом озвучивания. Гомогенности добивались, используя ультразвуковой дезинтегратор марки УЗДН-І. Дезинтеграцию проводили в течение I минуты при частоте 22 кГц, силе тока 0,5 А. Характер и степень влияния МБ и ПТЭ на организм экспериментальных животных крыс-самцов исследовали при одноразовом действии среднелетальных доз для МБ -1177 мг/кг, а для ПТЭ - 2644 мг/кг веса животных. В подостром эксперименте использовали дозы 1/5, 1/10 и 1/20 ІД50 в течение 45 суток ежедевной затравки. В хроническом эксперименте были выбраны дозы 1/10, 1/20 и 1/50 ІД50 в связи с тем, что 1/20 и 1/50 в подостром эксперименте оказались недействующими. Затравку в хроническом эксперименте проводили ежедневно в течение б месяцев.
Контрольным и опытным животным вводили воду и исследуемые вещества через желудочный зонд, не добавляя к пище.
Число используемых животных было достоверным для статистического анализа - 8-Ю особей.
Эксперименты также проводились на маркерных линиях мух Thusopklla milcuiOciaste/i » которые потребляли с питательной средой дозы МБ и ПТЭ, равные Щ0 /МБ - 1177, ПТЭ - 2644 мг/кг/ І/5І Щ0 /МБ -235,4; ПТЭ - 528,8 мг/кг/ и 1/10 Щ0 /МБ -117,7; ПТЭ - 264,4 мг/кг/, расчитанные для белых крыс/. Использовались три линии дрозофил CoOtw, JtZour; пОЪМ&С,
Для проведения санитарно-токсикологического эксперимента, согласно требований МЗ СССР, были использованы чистые исследуемые вещества МБ и ПТЭ, синтез которых проводили по следующей методике.
Синтез метилбензоата:
Суть метода состояла в реакции метилирования бензойной кислоты метанолом.
К бензойной кислоте /60 г/ нужно прилить 300 мл абсолютного метанола и 20 г концентрированной серной кислоты. Смесь в течение 4 часов кипит на масляной бане. Оставшийся метанол нужно отогнать. Полученную массу вылить в 5-7-кратное количество воды со льдом, нейтрализовать содой и дважды экстрагировать эфиром /по 100 мл/. Эфирную смесь сушить углекислым ка- лием /К СОд/, отфильтровать и перегнать под вакуумом с использованием водоструйного насоса. Полученную прозрачную светлую жидкость анализировали на газовом хроматографе "Цвет-4" с ка- . тарометром. Содержание метилбензоата, как основного вещества, составляло 99,5%.
Дозовая зависимость токсического эффекта метилбензоата и паратолуилового эфира
Первоочередной целью токсикологических исследований является определение действия химических веществ на биологические системы и получение данных о зависимости доза-ответ. Эти данные могут обеспечить информацию о степени опасности вещества для человека и окружающей среды, связанной с его возможным воздействием при конкретном использовании.
Острая токсичность определяется как вредное действие, проявляющееся в течение короткого периода после разовой дозы в течении суток /140/.
Исследование острой токсичности направлено на установление относительной токсичности соединения, изучение характера его действия и специфического токсического эффекта.
Средне летальная доза 3 определяется как "статистически" полученное выражение разовой дозы вещества, которая вызывает гибель 50% животных /134/.
Тест на подострю токсичность включает в себя ежедневное воздействие соединения в течении 45 дней. Это обеспечивает получение информации об основных токсических эффектах соединения и поражаемых органах-мишенях /121/.
Вводимые дозы являются, как правило, кратным дозе ІД о» причем, максимальная должна оказывать выраженный токсический эффект, не вызывая гибели животных в эксперименте.
Минимальная вводимая доза не должна вызывать обнаруживаемой токсической реакции /158/.
Чтобы получить максимум информации, характеризующей доза-ответ для данного вещества, необходимо включить в эксперимент две промежуточные дозы.
Данные, полученные в результате изучения подострой токсичности вещества важны для выбора подходящих уровней доз при постановке хронического эксперимента. При этом дозы те же, что и при подостром эксперименте, лишь увеличиваются сроки ежедневного введения вещества / в течении 6 месяцев и более/.
Картина острого отравления характеризовалась вспышкой двигательной активности после введения исследуемых веществ. Через короткое время возбуждение сменялось вялостью, нарушением координации, судорогами, учащением дыхания, боковым положением. Гибель животных наступала на 2-7 сутки после интоксикации от остановки дыхания. Наблюдение за состоянием опытных животных проводили в течении двух недель.
Методом наименьших квадратов были расчитаны среднелеталь-ные дозы /Щзо/ МБ и ПТЭ. Для метилбензоата - 1177 - 186 мг/кг веса животного; для паратолуилового эфира - 2644 177 мг/кг веса животного.
Для изучения воздействия МБ и ПТЭ в подостром токсикологическом эксперименте пользовались дозами 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 1Дд0, что равно 1/5 Щ0 /МБ - 235,4 мг/кг, ПТЭ - 528,8 мг/кг/; 1/10 1Д50 /МБ - 117,7; ПТЭ - 264,4/; 1/20 Щ0 /МБ - 58,9; ПТЭ-133,2 мг/кг/; 1/50 Щ0 /МБ -23,5; ПТЭ - 52,9 мг/кг/.
Изучение диффузного проникновения метилбензоата и паратолуилового эфира через искусственные фосфолипидные мембраны
Известно, что проницаемость мембран для различных веществ зависит от свойств молекул этих веществ.Растворенные химические агенты проникают через поры мембраны сами и действуют подобно молекулярным ситам /41/. Они проникают также непосредственно через липидную фазу, которая служит растворителем для ряда соединений, обладающих малополярным характером /простые и сложные эфиры, высшие спирты и др./. Большинство других веществ проникает через биологические мембраны с помощью специфических транспортных систем, так называемых переносчиков. Скорость проникновения химических веществ зависит от растворимости в липидах /100/. Однако, поскольку для абсорбции необходимо прохождение как через водную, так и через липидную фазу, всасывание химического вещества с крайне низкой растворимостью в воде может быть затруднено, несмотря на высокий коэффициент распределения в системе липиды-вода. Этот механизм пассивной диффузии, при помощи которого в основном все вещества проникают через мембрану, заинтересовал нас. Целью нашего исследования стало изучение диффузного проникновения метилбензоата и паратолуилового эфира через искусственные фосфолипидные мембраны, которые являются модельной системой, имитирующей деятельность клеток.
Метилбензоат и паратолуиловый эфир вводили в среду инкубации в виде водной суспензии, для приготовления добавляли неон-ный детергент твин-80 в концентрации I г/л. Объем каждой добавки - 0,1 мл.
Среднелетальная доза МБ соответствовала концентрации этого вещества в воде, равной 23,54 г/л, а ПТЭ - 52,88 г/л.
При изучении длительного воздействия низких доз в токсикологическом эксперименте использовались дробные дозы ІД50» как правило, от 1/500000 до 1/5. Исходя из этого, в модельных систе-мах было изучено влияние МБ в концентрациях 4,71 10 и;4,71 10 ; 4,71-Ю"1; 4,71 мг/мл, а ПТЭ-10,6-Ю"5; 10,6 Ю"4; 10,6-КГ3; 10,6 10 2; 10,6 10 ; 10,6 мг/мл. Для исследования механизмов взаимодействия МБ и ПТЭ использовали модель плоских искусственных фосфолипидных мембран / ИМФ/с диаметром пор 0,17; 0,23; 0,85; 1,5 и 2,5 мкм, пропитанных раствором азолектина в декане /60 мг/мл/. Изучалась электропроводность системы ШШ в присутствии различных концентраций изучаемых веществ.
Взаимодействия МБ и ПТЭ с границей раздела органическая фаза и вода исследовались путем измерения граничного потенциала методом вибрирующего электрода в системах декан-вода и дека новый раствор азолектин-вода /129/.
Исходное сопротивление плоских ИМФ - из-за неконтролируемых условий формирования мембран и разного диаметра пор - колебалось в пределах от 0,2 до 14,8 I09 Ом/см2.
Результаты изучения влияния исследуемых концентраций МБ на электрическое сопротивление ИШ приведены на рис.3, а ПТЭ - на рис. 4 /представлены типичные зависимости/.
В результате приведенных исследований установлено, что изуч чаемые вещества модифицировали ИФМ, снижая их электрическое сопротивление. Характер и величина изменения электрического сопротивления ШШ не зависели от диаметра пор используемых фильтров
Изучение диффузного проникновения метилбензоата и паратолуилового эфира через искусственные фосфолипидные мембраны
Влияние метилбензоата на обмен нуклеиновыхкислот
Сложнейшая многокомпонентная система хранения и регуляции генетической информации чутко реагирует на химические факторы внешней среды. Множество химических веществ и соединений идентифицировано как ингибиторы или активаторы белкового синтеза, действующие на стадии транскрипции или трансляции. Некоторые из этих соединений обладают несколькими точками приложения, однако влияние их на биосинтез белка относится к их первичному действию /12, 163, 164, 167/.
Существует гипотеза, не признающая прямого поражения генетического аппарата клетки химическим канцерогеном или мутагеном как решающего события канцерогенеза и мутагенеза. Согласно этой гипотезе, в нормальной метаболизирующей клетке гигантские макромолекулы ДНК постоянно спонтанно претерпевают повреждения, и только в результате непрерывной работы восстановительных ферментов они сохраняют свою структуру. При действии каких либо химических агентов процесс восстановления нарушается. Изменение структуры ДНК под влиянием непосредственного или косвенного действия токсических химических веществ неизбежно должно привести к нарушению генетического кода и появлению мутантов в потомстве, а нарушение информации, необходимой для нормального синтеза ферментов, может вызвать нарушение метаболизма клетки вплоть до ее гибели /159, 169, 184, 187/.
В течение последних лет накоплен значительный материал, на основании которого многие авторы пытаются объяснить явление химического мутагенеза и канцерогенеза, вызванного различными химическими веществами, с позиции непосредственного взаимодействия мутагена или канцерогена с ДНК /115, 148, 156 ,159/ . Начальные молекулярные изменения, индуцируемые химическими канцерогенами, являются необходимой предпосылкой возникновения ракового процесса. Подтверждением того, что факторы окружающей среды оказывают прямое влияние на развитие раковых опухолей, служит химическая этиология профессионального рака у рабочих химических предприятий. Поэтому изучение обмена нуклеиновых кислот в токсикологическом эксперименте позволит установить действие этих химических веществ в молекулярном действии возможных молекулярных событий, критических для канцерогенеза и мутагенеза, а также прогнозировать отдаленные последствия их токсического действия.
В основе обезвреживания экзогенных веществ и образования активных токсических или канцерогенных метаболитов лежат катализируемые ферментами биохимические превращения детоксикации веществ в микросомах эндоплазматического ретикулома., и, по-видимому, лишь незначительная часть из них метаболизируется в токсические продукты или активные канцерогены.
Ранее было показано, что центральная нервная система наиболее чувствительна к действию метилбензоата и паратолуилового эфира или их метаболитов. С другой стороны, существует тесная взаимосвязь в смысле доставки необходимых метаболитов и удаления конечных продуктов обмена. Важную роль в этих процессах играют экскректорная функция почек и деятельность печени по нейтрализации токсических для организма метаболитов, а также реакции глюкогенеза, происходящие в печени и частично в почках.
