Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
ІЛ.Свободнорадикальное окисление липидов в норме и при патологии 13
1.1Л.Генерация свободных радикалов и механизм ПОЛ в биологических мембранах 13
1Л,2.Активные формы кислорода 16
1.1-3 .Биологическая роль ПОЛ и значение в развитии мембранной патологии IS
1.1 АМеханизмы инактивации свободных радикалов 20
1.2.Биологическаяроль селена 24
1,2.1.Метаболизм селена 28
1.2ЛЛЛ1ути поступления селена в организм: видовые различия и механизмы 28
1,2Л,2.Транспортные формы селена в крови 29
1.2Л.З.Содержание селена в организме: распределение, метаболические формы 30
1.2Л АВыведение метаболитов селена из организма: общие закономерности процесса, пути выведения, виды конечных метаболитов 32
1.2.2.Химические формы селена 33
1.2.2Л .Простое вещество и неорганические производные 33
1.2.2.2ЛЭрганические производные селена 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
2Л .Селен- и серосодержащие органические препараты, использованные в исследовании 42
2.2.Структура проведенных исследований 42
2.3.Подготовка, препаратов к исследованиям 47
2,4.Под готовка биологического материала 48
2.4Л .Методика кормления экспериментальных животных 48
2А2.Подготовка плазмы крови 49
2 4.3 .Подготовка эритроцитов 49
2.4.4 .Подготовка гомогенатов органов , 49
2.5.0зонирование биологического материала v 49
2.6.Методы изучения свободнорадикального окисления липидов 50
2.6Л .Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровоЙ кислоты 50
2.6.2.Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот , 51
2.7.Методы исследования биохимических показателей сыворотки крови.- 53
2.7Л .Определение активности -у-глутамилтрансферазы 53
2,7.2.0пределение активности щелочной фосфатазы 54
2.7.3.Определение активности аланинаминотрансферазы 54
2.7АОпределение активности аспартатаминотрансферазы 55
2.7.5.Определение активности лактатдегидрогеназы 56
2,7,6.0пределение активности креатинкиназы.,., 57
2.7.7.0пределение активности а-амилазы 58
2.7.8.0пределение концентрации креатинина 59
2,7.9.0пределение концентрации мочевины , „ 60
2.7Л0.Определение концентрации глюкозы 61
2.7Л L Определение концентрации лактата 62
2,7Л2.0пределение концентрации общего холестерина 63
2.7 Л 3-Определение концентрации общего белка 64
2.7.14.0пределение концентрации альбумина 65
2.8.Методы исследования общей коагуляционной способности крови 66
2,8.1, Определение времени свертывания крови по методу Сухарева , 66
2.8.2.Уинфицированный метод определения времени рекальцификации плазмы 67
2.8.3,Унифицированный метод определения протромбинового времени плазмы 67
2.8.4.0пределение толерантности плазмы к гепарину 68
2.9.Методы исследования общих показателей крови 68
2.9Л.Метод определения скорости оседания эритроцитов ...68
2.9.2,Унифицированный метод определения количества гемоглобина 69
2.9.3.Определение количества эритроцитов 69
2.9.-^Определение количества лейкоцитов 70
2-9.5,Определение количества тромбоцитов 70
2Л0.Статистические параметры, использованные в работе 71
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 72
ЗЛ. Влияние селен- и серосодержащих органических соединений на интенсивность перекисного окисления липидов в крови и гомогенатах органов беспородных мышей 72
3.1 Л.Исследование интенсивности перекисного окисления липидов в тканях интактных мышей 74
ЗЛ.2.Исследование содержания продуктов ПОЛ в тканях, плазме и эритроцитах интактных мышей в условиях оксидативного воздействия 78
ЗЛЛ.Исследование влияния селен- и серосодержащих органических соединений на интенсивность ПОЛ in vitro 82
3 Л-3 Л .Влияние 1,5-дифенил-3-селенапентандиона-1,5 (препарат I) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vitro 82
ЗЛ.3.2.Влияние 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 (препарат II) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vitro 85
ЗЛ.ЗЗЗлияние 1,5-дифенил-3-тиапентандионаЛ,5 (препарат III) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей. in vitro , 88
ЗЛ.ЗАВлияние 1,5'Дифенил-254-диметил-3'Селенапентандиона- 1,5 (препарат IV) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vitro 91
ЗЛ.З.З.Антиоксидантная активность препаратов I и IV in vitro 93
ЗЛ,3.6.Прооксидакпіая активность препаратов II и III in vitro 94
ЗЛ3.7.0рганоспецифичность анти-, прооксидантной активности селено- и серосодержащих препаратов in vitro 97
ЗЛ АИсследование влияния селен- и серосодержащих органических соединений на интенсивность ПОЛ in vivo 98
З і 1АI .Влияние 1,5-дифенил-З-селенапентандиона-1,5 (препарат І) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vivo 98
ЗЛА2.Влияние 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 (препарат II) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vivo 100
З Л A3 .Влияние 1,5-дифенил-3-тиапентандиона-1,5 (препарат III) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей, плазме и эритроцитах интактных мышей in vivo 102
3.1 .4 АВлияние 1,5-дифенил-254-диметш>3-селенапентандиона-1,5 (препарат IV) на интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей» плазме и эритроцитах интактных мышей in vivo 104
3.1.4.5.Антиоксидантная активность препаратов UlUVinvivo 106
ЗЛ,4.6,Прооксидантная активность препаратов И, Ш in vivo 106
3.1.4,7.Орган оспецифичность анти-, прооксидантной активности селен- и серосодержащих препаратов in vivo 109
3-2, Влияние селен- и серосодержащих органических соединений на биохимические, общие показатели крови и гемокоагуляяцию интактных мышей in vivo Ill
3.3» Влияние 1,5-дифенил-3-селеналентандиона-1,5 (препарат I) на биохимические показатели крови и выживаемость белых беспородных мышей при отравлении арсенитом натрия 140
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151
ВЫВОДЫ 159
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 161
Введение к работе
Актуальность, темы.
В возникновении многих патологических процессов значительную роль играет свободно-радикальное окисление липидов биологических мембран. Повышенная генерация активных форм кислорода вызывает повреждение клеток и может способствовать развитию заболеваний: атеросклероза, инфаркта и инсульта» злокачественных процессов и др..(Cutler, 1995; Новиков и др., 1996; Зенков и др., 2001). Воздействию свободных радикалов подвергаются в первую очередь непредельные жирные кислоты и ферментативные комплексы, содержащие в. своей структуре сульфгндрильные группы, например пируватдегидрогеназный комплекс и синтетаза жирных кислот (Jacob et ah, 2003). Многие токсические соединения, включая мышьяк и его производные, также взаимодействуют с тиольными группами, что может значительно усиливать эффект окислительного стресса, вызванного свободными радикалами (Меньшикова и др., 1994),
Сера и селен.находятся в шестой группе периодической системы, что обуславливает аналогичное строение внешних электронных оболочек и определяет подобие химических свойств этих элементов. Снижение потенциала ионизации и электроотрицателъности атома селена по сравнению с атомом серы способствует увеличению восстановительной способности селена при взаимодействии со свободными радикалами (Lee et al, 1996). Известно, что селен метаболизируется - в организме в селенометионин и селеноцистеин, которые могут обнаруживаться не только в составе глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, но и входить в первичную структуру ферментов, катализирующих другие биохимические реакции (Gamble et al, .1997; Tapiero et al., 2004).
В настоящее время клиническое использование антиокислителей на основе селена становится все более широким и эффективным (Dihco et ah, 2003; Скрипченко и др., 2003; Soriano-Garsia М., 2004). Комбинированное применение природных антиоксидантов, таких как токоферол, и препараты селена, успешно зарекомендовало себя в лечении ишемии и инфаркта миокарда (Parker, 1991; Бобырев и. др., 1994; Дюмаев и др., 1995;. Halliwell, 1997;
Schwedhelm, 2003). Неорганические препараты селена - селенит и селенат натрия — применяемые в медицинской и ветеринарной практике, отличаются высокой токсичностью. В связи с этим синтез и изучение биотропных селеноорганических препаратов с низкой токсичностью представляет одну из главных задач медицинской химии,
В лаборатории органического синтеза Саратовского государственного университета им Н.Г\ Чернышевского был создан новый селеноорганический препарат - диацетофенонилселенид (ДАФС), прошедший успешные испытания в практической ветеринарии. Низкая токсичность и положительное влияние на организм животных (снижение заболеваемости, смертности) (Древко и др., 1996) дает основание предполагать востребованность препарата в клинической практике и пищевой промышленности.
11,ель исследования. Целью данной работы является выявление антиоксидантного и антитоксического действия ДАФС и его структурных аналогов, которые представляют новый класс соединений - халькогенсодер-жащие арилалифатические дикетоны.
Задачи исследования:
1) Изучить влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на интенсивность перекисного окисления липидов в тканях белых беспородных мышей in vitro.
2) Изучить влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на интенсивность перекисного окисления липидов в тканях белых беспородных мышей in vivo.
3) Исследовать влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов-на общие, биохимические показатели и общую коагуляционную способность крови белых беспородных мышей in vivo.
Научная новизна работы.
Впервые изучено влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на интенсивность перекисного окисления липидов в условиях оксидативного воздействия in vitro и in vivo.
Впервые исследовано влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на активность ферментов и содержание ключевых метаболитов белкового, липидного, углеводного обменов в сыворотке крови белых мышей.
Впервые проведено исследование, влияния халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на коагуляционную способность и общие показатели крови белых мышей.
Впервые установлено антитоксическое действие ДАФС (1,5-дифенил-З-селенапентандион-1?5) при остром отравлении арсенитом натрия.
Положения, выносимые на защиту:
1) Новый селеноорганический препарат ДАФС и его метилированный аналог- (1,5-дифенил-2,4-диметил-3-селенапентандион 1,5) оказывают антиоксидантное действие в тканях белых беспородных мышей in vitro и in vivo.
2) Электронодонорные заместители (метальные радикалы) усиливают антиоксидантную активность, а электроноакцепторные заместители (атомы фтора) обуславливают прооксидантное действие селенсодер-жащих арилалифатических дикетонов в тканях, белых беспородных мышей in vitro н in vivo.
3) Установлено дозозависимое влияние халькогенсодержащих арилалифатических дикетонов на биохимические показатели сыворотки крови белых мышей in vivo.
4) Селеноорганический препарат ДАФС является высокоэффективным антитоксикантом при остром отравлении арсенитом натрия белых беспородных мышей.
Теоретическая и практическая значимость работы состоит в выявлении антиоксидантного и антитоксического действия нового селеноорганического препарата - ДАФС (1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5). Установленные аспекты биологической активности ДАФС позволяют рекомендовать препарат к проведению клинических испытаний и последующему его применению в медицинской и пищевой промышленности.
Результаты исследований были включены в учебно-методическое пособие «Биохимические основы действия озона на эукариотические и прокариотические клетки», которое используется при проведении практических занятий по курсу «Биологическая химия».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:. 1. Международной конференции по геронтологии - Санкт-Петербург, РФ, 2000 г. 2- Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» - Самара, РФ» 2000 г.
3, Научно-практической конференции «Тринадцатые научные чтения памяти Н.Н. Бурденко» - Пенза, РФ, 2002.
4. Научно-практической конференции «Лабораторные исследования в хирургии, акушерстве и травматологии» - Саратов, РФ, 2002,
5- Научно-практической конференции «Молодые ученые - здравоохранению региона» - Саратов, РФ, 2003 г. 6. Первой научно-практической конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» - Москва, РФ, 2003 г. 7- Десятом российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» Москва, РФ, 2003 г.
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов н списка использованной литературы, включающего 121 отечественный и 149 иностранных источника. Работа иллюстрирована 39 рисунками и 25 таблицами.
