Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 8
І.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Состояние проблемы 14
1.1.1 Появление инсектицидов, их распространение и выявление
антихолинэстеразного действия 14
1.1.2. Характеристика фосфорорганических инсектицидов применяемых в
сельском хозяйстве и отравления, возникающие в результате их
применения 16
1.1.3. Атропин, как универсальный препарат для лечения отравлений
ФОС 22
1.1.4.Реактиваторы холинэстеразы (ХЭ) и попытка их комбинации с
атропином 23
1.2. Выбор направления исследований 25
1.2.1.Создание новых антидотов против фосфорорганических
инсектицидов 25
1.2.2. Конкурентное и неконкурентное действие обратимых ингибиторов
холинэстеразы 29
1.2.3 .Аллостерический эффект ингибиторов холинэстеразы 29
1.3 .Физиологические аспекты микроциркуляции 33
1.3.1 .Значение деформируемости эритроцитов 37
1.3.2.Факторы, определяющие деформируемость эритроцитов 40
1.3.3 .Деформируемость эритроцитов при нарушениях кислородного
обеспечения 44
1.3.4. Дистантное действие в патогенезе отравлений ФОИ 46
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1 Табличный метод 51
Метод накопления частот 52
Метод скользящей средней 54
2.4.Метод постановки опыта по наблюдению за
микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при
внутримышечном введении фосфакола в разных дозах 56
2.5.Метод определения активности ХЭ крови и деформации эритроцитов
при введении фосфакола в летальной дозе 56
2.6.Метод изучения влияния фосфакола на эритроциты в эксперименте in
vitro 57
2.7.Метод постановки опыта по наблюдению за кровотоком в пиальных
сосудах крыс при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определению
деформации эритроцитов при введении карбофоса в разных
дозах 57
2.8.Метод постановки опыта по наблюдению за микроциркуляцией
в сосудах аппекса наркотизированных крыс при применении модельного
лечебно- профилактического антидота (в составе атропина 5мг/кг и
карбоксима 5мг/кг) 58
2.9.Метод постановки опыта по изучению влияния модельного лечебно-
профилактического антидота (в составе атропина 5мг/кг и карбоксима 5 мг/кг)
на деформацию эритроцитов 59
З.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 60
3.1. Определение летальных доз фосфакола, атропина и карбоксима 60
3.1.1. Определение летальной дозы атропина при введении его самцам
мышей внутрибрюшинно 60
3.1.2. Определение летальной дозы фосфакола при подкожном
введении 63
3.1.3. Определение ЛД50 карбоксима для мышей при внутрибрюшинном
введении 67
3.2. Оценка эффективности зашиты атропина и карбоксима при их
профилактическом применении 72
3.2.1.Оценка эффективности зашиты атропина (10 мг/кг в/бр) при его
профилактическом применении 72
3.2.2. Определение эффективности защиты карбоксима (15 мг/кг п/к) при
отравлении мышей фосфаколом 76
3.3. Оценка возможности потенцирования защитного действия атропина с
помощью карбоксима 79
3.3.1.Определение времени возникновения судорог и смерти при 2ДД99=2,5
мг/кг 79
3.3.2. Определение средней эффективной дозы карбоксима (в/бр) в
сочетании с атропином в дозе (5 мг/кг) при отравлении фосфаколом. Расчет по
методу Беренса 80
3.4. Оценка защитного действия атропина и карбоксима при их
совместном применении в качестве модели лечебно-профилактического
антидота против фосфорорганических инсектицидов 84
3.4.1.Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5
мг/кг в/бр) в качестве модели профилактического антидота против
фосфорорганических инсектицидов 84
3.4.2. Оценка защитного действия атропина (5 мг/кг в/бр) и карбоксима (5
мг/кг в/бр) в качестве модели лечебного антидота против
фосфорорганических инсектицидов 89
3.5.Физиологические аспекты микроциркуляции при действии
ФОИ 95
3.5.1.Результаты наблюдения за микроциркуляцией в сосудах аппекса наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола в разных
дозах 95
3.5.2. Результаты опыта по определению активности ХЭ крови и деформации эритроцитов при введении фосфакола в летальной
дозе 96
3.5.3.Результаты опыта по изучению влияния фосфакола на эритроциты
в эксперименте in vitro 98
3.5.4.Результаты постановки опыта по наблюдению за кровотоком в
пиальных сосудах крыс при введении карбофоса в дозе ЛД50 и определению
деформации эритроцитов при введении карбофоса в разных
дозах 99
3.5.5.Результаты опыта по наблюдению за микроциркуляцией в сосудах
аппекса наркотизированных крыс при применении модельного ЛПА (в
составе атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) 102
3.5.6.Результаты опыта по изучению влияния модельного ЛПА (в составе
атропина 5 мг/кг и карбоксима 5 мг/кг) на деформацию эритроцитов 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЬЮОДЫ 109
БИБЛИОГРАФИЯ 112
Список сокращений:
АТФ - аденозинтрифосфат
АХ - ацетилхолин
АХЭ - ацетилхолинэстераза
ДФФ - диизопропилфторфосфат
ЕД - еденица действия
ИГЗ - индекс гарантированной защиты
ИДЭ - изменение деформации эритроцитов
ИЗ - индекс защиты
ИХЭ - ингибиторы холинэстеразы
КН- кривая наклона
ЛД - летальная доза
ЛПА - лечебно-профилактический антидот
М-ХР - мускариновые холинорецепторы
Н-ХР - никотиновые холинорецепторы
ПН - показатель наклона
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
ТЭПФ - тетраэтилпирофосфат
ФОВ - фосфорорганические вещества
ФОИ - фосфорорганические инсектициды
ФОП - фосфорорганические препараты
ФОС - фосфорорганические соединения
ХОС - хлорорганические соединения
ХР - холинорецепторы
ХЭ - холинэстераза
ЦНС - центральная нервная система
ЭВМ - электровычислительная машина
Введение к работе
Актуальность темы. Многие кровососущие насекомые и паукообразные являются переносчиками возбудителей целого ряда инвазионных, инфекционных и вирусных болезней животных и человека. Помимо этого, вкусовые качества мяса ухудшаются из-за резкого снижения содержания аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов (Филлипов и др.,1997; Гурьева и др.,1997; Miller et al.,1995; Ney et al.,1990). Поэтому ежегодно затрачиваются большие средства на организацию лечебно-профилактических мероприятий, направленных на борьбу с эктопаразитами. При арахноэтомозах применяют инсектоакарициды, которые обладая длительной персистентностью, способны убивать как взрослых насекомых клещей, так и их преимагинальные стадии. С этой целью, например, прикрепляются ушные бирки фирмы «Флектрон», которые содержат перметрин, длительно защищающий животных от нападения членистоногих. Для профилактики эффективны ивомек и цидектин. Против гнуса и его отдельных компонентов высокоэффективна обработка крупного рогатого скота, лошадей и оленей водной эмульсией оксамата, терпиноидного репиллента и перитроидов различной концентрации. Инсектоакарициды защищают животных от нападения членистоногих и тем самым профилактируют заражение их возбудителями трансмиссивных болезней. Из большого числа рекомендованных для борьбы с эктопаразитами препаратов наиболее широкое применение получили аббат (дифос), байтекс, ДЦВФ, дибром. Дурсбан, карбофос, метатион применяют согласно действующей инструкции. Эффективен биопрепарат бактокулицид, а также аналоги ювенильных гормонов (альтозид, димилин). Применяют также аэрозоли, получаемые из 1-2 % масляных растворов или эмульсий ДДВФ., а также используются ХОС и ФОС, карбоматы.
Все перечисленные выше инсектоакарициды не только спасают животных от эктопаразитов, но являясь в большинстве своем ХОС и ФОС, оказывают существенный вред, как организму животных, так и способствуют возникновению у человека как острого, так и хронического отравления (Ливанов и др., 1997).
Отравления ФОИ как в бьпу, так и в сельском хозяйстве, в том числе на животноводческих фермах встречаются достаточно часто. В России в 1990 г пострадавшие от интоксикации ФОС составляли 9-15% от общего числа госпитализированных по поводу отравлений. В 1996г летальность при отравлении ФОИ в разных годах и областях России колебалась от 7% в Кемеровской области до 25% в Екатеринбурге. В первые годы двадцать первого века во всем мире ФОИ на производстве, в бьпу, на полях и на животноводческих фермах вызывали до 3000 000 отравлений в год (Прозоровский, 1969; Махмудов и др.,2004).
Первые сообщения о фосфорорганических отравляющих веществах (ФОВ) появились в литературе лишь после окончания второй мировой войны. Из-за высокой токсичности и химической стойкости большую потенциальную опасность представляют пестициды и инсектициды из группы ФОС. Накапливаясь в почве, воде и продуктах питания, они создают предпосылки для острых и хронических отравлений. ФОС обладают разносторонним действием на организм, которое охватывает многие органы и системы (Прозоровский и др., 1997). Это связано с тем, что ФОС, как нервные яды избирательного холинэргического действия, оказывают влияние на все нервные структуры, в которых передача импульсов осуществляется посредством медиатора ацетилхолина (ЦНС, секреторные железы, гладкая мускулатура бронхов, кишечника, сосудов; сердце, ганглионарные и нервно-мышечные синапсы, мозговое вещество надпочечников) (Кривой и др.,1987). Первой и ведущей токсической реакцией является связывание и инактивация фермента холинэстеразы (Голиков,1970). В результате в процессе интоксикации наступают нарушения
центральной гемодинамики, выраженные изменения свёртывающей системы крови и её реологических свойств, нарушения микроциркуляции крови и др. явления, протекающие на фоне стресса. Т.о., ацетилхолин (АХ) накапливается и вызывает сначала гиперэффекты внутри синапса, а затем поступает в кровь, осуществляя околосинаптическое и дистантное действие (Скопичев и др., 2000). В результате высвобождения гастамина базофилами повышается проницаемость стенок мелких сосудов, развивается спазм гладкой мускулатуры и другие общие нарушения в организме, которые еще более утяжеляют состояние организма.
Поскольку в настоящее время лечебно-профилактических антидотов против фосфорорганических инсектицидов в сельском хозяйстве не существует, мы попытались создать модель лечебно-профилактического антидота, при этом в качестве основных его компонентов использовать достаточно дешевые и доступные отечественные препараты (такие как атропин и карбоксим), что существенно снизит себестоимость данного антидота. Помимо прочего, компоненты антидота применялись в достаточно малых (неэффективных) дозах, поэтому полученный модельный ЛПА является не токсичным, а следовательно не вызывает повторного отравления самим противоядием.
Цели и задачи исследования. Основной целью исследования являлось обоснование возможности использования нового реактиватора холинэстеразы карбоксима для создания модельного антидота предназначенного для лечебно-профилактического использования в животноводческой практике, а также определить его влияние на кровеносную систему, в частности, на скорость кровотока и деформацию эритроцитов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1.Определить летальные дозы (ЛД50) атропина и карбоксима оценить их эффективность при отравлении мышей фосфаколом.
2.Выяснить подпороговую по эффективности дозу карбоксима и атропина при профилактическом введении которой мышам, она обеспечивает выживаемость 50% животных, получивших фосфакол в дозе 2ДЦ99..
3.Оценить подобранные дозы в условиях профилактического и лечебного применения с целью сопоставления их преимуществ перед отдельными компонентами антидота.
4.Выяснить влияние фосфорорганических инсектицидов (фосфакол и карбофос) на скорость кровотока в сосудах аппекса крыс.
5.0пределить причину деформации эритроцитов в опытах in vitro и in vivo при действии фосфорорганическими инсектицидами.
б.Изучить влияние созданного модельного лечебно-профилактического антидота на скорость кровотока и деформацию эритроцитов.
Научная новизна работы. Впервые карбоксим применяется в качестве
одного из компонентов профилактического антидота в составе комплекса с
атропином в подпороговых дозах. Изучены и представлены
дополнительные свойства карбоксима, кроме известного свойства, как реактиватора холинэстеразы.
Показана эффективность подпороговых доз атропина и карбоксима при совместном их применении в качестве компонентов модельного лечебно-профилактического антидота.
Впервые атропин и карбоксим применяются в неэффективных (очень малых) дозах, что обеспечивает отсутствие токсического эффекта антидота, а, следовательно, гарантирует его безопасность.
Впервые выявлена, деформация эритроцитов, связанная с появлением в крови «волны» выбрасываемого нервными окончаниями ацетилхолина, действующего на незащищенные холинэстеразой клетки.
Показано, что деформированные эритроциты образуют конгломераты, которые существенно нарушают микроциркуляцию крови и способствуют возникновению гемической гипоксии.
Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также к существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1**(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%).
Практическое значение работы. Созданный модельный антидот может быть принят за основу создания лечебно-профилактического антидота для работников сельского хозяйства, принимающих участие в обработке лшвотных от эктопаразитов при помощи фосфорорганических инсектицидов. Выявлены преимущественно новые свойства карбоксима, как обратимого ингибитора холинэстеразы аллостерического действия, которые могут быть использованы для создания других антидотов, в том числе антидотов против фосфорорганических отравляющих веществ.
Созданный модельный лечебно-профилактический антидот может быть использован в дальнейшем для более подробного изучения его влияния, не только на кровеносную, но и на другие системы организма.
Положения, выносимые на защиту:
1. Карбоксим уже в дозе 1/100 способен потенцировать защитный эффект атропина при отравлении фосфорорганическими соединениями, что говорит о возможности использования карбоксима не только как реактиватора холинэстеразы, но как аллостерического обратимого ингибитора холинэстеразы.
2.Применение одного атропина и карбоксима в качестве самостоятельных средств защиты фактически оказалось не эффективным, тогда как совместное применение как лечебного, так и особенно профилактического комплекса атропина с карбоксимом обеспечивает выраженный профилактический и лечебный эффекты.
3.Создана модель лечебно-профилактического антидота, при этом его компоненты: атропин (5мг/кг) и карбоксим (5мг/кг) использовались в
неэффективных (достаточно малых дозах), в результате этого полученная модель лечебно-профилактического антидота не является токсичной, следовательно, не вызывает опасности появления побочных эффектов.
4. Установлено, что применение лечебно-профилактического антидота приводит к нормализации скорости кровотока до физиологической нормы 158±15об/мин., а также существенному снижению деформации эритроцитов при профилактическом применении антидота до 39,1±0,1**(%); при лечебном применении до 39,3±0,5** (%).
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ, 2006, 2007, 2008), на 59-й, 60-й, 61-й, 62-й научных конференциях молодых ученых и студентов (Санкт-Петербург, СПбГАВМ,, 2006, 2007, 2008).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7-х печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа содержит 14 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 151 наименований, в том числе 35 иностранных авторов.
