Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Халькогены. Физико-химические свойства, биологическая активность, метаболизм в клетках эукариот и прокариот 14
1.2. Окислительный стресс: механизмы развития и предотвращения 30
1.3. Антитоксическая активность халькогенорганических соединений при интоксикации солями кадмия, свинца и ртути 56
1.4. Антибактериальная активность халькогенорганических соединений в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов 73
1.5. Гормоноподобное действие синтетических нестероидных соединений 90
Глава 2. Материалы и методы исследования 108
2.1. Халькогеноорганические препараты, использованные в исследовании .108
2.2. Постановка эксперимента 109
2.2.1. Подготовка препаратов к исследованиям 109
2.2.2. Подготовка биологического материала 111
2.2.3. Изучение свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантного статуса в тканях мышей .112
2.2.4. Изучение антитоксического действия халькогенорганических препаратов при подостром отравлении солями тяжелых металлов 113
2.2.5. Изучение антибактериальной активности халькогенорганических соединений 115
2.2.6. Изучение гормоноподобного действия халькогенорганических соединений 116
2.3. Методы исследования 117
2.3.1. Методы изучения свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы 117
2.3.2. Методы исследования биохимических показателей плазмы крови .121
2.3.3. Методы исследования гематологических показателей плазмы крови .123
2.3.4. Методы определения показателей углеводного обмена .126
2.3.5. Определение антибактериального действия халькогенорганических соединений по числу выросших клеточных колоний 129
2.4. Квантово-химические расчеты .130
2.5. Компьютерное прогнозирование биологической активности с использованием компьютерной системы предсказания спектра биологической активности (PASS C&T) 131
2.6. Статистические параметры, использованные в работе .133
Глава 3. Антиоксидантная активность халькогенорганических соединений .134
3.1. Антиоксидантные показатели гемолизата эритроцитов, плазмы крови и тканей интактных мышей с различной оксидорезистентностью 135
3.2. Концентрации продуктов перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью 137
3.3. Активность антиоксидантных ферментов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью .140
3.4. Механизм антиоксидантного действия халькогенорганических соединений 147
Глава 4. Антитоксическое действие халькогенорганических соединений при интоксикации солями тяжелых металлов 151
4.1. Оценка функциональной активности органов и тканей белых крыс при использовании халькогенорганических препаратов в качестве антитоксикантов при интоксикации солями тяжелых металлов 153
4.2. Оценка антитоксической активности халькогенорганических препаратов по результатам гематологических показателей крови крыс . 170
4.3. Механизм антитоксического действия халькогенорганических препаратов 184
Глава 5. Антибактериальная активность халькогенорганических соединений 187
5.1. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Staphylococcus aureus 187
5.2. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa 196
5.3. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Escherichia coli 205
5.4. Механизм антибактериального действия халькогенорганических соединений 214
Глава 6. Элементы структурного подобия молекул как предпосылка сходного физиологического действия халькогенорганических соединений и глюкокортикоидов 219
6.1. Компьютерное прогнозирование биологической активности
халькогенорганических соединений, полученные с использованием компьютерной системы предсказания спектра биологической активности PASS 220
6.2. Квантовохимические расчеты, подтверждающие структурное сходство селеноорганического соединения ДАФС-25, его производных и глюкокортикоидов 226
6.3. Влияние препарата ДАФС, его производных и преднизолона на показатели
углеводного обмена экспериментальных животных 230
Заключение 236
Выводы 261
Список использованной литературы
- Антибактериальная активность халькогенорганических соединений в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов
- Методы изучения свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы
- Концентрации продуктов перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью
- Оценка антитоксической активности халькогенорганических препаратов по результатам гематологических показателей крови крыс
Введение к работе
кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян
Актуальность исследования. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, количество и характер потребляемых продуктов питания являются одними из основных факторов, определяющих здоровье человека (ВОЗ, 1993). По современным данным, до 80% населения России имеет недостаточную обеспеченность селеном (Сенькевич О.А. и др., 2011; Давыденко Н.И. и др., 2012). В то же время проблема болезней, связанных с дефицитом селена, остается нерешенной до сих пор (Распоряжение Правительства Российской Федерации № 1873-р). В этой связи значительную актуальность приобретает коррекция питания населения с целью снижения распространенности селенодефицитных состояний (Баранова Т.А., 2008; Ширшова Т.И. и др., 2011).
В настоящее время для борьбы с селенодефицитом применяются биологически активные добавки, содержащие неорганический селен, главным образом селенит натрия (Перепелкина Л.И. и др., 2012). В то же время органические соединения селена по сравнению с неорганическими являются менее токсичными, более биодоступными и лучше усваиваемыми живыми организмами. Поэтому научные разработки последних лет направлены на синтез и использование органических форм селена в целях профилактики селенодефицита и ряда заболеваний (беломышечной болезни, некроза и жирового перерождения печени, экссудативного диатеза, энцефаломаляции, расстройства сперматогенеза и др.) (Комзалова А.В. и др., 2012; Бикчантаев И.Т., Шакиров Ш.К., 2013; Фроловичев А.С., Трошин А.Н., 2013).
Одним из перспективных селеноорганических соединений является диацетофенонилселенид (ДАФС-25) (производитель: ЗАО «Сульфат», г. Саратов), который позволяет нормализовать деятельность иммунной, антиоксидантной и детоксицирующей систем организма животных и птиц, приводит к увеличению яичной и мясной продукции (Древко Б.И. и др., 2001; Иванова И.В., 2009). ДАФС-25 в 40 раз менее токсичен селенита натрия, селен в нем находится в органической, более доступной для животных форме (Кулешов К.А., Трифонов Г.А., 2008). Известно, что селен расположен в VI группе Периодической системы элементов Д.И. Менделеева, все элементв которой относятся к халькогенам, являются электронными аналогами и обладают сходными химическими свойствами, что, вероятно, будет обусловливать близость биологических свойств этих элементов и их соединений (Паперная Л.К., 2007).
В связи с этим несомненный интерес представляло бы обнаружение взаимосвязи между структурой и биологической активностью халькогенов (серы, селена, теллура), расположенных в VI группе Периодической системы элементов Д.И. Менделеева. В настоящее время отсутствуют систематизированные данные о биологической активности халькогенорганических соединений.
Целью исследования явилось установление биологической активности халькогенорганических соединений в зависимости от их структуры, включая наличие гетероатома халькогена (серы, селена, теллура) и боковых заместителей (атомов хлора, фтора и нитрогрупп) в составе этих соединений.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние халькогенорганических соединений на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей.
-
Установить эффекты халькогенорганических соединений на отдельные стороны обмена веществ и функциональное состояние тканей крыс при интоксикации сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути, а также оценить интоксикацию тяжелыми металлами и антитоксическое действие халькогенорганических соединений по гематологическим показателям крови крыс и лейкоцитарным индексам интоксикации.
-
Выявить способность халькогенорганических соединений подавлять рост клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa.
-
Установить влияние халькогенорганических соединений и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обменов мышей.
-
Провести компьютерное прогнозирование биологической активности халькогенорганических соединений при помощи системы PASS C&T, а также квантовохимические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25, его производных и ряда стероидных гормонов.
-
Установить структурно-функциональные закономерности, объясняющие разнообразные биологические свойства органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), а также различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы).
Научная новизна работы. В работе впервые установлена взаимосвязь между структурой органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) и их биологической активностью.
Впервые доказано, что нитро- и хлорсодержащие производные ДАФС-25 оказывают антиоксидантное действие, которое выражалось в снижении концентрации продуктов перекисного окисления липидов и увеличении активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в тканях и крови мышей.
Впервые установлена антитоксическая активность нитро- и хлорсодержащих производных ДАФС-25, а также его серосодержащего аналога при интоксикации экспериментальных животных солями тяжелых металлов: сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути.
Впервые показана зависимость антибактериальной активности соединений от их токсичности. В ряду селеноорганических соединений наиболее токсичный препарат - фторированный аналог ДАФС-25, а в ряду халькогенпроизводных ДАФС-25 - теллурорганическое соединение, которые подавляли рост колоний клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa даже в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл.
В работе впервые проведен компьютерный анализ биологической активности селен-, серо и теллуроорганических соединений, а также квантово-химические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5), его производных и ряда стероидных гормонов. Установлено сходное действие ДАФС-25 и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обменов экспериментальных животных.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Халькогенорганические соединения в зависимости от наличия гетероатома халькогена (серы, селена и теллура) и боковых заместителей (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) в различной степени оказывают влияние на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25); 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 демонстрируют лучшие антиоксидантные свойства.
-
Соли тяжелых металлов (сульфат кадмия, нитрат ртути и нитрат свинца) вызывают гепато- и нефротоксический эффект у белых крыс. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 обладают низкой токсичностью и при предварительном введении per os крысам снижают интоксикацию солями тяжелых металлов, о чем свидетельствуют биохимические, гематологические показатели крови крыс и лейкоцитарные индексы интоксикации. Серосодержащий аналог препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-тиапентандион-1,5) оказывает аналогичное действие, тогда как теллурсодержащее соединение в силу своей собственной токсичности не проявляет антитоксической активности при интоксикации солями тяжелых металлов.
-
Способность халькогенорганических соединений подавлять рост колоний клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa зависит от токсичности соединений. Наибольшей токсичностью и антибактериальной активностью обладают соединения 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллуропентандиона-1,5 даже в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл.
-
Соединение ДАФС-25 оказывает стимулирующее действие на отдельные стороны углеводного и белкового обменов мышей подобно глюкокортикоидному препарату преднизолону.
-
Согласно квантово-химическим расчетам, молекула препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандиона-1,5) наиболее близка к молекулам глюкокортикоидов преднизону и преднизолону как по размеру, так и по расстояниям между полярными реакционноспособными группами, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором как посредством электростатических сил, так и за счет водородных связей.
-
В ряду халькогенорганических соединений, лишенных боковых заместителей (1,5-дифенил-3-тиапентандион-1,5;1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллурапентандион-1,5), а также в ряду ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандиона-1,5) и его производных, содержащих боковые заместители (1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандиона-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5) установлены следующие закономерности: снижаются антиоксидантная и антитоксическая активности, возрастает антибактериальное действие.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе данные представляют существенный интерес для фундаментальной науки в понимании молекулярных механизмов реализации биологической активности органических соединений серы, селена и теллура. Экспериментально показана антитоксическая активность соединения 1,5-дифенил-3-тиапентандиона-1,5, что можно связать с наличием в структуре этого соединения фенильных радикалов, лишенных боковых заместителей. Результаты исследований позволяют рекомендовать соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 и 1,5-дифенил-3-тиапентандиона-1,5 для дальнейших исследований с перспективой использования в качестве протекторов для предотвращения отравления тяжелыми металлами на производстве и средств, повышающих окислительную резистентность организма, а соединения 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллуропентандиона-1,5 могут применяться при госпитальных инфекциях, либо в качестве бактериостатических средств в медицинской практике и ветеринарии. Получены свидетельство на полезную модель № 22478 от 21.11.2001 «Кювета для выращивания микроорганизмов» и патент № 016974 от 26.04.2007 «Средство для лечения и профилактики отравлений соединениями тяжелых металлов». Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре биохимии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России.
Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации докладывались на межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), 2-ой международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010), IХ межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2010), VII международной научно-практической конференции «Ключевые вопросы в современной науке» (София, 2011), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), Международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Франция, Париж, 2013), Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (ОАЭ, Дубай, 2013), Международной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ, в том числе 13 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 монография; получены 2 патента на изобретения № 016974 от 26.04.2007 и №2011118470/15 от 06.05.2011 и свидетельство на полезную модель № 22478 от 21.11.2001. Общий объем публикаций 13,19 п.л., личный вклад 60%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, постановки эксперимента, методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 43 таблицы и иллюстрирована 19 рисунками. Список использованной литературы включает 528 наименований, в том числе 431 зарубежный источник.
Антибактериальная активность халькогенорганических соединений в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов
Халькогены расположены в VI главной подгруппе (или 16-ой группе по новой номенклатуре ЮПАК) периодической системы элементов Д.И. Менделеева. К халькогенам относятся кислород (О), сера (S), селен (Se), теллур (Te) и полоний (Ро). Групповое название этих элементов - халькогены (термин "халькоген" происходит от греческих слов "chalkos"-медь и "genos"-рожденный), то есть "рождающие медные руды", обусловлено тем, что в природе они встречаются чаще всего в форме соединений меди (сульфидов, оксидов, селенидов и т.д.) [Fischer W., 2001].
У атомов халькогенов одинаковое строение внешнего энергетического уровня — ns2nр4. Электронная конфигурация серы - 3s23р4 , селена - 3d10 4s2р4, теллура - 4d105s25р4. Следовательно, селен и теллур являются полными электронными аналогами, что определяет общность химических свойств этих элементов и их соединений. В отличие от теллура селен и сера являются неполными электронными аналогами, полная электронная аналогия между этими элементами наблюдается только в низшей и нулевой степенях окисления. К тому же для серы и селена в низшей степени окисления характерны очень близкие размеры ионных радиусов (0,184 нм и 0,198 нм соответственно). Этим объясняется сходство их химических и биологических свойств. Все халькогены в соединениях с водородом и металлами проявляют степень окисления -2, а в соединениях с кислородом и другими активными неметаллами — обычно +4 и +6. Такие значения степеней окисления следуют из электронного строения халькогенов [Гринвуд Н.Н., Эрншо А., 2008]. Некоторые свойства атомов халькогенов представлены в таблице 1.
Нахождение в природе В свободном состоянии в атмосфере (О2 кислород, О3 озон), в связанном в составе Н2О, SiO2, в сложных соединениях Самородная сера; сульфиды: свинцовый блеск PbS, медный блеск Cu2S, пирит FeS2, сероводород H2S; сульфаты: гипс CaS04-2H20, горькая соль MgSOr7H20, белки Редкий элемент, содержится в малом количестве в самородной сере, сульфидных рудах Редкий элемент, содержится в маломколичестве в самородной сере,сульфидных рудах Редкий радиоактивный элемент
Физические свойства О2 бесцветный газ без вкуса и запаха, умеренно растворим в воде, парамагнитен. O3 газ синего цвета, диамагнитен, сильный окислитель S-ромбическая желтые хрупкие кристаллы без запаха, нерастворима в воде, = 2 г/см3; S-пластическая коричнево-желтая, резиноподобная Кристаллическое вещество с металлическим блеском, = 4,8 г/см3, темно-серый, полупроводник = 6,3 г/см3, серебристо-белый, хрупкий с металическим блеском полупроводник = 9,3 г/см3, мягкий, серебристо-белый, радиоактивный металл
Продолжение таблицы Химические свойства По активности уступает только фтору, реагирует со всеми простыми веществами, (исключение: галогены, Pt , Au, инертные газы) и со многими сложными веществами И окислительные, и восстановительные свойства СвойстватипичногонеметаллаSe + 02 SeO2Se + Cl2 SeCl2Se + H2 H2Se Слабовыраженные металические свойства Проявляетсвойстваметалла
Получение Фракционная перегонка жидкого воздуха; в лаборатории при термическом разложении CrO3, KNO3, RClO3, BaO2 В промышленности: из самородных руд. В лаборатории: окислением сероводорода, сульфидов Из отходов цветной металлургии и сернокислой промышленности, особо чистые дистилляцией в вакууме и зонной плавкой Искусственно облучением висмута в ядерных реакторах
Применение Для получения серной иазотной кислот;для выплавки чугуна и стали;для резки и сварки металла;как окислитель ракетноготоплива;в органическом синтезе. Для получения серной кислоты;в сельском хозяйстве для борьбы с вредителями; производство спичек; вулканизация каучука; в производстве черногопороха. Производство фотоэлементов и выпрямителей электрического тока В полупроводниковой технике 17 При переходе от кислорода к полонию размер атомов и их возможные координационные числа увеличиваются, а энергия ионизации (Еион) и электроотрицательность уменьшаются. По электроотрицательности кислород уступает лишь атому фтора, а атомы серы и селена также азоту, хлору, брому; кислород, сера и селен относятся к типичным неметаллам.
У атома кислорода на 2р-подуровне два неспаренных электрона. Его электроны не могут разъединяться, поскольку отсутствует d-подуровень на внешнем (втором) уровне, т. е. отсутствуют свободные орбитали. Поэтому валентность кислорода всегда равна двум, а степень окисления -2 и +2 (например, в Н2О и ОF2). Таковы же валентность и степени окисления у атома серы в невозбужденном состоянии. При переходе в возбужденное состояние (что имеет место при подводе энергии, например при нагревании) у атома серы сначала разъединяются 3 р-, а затем 3 s-электроны. Число неспаренных электронов, а, следовательно, и валентность в первом случае равны четырем (например, в SO2), а во втором — шести (например, в SO3). Очевидно, четные валентности 2, 4, 6 свойственны аналогам серы — селену, теллуру и полонию, а их степени окисления могут быть равны -2, +2, +4 и +6.
Se, Te и Po соединяются непосредственно с большинством простых веществ, хотя и труднее, чем О и S. Среди их соединений наиболее устойчивы селениды, теллуриды и полониды металлов, но их устойчивость ниже, чем у аналогичных оксидов и сульфидов.
В подгруппе халькогенов сверху вниз с увеличением заряда атома закономерно изменяются свойства элементов: уменьшается их неметаллический характер и усиливаются металлические свойства. Так кислород типичный неметалл, а полоний металл (радиоактивен).
Биологическая роль халькогенов (серы, селена и теллура) Биологическая роль серы исключительно велика. Сера является биогенным элементом, выполняющим важные функции: входит в состав серосодержащих аминокислот метионина, цистеина и цистина, витаминов (тиамин, биотин, липоевая кислота) и кофермента А (КоА SH), а также гормонов (инсулин, вазопрессин, окситоцин и некоторые другие). Сера участвует в формировании конформации белковой молекулы благодаря образованию дисульфидных связей, участвует в формировании активных центров ферментов за счет сульфгидрильной (–SH) группы остатка аминокислоты цистеина. Сера в составе метионина участвует в транспорте метильных групп в процессе синтеза лецитина [Petti A.A. et al, 2012].
Аминокислота цистеин в составе глутатиона участвует в окислительно восстановительных реакциях. Железосерные белки являются компонентом митохондриальной цепи переноса электронов и участвуют в процессе тканевого дыхания. Сера способна к образованию богатых энергией связей в макроэргических соединениях. Производное аминокислоты цистеина биогенный амин таурин - участвует в синтезе парных желчных кислот.
Серосодержащие соединение фосфоаденозинфосфосульфат (ФАФС) участвует в обезвреживании токсинов в печени [Jung Y.S. et al., 2013]. Сера является компонентом простетической группы структурного белка коллагена хондроитинсульфата [Erickson J.M., Messer T.M., 2013]. Хондроитинсульфат присутствует в коже, хрящах, ногтях, связках и клапанах миокарда.
Важными серосодержащими метаболитами также являются гемоглобин, гепарин, цитохромы, фибриноген, иммуноглобулины и сульфолипиды.
В медицинской практике применение серы основано на ее способности при взаимодействии с органическими веществами организма образовывать сульфиды и пентатионовую кислоту, от присутствия которых зависят кератолитические (растворяющие - от греч. keras - рог и lytikos -растворяющий), противомикробные и противопаразитарные эффекты. Сера входит в состав мази Вилькинсона и других препаратов, применяемых для лечения чесотки [Утц С.Р. и др., 2011]. Очищенную и осажденную серу употребляют в мазях и присыпках для лечения некоторых кожных заболеваний (себорея, псориаз и других); в порошке - при глистных инвазиях (энтеробиоз); в растворах - для пиротерапии прогрессивного паралича и других. Сера входит в состав многих других лекарственных фармпрепаратов седативного, нейролептического, противоопухолевого действия (тиопентал, тиопроперазин, тиоридазин и др.) [Костюченко С.И., 2013]. Соединения серы в виде сульфаниламидных препаратов (бисептол, сульфацил-натрия, сульгин и др.) обладают противомикробной активностью [Лекарь А.В. и др., 2011].
Методы изучения свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы
Гормоноподобная активность фитоэстрогенов может быть связана, как полагают некоторые авторы, и с другими механизмами. Выявлена способность фитоэстрогенов стимулировать образование в печени глобулинов, связывающих половые стероиды [Aldercreutz H. et al., 1993], и таким путем модулировать биологическую активность эндогенных половых гормонов. Установлено, что ряд изофлавоноидов и лигнанов, влияя на активность ферментов ароматазной системы, могут ингибировать переход андростендиона в эстрон, а последнего – в 17-бета эстрадиол [Henderson B.E. et al., 1988]. Показано также, что изофлавоноид генистейн ингибирует активность тирозинспецифической протеинкиназы, “работающей на уровне рецепторов”, к ряду ростовых факторов: эпидермальному, инсулиноподобному, тромбо- и моноцитарному, играющих важную роль в регуляции процессов пролиферации и трансформации клеток [Shutt D.A. et al., 1972.].
Из коры надпочечников выделено большое число гормонов, получивших название кортикостероидов. В зависимости от той роли, которую играют эти вещества в организме, их разделяют на две основные группы: минералокортикоиды и глюкокортикоиды.
Минералокортикоиды, основными представителями которых являются альдостерон и дезоксикортикостерон (4-прегнен-21-ол-3,20-дион), играют большую роль, как показывает само название, в регуляции минерального обмена [Харкевич Д.А., 2006.]. Они способствуют задержке в организме воды и натрия, повышают выделение из организма калия, усиливают явления анаболизма (синтез белка), усиливают воспалительные процессы (повышают «воспалительный потенциал» организма, т. е. способность отвечать на определенной силы раздражения воспалительной реакцией определенной интенсивности), в больших дозах вызывают гипертонию, склероз почек, артриты, отеки. Глюкокортикоиды, к которым относится гидрокортизон и кортизон, в меньшей степени влияют на минеральный обмен и в большей — на углеводный и белковый обмены [Харкевич Д.А., 2006.]. Они вызывают усиление катаболизма (повышают распад белков и усиливают образование глюкозы). Глюкокортикоиды обладают противовоспалительным действием (снижают «воспалительный потенциал»), уменьшают количество лимфоцитов и эозинофилов в крови и вызывают инволюцию вилочковой железы и лимфатической системы, а также снижают резистентность организма к инфекциям. Со стороны нервной системы они вызывают эйфорию и бессонницу.
Очень большое значение в медицине приобрели противовоспалительные кортикостероиды — кортизон (4-прегнен-17,21-диол-3,11,20-трион) и гидрокортизон (4-прегнен-11,17,21-триол-3,20-дион). Наряду с указанными веществами применяются и их синтетические аналоги, многие из которых оказались значительно более активными и вызывающими меньше побочных явлений, чем естественные гормоны. К таким веществам относятся преднизон (1-дегидрокортизон) и преднизолон (1-дегидрогидрокортизон), в 5 раз более активные по сравнению с естественными гормонами. Еще более активным оказался 9-фторпреднизолон, в 15 раз превосходящий по активности кортизон. Наиболее активным из известных в настоящее время препаратов является 9-фтор-16-метилпреднизолон (дексаметазон, декадрон), противовоспалительная активность которого в 190 раз выше, чем кортизона [Харкевич Д.А., 2006.].
Кортизон и его аналоги находят широкое применение в медицине как средства, снижающие патологически повышенную реактивность, в частности, как мощные противовоспалительные агенты. Эти препараты применяют при ревматизме, инфекционном полиартрите, бронхиальной астме, красной волчанке и при многих других кожных заболеваниях, а также заболеваниях глаз и т. п. Важным является применение кортизона и его аналогов при остром лейкозе, когда они в комбинации со специфическими средствами дают длительные ремиссии. Следует заметить, что применение кортизона может сопровождаться целым рядом побочных явлений. К ним относятся появление отеков, отложение жира в подкожной клетчатке лица (лунообразное лицо), шеи, затылка и области ключиц, гипергликемия и другие нарушения обмена, возбуждение, бессонница, функциональные психоневрозы, половые расстройства, развитие хрупкости костей (остеопороз), наклонность к развитию язвы желудка, нарушение роста в молодом возрасте. Все эти явления проходят при отмене препарата [Харкевич Д.А., 2006.]. Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно высказать предложение 0 двух основных механизмах действия гормоноподобных веществ: 1 – взаимодействие вещества с рецептором, приводящее к его активированию или блокированию, сопровождающегося дальнейшим изменением (усилением или ослаблением) внутриклеточной передачи сигнала, 2 – изменение активности ферментов, участвующих в метаболизме (синтезе или обезвреживании) природных гормонов. Для подтверждения первого механизма действия гормоноподобных веществ необходимо познакомится со структурой рецепторов половых и корковых гормонов.
Исследования последних лет показали, что андрогеновые рецепторы (АР) принадлежат к суперсемейству ядерных рецепторов (ЯР), транксрипционные факторы которых регулируют транскрипцию генов при связывании лиганда. У ядерных рецепторов выделяют следующие общие черты организации: вариабельный функциональный домен активации (ФДА-1), ДНК-связывающий домен (ДСД), шарнирный участок, отвечающий за ядерную сигнализацию, С-концевой лиганд-связывающий домен (ЛСД), включающий 12 спиральных структур, которые замыкают центральный лиганд-связывающий карман (ЛСК), а также второй функциональный домен активации (ФДА-2), который локализован у С-конца лиганд-связывающего домена и является посредником лиганд-зависимой трансактивации [Caboni L. et al., 2012.]. Андрогеновые рецепторы активируются эндогенным гормоном тестостероном и его более мощным метаболитом дигидрокситестостероном (ДГТ) за счет взаимодействия с лиганд-связывающим карманом. Связывание этих эндогенных модуляторов вызывает перестройку 12-й спирали в составе рецептора, сопровождающуюся образованием структурированной гидрофобной поверхности, способной связывать агонист и образовывать второй функциональный домен для дальнейшей активации ядерного рецептора. Благодаря образованию второго функционального домена происходит «переключение» и дальнейшая транскрипционная активация ядерного рецептора [Caboni L. et al., 2012.].
Концентрации продуктов перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью
Следовательно, биологическая активность металлов связана с их способностью связываться с белками, блокировать многие ферментные системы, повреждать клеточные мембраны, повышать проницаемость барьеров, что в итоге ведет к токсическим изменениям в клетках и органах. Соединения металлов, хорошо растворимые в воде и биологических жидкостях, легче проникают через биологические барьеры и вызывают нарушения в организме.
Любой металл, поступивший в организм, довольно быстро проникает в кровь и затем во внутренние органы. Обычно органами максимального накопления металлов в организме является печень, почки и костная система. Из внутренних органов металлы медленно, приблизительно в течение 1 месяца, выделяются из организма, преимущественно почками или кишечником.
Для оценки тяжести отравления солями тяжелых металлов и антитоксической активности халькогенорганических препаратов определяли биохимические, гематологические показатели крови крыс, а также проводили расчет лейкоцитарных индексов интоксикации.
Оценка функциональной активности органов и тканей белых крыс при использовании халькогенорганических препаратов в качестве антитоксикантов при интоксикации солями тяжелых металлов Используя биохимический анализ крови, можно оценить функциональное состояние почек, печени и других органов при интоксикации организма солями тяжелых металлов, а также проследить нормализацию биохимических показателей крови при использовании халькогенорганических препаратов в качестве антитоксикантов.
В нашем эксперименте в качестве антитоксикантов при интоксикации организма солями кадмия, свинца и ртути использовали халькогенорганические соединения: препарат диацетофенонилселенид – ДАФС-25 (соединение 1), его хлоро- (соединение 2), фторо- (соединение 3), нитропроизводные (соединение 4), а также аналоги препарата ДАФС, содержащие атомы серы (соединение 5) и теллура (соединение 6) вместо атома селена.
В плазме крови экспериментальных животных определяли концентрацию основных метаболитов (глюкозы, общего белка, альбумина, креатинина, мочевины и холестерина) и активность ферментов: аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинамнотрансферазы (АлАТ), амилазы, щелочной фосфатазы, -глутамилтрансферазы (ГГТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Биохимические показатели крови экспериментальных животных при введении per os халькогенорганических препаратов in vivo представлены в таблице 14.
Халькогенорганические препараты не оказывали значительного токсического действия на организм экспериментальных животных. Однако можно отметить увеличение концентрации глюкозы сыворотки крови на 41,2% у крыс, получавших препарат ДАФС (соединение 1) и уменьшение содержания глюкозы в плазме крови у крыс, получавших соединения 4 и 6 на 41,2% и 35,3% соответственно по сравнению с контролем (р 0,05). Достоверное увеличение содержания общего белка в плазме крови у крыс, принимавших препараты 3, 4, 5 и 6, было незначительным. Обращает внимание увеличение в плазме крови содержания мочевины и креатинина. Например, концентрация креатинина возрастала у крыс, принимавших почти все соединения на 22,0% (соединение 1), 36,5% (соединение 3), 62,9% (соединение 4), 56,6% (соединение 5) и на 87,7% (соединение 6); содержание мочевины также увеличивалось на 51,3% (соединение (соединение 3), 48,7% (соединение 5) и на 56,4% (соединение 6) соответственно по сравнению с контролем. Достоверное увеличение концентрации холестерина в сыворотке крови на 46,2% наблюдалось только у крыс, получавших препарат ДАФС. Кроме того, следует отметить увеличение активности почти всех исследованных ферментов плазмы крови у крыс, принимавших халькогенорганические препараты. Активность АлАТ в плазме крови достоверно возрастала у крыс на 140,5% (соединение 1), 21,9% (соединение 3) и 31,8% (соединение 6), тогда как применение соединения 2, напротив, приводило к незначительному снижению активности этого фермента на 24.8%. Также наблюдалось увеличение активности АсАТ у крыс, получавших соединения 2, 3, 4 и 6 на 37%, 51,1%, 70,9% и 80,8% соответственно по сравнению с контролем. Активность щелочной фосфатазы также возрастала на 37,3% (соединение 2), 32,2% (соединение 3) и 42,4% (соединение 4) соответственно. Активность амилазы достоверно увеличивалась лишь у крыс, принимавших препараты 2 и 6 на 31,9% и 22,5% соответственно. Увеличение активности ЛДГ отмечалось у крыс, принимавших соединения 1, 2, 3, 4 и 6 на 20,9%, 140,4%, 32,1%, 39,7% и 32,2% соответственно по сравнению с контролем. Активность печеночного фермента ГГТ достоверно снижалась на 28,3% лишь у крыс, получавших теллуроорганическое соединение (таблица 14).
Приведенные результаты свидетельствуют о незначительном токсическом воздействии халькогенорганических соединений на организм экспериментальных животных, который выражался, главным образом, в воздействии на почки и печень крыс. Из исследованных соединений наибольший токсический эффект оказывал теллуроорганический препарат, а наименьший – серосодержащий аналог ДАФС.
Оценка антитоксической активности халькогенорганических препаратов по результатам гематологических показателей крови крыс
На примере другого синтетического глюкокортикоида – дексаметазона – показано, что его пероральное введение индуцирует экспрессию гена киназы пируватдегидрогеназы [Qi D. et al., 2004], следствием чего является снижение активности этого мультиферментного комплекса, замедление процесса окисления глюкозы и накопление пирувата и глюкозы в цитозоле клеток. Кроме того, дексаметазон уменьшает фосфорилирование фермента гликогенсинтазы, что приводит к восстановлению ее активности. Избыток глюкозы (при наличии активной гликогенсинтазы) используется для синтеза гликогена в печени, скелетных мышцах и миокарде [Qi D. et al., 2004; Puthanveetil P. et al., 2008].
Также следует отметить, что глюкортикоиды увеличивают экспрессию генов ферментов глюконеогенеза - глюкозо-6-фосфатазы и фосфоенолпируваткарбоксикиназы [Yabaluri N., Bashyam M.D., 2010], что влечет за собой усиление реакций глюконеогенеза в печени, выход свободной глюкозы в кровь и развитие гипергликемии. Субстратами для реакций глюконеогенеза могут служить аминокислоты, образующиеся в процессе катаболизма тканевых белков [Wilcke J.R., Davis L.E., 1982; Jin J.Y., Jusko W.J., 2009]. Гипергликемия усиливается за счет снижения поступления глюкозы в клетки периферических тканей [Baxter J.D., 1976; Andrews R.C., Walker B.R., 1999; Vila G. et a., 2010].
С целью изучения влияния препарата ДАФС-25 и его производных на углеводный обмен проводилось определение активности ферментов глюконеогенеза глюкозо-6-фосфатазы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы в гомогенате печени, определение концентрации гликогена в печени и крови, а также определение содержания глюкозы в плазме крови и пирувата в крови белых мышей. Поскольку основными субстратами глюконеогенеза являются пируват и оксалоацетет, нами также оценивалась активность аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ) в плазме крови.
Показателиуглеводногообмена Единицы измерения Контроль (n=12) Предни-золон (п=8) Селеноорганические соединения (n=10) 2 3 4 Полученные результаты демонстрируют стимулирующее действие гормонального препарата преднизолон и селеноорганического соединения ДАФС-25 (соединение 1) на показатели углеводного обмена экспериментальных животных. Активность одного из ключевых ферментов глюконеогенеза глюкозо-6-фосфатазы печени достоверно увеличивалась у мышей обеих экспериментальных групп: на 128,9% (преднизолон) и 60,7% (ДАФС) соответственно по сравнению с контролем (р 0,05). Однако активность данного фермента у мышей, получавших хлор-, фтор- и нитропроизводные препарата ДАФС-25 (соединения 2, 3 и 4), снижалась на 50%, 41,9% и 49,1% соответственно по сравнению с контролем.
Активность другого фермента глюконеогенеза – фруктозо-1,6 бисфосфатазы – достоверно увеличивалась у мышей, получавших per os ДАФС-25 (на 46,7%), а действие преднизолона приводило к увеличению активности фермента на 130%. Применение нитропроизводного препарата ДАФС (соединение 4) сопровождалось снижением активности этого фермента на 40%.
Субстраты глюконеогенеза - пируват и оксалоацетат - образуются в процессе обратимых реакций, катализируемых аминотрансферазами, из аланина и аспартата соответственно.
Активность АлАТ в плазме крови также увеличивалась на 151,5% (преднизолон), 140,5% (ДАФС-25) и 31,8% (ДАФС(NO2)2) соответственно (р 0,05). Однако введение per os галогенопроизводных препарата ДАФС-25 (соединений 2 и 3) сопровождалось падением активности АлАТ на 24,8% и 21,9% соответственно.
Следует отметить, что активность другой аминотрансферазы АсАТ оставалась неизменной почти у всех экспериментальных животных (только у мышей, получавших per os препарат 2, активность АсАТ снижалась на 22,9%). Известно, что любые состояния, требующие срочной мобилизации компонентов белка для покрытия энергетических нужд организма (недостаточное или несбалансированное питание, все виды стресса и т.п.), связаны с адаптивным, гормонально-стимулируемым биосинтезом аланин- и аспартатаминотрансфераз, участвующих в глюконеогенезе (Браунштейн, 1983). Активность АлАТ в клетках печени значительно выше активности АсАТ, поэтому в сыворотке крови мышей обеих экспериментальных групп активность АлАТ увеличивалась на фоне неизменной активности АсАТ.
Значительное увеличение активности АлАТ сопровождалось достоверным снижением концентрации пирувата в плазме крови на 47,2% (преднизолон), 38,9% (препарат 1 - ДАФС), 26,9% (препарат 2), 30,6% (препарат 3) и 25,0% (препарат 4) соответственно по сравнению с контролем.
Это явление можно объяснить усилением распада тканевых белков, обратимым трансаминированием пирувата до аланина при участии фермента АлАТ, включением пирувата/аланина в глюкозо-аланиловый цикл, а в дальнейшем и в процесс новообразования глюкозы в печени. Следует также отметить, что концентрация глюкозы в плазме крови увеличивалась только у мышей первой и второй экспериментальных групп на 101,0% (преднизолон) и 40,6% (ДАФС) соответственно по сравнению с контролем. У мышей, получавших per os препарат 4, концентрация глюкозы снижалась на 41,2% (р 0,05).
Гормоноподобное действие препарата ДАФС-25 также подтверждалось увеличением содержания гликогена в печени и крови. Причем содержание гликогена в печени возрастало только у мышей, получавших преднизолон (на 72,2%) и ДАФС-25 (на 47,2%) соответственно. При этом применение селеноорганических препаратов 3 и 4 сопровождалось снижением содержания гликогена в печени на 47,2% (р 0,05). Концентрация гликогена крови возрастала на 53,3% (преднизолон), 32,0% (ДАФС) и 41,0% (препарат 3) соответственно по сравнению с контролем.
Согласно полученным результатам, селеноорганический препарат ДАФС 25 (соединение 1) оказывало стимулирующее действие на отдельные стороны углеводного и белкового обменов экспериментальных животных подобно глюкокортикоидному препарату преднизолону, что выражалось в увеличении активности ферментов глюкозо-6-фосфатазы печени и аланинаминотрансферазы сыворотки крови, в увеличении концентрации глюкозы и снижению содержания пирувата в сыворотке крови, а также в увеличении содержание гликогена в печени и крови. При этом глюкокортикоидный препарат вызывал более выраженное усиление углеводного обмена, чем органическое соединение селена. Согласно квантовохимическим расчетам только молекула препарата ДАФС-25 (1,5 дифенил-3-селенапентандиона-1,5) наиболее близка к молекулам глюкокортикоидов преднизона и преднизолона как по размеру, так и по 235 расстояниям между полярными реакционноспособными группами С=О, С-ОН, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором как посредством электростатических сил, так и за счет водородных связей или ван дер Ваальсовых взаимодействий. Учитывая приведенные выше результаты квантовохимических расчетов, отражающих геометрические и электростатические предпосылки сходного характера биологической активности препарата ДАФС-25 и глюкокортикоидов, можно предположить, что диацетофенонилселенид в оптимизированной конформации способен взаимодействовать с рецепторами глюкокортикоидов и через них оказывать гормоноподобное действие на клетки экспериментальных животных.
Селеноорганические соединения 2, 3 и 4 - производные препарата ДАФС-25 - подобного эффекта не оказывали, вероятно, это связано с наличием боковых групп, которые могут препятствовать взаимодействию этих соединений с глюкокортикоидными рецепторами.
В заключение необходимо подчеркнуть, что наличие в структуре препарата ДАФС-25 атома селена и 1,5-дифенилпентадиона-1,5 вносит решающий вклад в биологическую активность этого соединения и определяет его гормоноподобное действие.
