Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор
1.1. Источники органических соединений олова в окружающей среде
1.2. Свойства органических производных олова 18
1.3. Оловоорганические соединения как суперэкотоксиканты для животных и человека
1.3.1. Общие закономерности токсического действия 20
1.3.2. Токсическое влияние органических производных олова на гидробионтов 23
1.4. Механизм токсичности оловоорганических соединений 30
1.5. Вещества, снижающие окислительный стресс 36
1.6. Влияние качества комбикорма на рыб 42
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Метод определения олова в рыбной муке 49
2.3. Метод определения перекисей в рыбной муке 51
2.4. Метод приготовления сухих гранулированных комбикормов 53
2.5. Методы выращивания и кормления молоди осетровых рыб с использованием опытных добавок в комбикорма 54
2.6. Метод определения скорости перекиспого окисления липидов в печени молоди 56
2.7. Исследования крови выращенной рыбы
2.7.1. Методика взятия крови 57
2.7.2. Получение гемолизата крови 57
2.7.3. Получение сыворотки крови 58
2.7.4. Определение активности каталазы эритроцитов крови... 58
2.7.5. Методика определения концентрации иммуноглобулинов 58
2.7.6. Методика определения бактериостатической активности сыворотки крови 59
2.7.7. Методика определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови рыб 59
2.8. Методика проведения электрохимического эксперимента
2.8.1. Очистка растворителей 60
2.8.2. Получение фонового электролита 60
2.8.3. Электрохимические измерения 61
ГЛАВА III. Обсуждение результатов исследований
3.1. Влияние оловоорганических соединений на скорость перекислого окисления липидов в стартовых комбикормах для молоди осетровых рыб 63
3.2. Исследование перекисного окисления липидов рыбной муки в присутствии оловоорганических соединений и антиоксидантов 66
3.2.1. Электрохимическая оценка эффективности антиоксидантов 66
3.2.2. Совместное влияние оловоорганических соединений и антиоксидантов на перекисное окисление липидов рыбной муки 69
3.3. Влияние кормов, содержащих оловоорганические соединения, иарост и развитие молоди осетровых рыб 82
3.4. Влияние оловоорганических соединений на перекисное окисление липидов в печени молоди осетровых рыб in vivo 87
3.5. Совместное действие оловоорганических соединений и антиоксидаптов памолодь осетровых рыб
3.5.1. Совместное влияние триметилоловохлорида и атокоферола на молодь русского осетра 92
3.5.2. Совместное влияние триметилоловохлорида и фосфорилироваппого замещенного фенола (аптиоксиданта комбинированного действия) памолодь бестера 97
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы 106
- Токсическое влияние органических производных олова на гидробионтов
- Методы выращивания и кормления молоди осетровых рыб с использованием опытных добавок в комбикорма
- Совместное влияние оловоорганических соединений и антиоксидантов на перекисное окисление липидов рыбной муки
- Совместное влияние триметилоловохлорида и атокоферола на молодь русского осетра
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из главных проблем Каспийского региона является сохранение популяции осетровых рыб, численность которой в настоящее время снизилась до критического уровня. Так, по данным КаспНИРХа, в 1995 году уловы осетровых в Каспийском море составляли 2,9 тыс. т, в 2004 - только 170 т.
В современных условиях главную роль в решении задачи сохранения и восполнения биологических запасов играют рыбоводные заводы. Успешное выращивание молоди ценных проходных рыб зависит от многих факторов, одним из которых опосредованно является загрязнение воды тяжелыми металлами и особенно металлоорганическими соединениями.
По сравнению с другими тяжелыми металлами олову и его органическим производным до сих пор не уделяется достаточного внимания. Даже воздействие исключительно высокотоксичного трибутилолова п-Bu^SnCl долгое время исследовали в основном на моллюсках, и только в последние годы появились немногочисленные данные о его влиянии на рыб и млекопитающих. Положение осложняется тем, что олово и оловоорганические производные до сих пор не входят в перечень загрязняющих веществ, содержание которых в воде подлежит ежегодному мониторингу. При этом, по данным Астраханского центра по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды, в течение первого полугодия 2006 года наблюдалась устойчивая тенденция увеличения концентрации общего олова в волжской воде.
В водной экосистеме биоаккумуляция и миграция оловоорганических соединений по трофическим цепям приводит к тому, что токсиканты обнаруживаются в морепродуктах и сырье для производства комбикормов, применяемых при искусственном воспроизводстве осетровых рыб. Поскольку при современном уровне загрязнения воды избежать попадания тяжелых металлов в корма невозможно, необходимо найти пути для нейтрализации их негативного воздействия на молодь рыб.
В настоящее время токсичность оловоорганических соединений в первую очередь связывают с влиянием тяжелого металла, вступающего во взаимодействие с SH-группами белков с образованием комплексов. Однако, исследования последних лет (Осипова, Берберова, Пименов, 1999; Осипова, 2000; Кириллова, Пименов, 2001; Давыдова, Милаева, Пименов, 2001; Коляда, 2001) показали, что гораздо более высокая токсичность органических производных тяжелых металлов по сравнению с их неорганическими солями может быть связана с действием активных органических радикалов, образующихся при распаде металл оорганичес кого соединения. Новый подход к пониманию механизма токсичности металлоорганических соединений требует подбора адекватных антидотов.
Цель работы состояла в изучении влияния органических соединений олова на интенсивность перекисного окисления липидов сухого рыбного комбикорма, на биологические и биохимические показатели состояния молоди осетровых рыб при использовании кормов, содержащих оловоорганические соединения, а также в подборе агентов, способных снизить степень токсического действия оловоорганических производных.
В связи с этим в задачи исследования входило:
изучить действие оловоорганических соединений на скорость перекисного окисления липидов сухих гранулированных рыбных комбикормов, используемых при выращивании молоди осетровых;
исследовать влияние антиоксидантов на скорость перекисного окисления липидов сухих комбикормов в присутствии оловоорганических соединений;
изучить действие сухих комбикормов, содержащих оловоорганические соли, на рост молоди осетровых рыб;
установить влияние органических производных олова на скорость
перекисного окисления липидов в печени молоди осетровых рыб in vivo;
изучить скорость роста и интенсивность перекисного окисления липидов в печени молоди осетровых при использовании комбикормов, содержащих оловоорганические соединения и антиоксиданты;
изучить действие новых антиоксидантов комбинированного действия, обладающих одновременно свойствами комплексообразователей и перехватчиков активных радикалов, на скорость окисления липидов рыбной муки в присутствии оловоорганических солей, а также на молодь осетровых рыб при выращивании ее на кормах, содержащих металлоорганические добавки.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование действия оловоорганических соединений с различным числом и природой органических групп на скорость перекисного окисления липидов рыбной муки, входящей в качестве основного компонента в комбикорма для молоди осетровых, а также на биологические и биохимические показатели молоди осетровых рыб в процессе выращивания при использовании комбикормов, содержащих органические производные олова.
Впервые установлено, что под действием органических солей олова усиливается перекисное окисление липидов сухого комбикорма для осетровых рыб; введение оловоорганических производных в комбикорм приводит к угнетению роста молоди осетровых и повышению уровня перекисного окисления липидов в печени рыб, а также способствует уменьшению активности антиоксидантных ферментов (каталаза эритроцитов крови) и снижению иммунитета.
Проведен подбор агентов для детоксикации оловоорганических соединений. Исследовано нейтрализующее действие комплексообразова -телей и антиоксидантов, в том числе новых антиоксидантов
комбинированного действия.
Установлено, что инициированное оловоорганическими производными окисление липидов комбикормов ингибируется антиоксидантами более эффективно, чем комплексообразующими соединениями, которые традиционно используются для детоксикации тяжелых металлов.
Показано, что применение антиоксидантов способствует снижению негативного влияния оловоорганических солей на молодь осетровых рыб. Впервые исследовано действие детоксицирующих агентов комбинированного действия на молодь осетровых рыб.
Практическая значимость работы. Диссертационная работа является экспериментально-теоретическим исследованием, позволяющим выяснить механизм токсического действия металлоорганических соединений для целенаправленного поиска детоксицирующих агентов. Результаты исследования могут быть внесены в систему эколого-токсикологических знаний о влиянии различных загрязняющих веществ на живые организмы.
В ихтиологической рыбоводной практике полученные данные могут быть использованы для разработки рекомендаций по профилактике токсического влияния металлоорганических соединений на молодь осетровых рыб и предупреждению развития алиментарных заболеваний рыб, возникающих при использовании некачественных комбикормов.
Основные положения, выносимые на защиту:
механизм действия оловоорганических соединений на перекисное окисление липидов рыбной муки - основного компонента комбикормов для молоди осетровых рыб;
механизм токсического действия оловоорганических соединений на рост и здоровье молоди осетровых рыб;
метод детоксикации оловоорганических соединений с помощью антиоксидантов;
4. новые антиоксиданты комбинированного действия для детоксикации
оловоорганических соединений.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов; изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц и 23 рисунка. Список литературы включает 165 источников, в том числе 93 иностранных.
Настоящая диссертационная работа проводилась при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (фант № 05-03-96504), программы Отделения Наук о Земле РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата» по теме «Каспийское море как объект мониторинга и моделирования региональных и глобальных биосферных процессов» и программы Отделения Биологических Наук РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» по теме № 00-04-21 «Исследование влияния соединений ртути и олова на рыбоводно-биологические и биохимические показатели молоди русского осетра и повышение резистентности осетровых при промышленном выращивании».
Токсическое влияние органических производных олова на гидробионтов
Обрастания разрушают материал сооружений, замедляют скорость движения судов и протока воды; приводят к значительному увеличению расхода топлива и, соответственно, к повышенному загрязнению атмосферы. Так, слой водорослей толщиной в 1 мм увеличивает трение корпуса на 80 % и снижает скорость судна на 15%. Кроме того, обрастания способствуют инвазии чужеродных видов и биологическому загрязнению водоемов, наряду с балластными водами судов (Evans, Birchenough, Brancato, 2000).
В 70-е годы рядом зарубежных фирм были разработаны самополирующиеся противообрастающие эмали, основанные на акриловом сополимере, в которых в качестве токсина был использован трибутилоловооксид (Champ, Bleil, 1988). Токсин выделялся при гидролизе эфирной связи в щелочной морской воде. Оставшийся кислотный полимер равномерно растворялся в морской воде, постоянно увеличивая гладкость поверхности, что увеличивало срок службы покрытия и обеспечивало экономию топлива до 12%. В середине 80-х более 80% судов мирового флота, включая яхты и рыбачьи лодки, было окрашено оловосодержащими эмалями (Evans, Birchenough, Brancato, 2000; Гаврильчук, Зобачев, Соминская, 2005).
Преимущество применения оловоорганических соединений состоит в том, что они не меняют своих свойств в атмосферных условиях, не реагируют с сероводородом и не меняют активности по отношению к водорослям. Однако, применение оловоорганических соединений в качестве биоцидных компонентов пагубно отразилось на водных организмах. В 80-е годы в воде, иле и тканях гидробионтов были обнаружены высокие концентрации трибутилолова. С применением данного биоцида связывают крах устричного воспроизводства на западе Франции и юго-западе Англии в начале 80-х. Исследования выявили развитие у моллюсков импосекса, приводящего к стерильности и даже гибели. Вскоре подобные случаи описывались по всему миру, указывая на глобальное загрязнение трибутилоловом (Champ, 2000). Франция первой в начале 80-х гг. ввела ограничения на использование оловосодержащих эмалей, за ней в конце 80 начале 90-х последовали Северная Америка, Австралия, Новая Зеландия, Южная Африка, Гонконг и страны Евросоюза (Lenwood, Michael, linger et al., 1992; Гаврильчук, Зобачев, Соминская, 2005). Восемь оловоорганических соединений (среди них соли дибутилолова, трибутилоловооксид, трифенилоловоацетат, трифенилоловохлорид) были включены в список приоритетных токсикантов. Бутильные и фенильные органические производные олова включены в Приложение 1 протокола Барселонской конвенции по защите Средиземного моря от загрязнения из береговых источников (Kubilay, Yemenicioglu, Twigrul et al., 1996). Несмотря на то, что трибутилоловохлорид (n-C4Hg)3SnCl был признан самым токсичным ксенобиотиком, поступающим в природные воды (Stewart, de Mora, Sones et al., 1992), для него была установлена предельно допустимая концентрация, составляющая 10 нг/л для воды рыбохозяйствеиных водоемов (Перечень рыбохоз. нормативов, 1999), и, согласно директиве Международной Морской Организации, рекомендована скорость поступления в воду - не более 4 мг/см3 в день (Smith, Kumar, 1996; Champ, 2000). В течение 1996-1998 гг. вопрос об ограничении или запрещении применения токсичных производных олова в покрытиях неоднократно обсуждался на сессиях Комитета по защите морской среды; результатом стало положительное решение о запрете, вступившее в силу 1 января 2003 г. С 2008 года, в соответствии с Правилом (ЕС) №782/2003 Европейского парламента и Совета ЕС от 14.04.2003 и Международной Конвенцией о контроле за вредными противообрастающими системами на судах, антиобрастающие покрытия судов вместимостью 400 и более тонн, совершающих международные рейсы, не должны содержать оловоорганические соединения. Тем не менее, в настоящее время некоторыми учеными поднимается вопрос о своевременности запрета на оловоорганические соединения в составе антиобрастающих красок, поскольку потенциальная экологическая опасность вновь разработанных покрытий не изучена, и не исключено, что они могут оказаться губительнее для гидробионтов, чем трибутилолово (Evans, Birchenough, Brancato, 2000). До введения глобального запрета на использование оловоорганических токсинов в антиобрастающих эмалях, их поступление в природные воды продолжается. Кроме того, последствия многолетнего применения оловосодержащих покрытий еще долго будут сказываться на экологии водоемов. Оловоорганические соединения находят широкое применение в промышленности и в сельском хозяйстве, однако необходимо учитывать, что их высокая токсичность может привести к нежелательным последствиям и своевременно принять меры по их изучению и предупреждению. Элементарное олово и его неорганические соли слаботоксичны вследствие плохого всасывания (менее 2 %) и быстрого транспорта в тканях (Sherman, 1995). Исключением является SnHt - сильный судорожный яд (Вредные вещества в промышленности. Под ред. Э.Н. Левиной, 1976). Однако, несмотря на малую токсичность самого олова и его неорганических солей, они представляет определенную опасность, т.к. могут стать источником образования высокотоксичных оловоорганических соединений в процессах биохимического метилирования. Биохимическому метилированию могут подвергаться не только неорганическое олово (The Biological Alkylation of Heavy Elements. Ed. PJ.Craig, 1988), но и продукты разложения органических производных: так, в донных отложениях были обнаружены ди- и трибутилметилолово (Maguire, Wong, Rhamey, 1984). Метилирование осуществляется как абиотически, так при участии микроорганизмов. Следует отметить, что все потенциальные метилирующие агенты либо присутствуют в водных экосистемах, либо могут в них образовываться. Донорами метальных групп могут служить гуминовые и фульвокислоты. Химическое метилирование происходит под действием света сопряженно с фотостимулированным растворением сульфидных минералов (Исидоров, 1999). Взаимодействие олова (II) с метилиодидом (выделяется из некоторых водорослей) на свету приводит к образованию моно-, ди-, три и тетрапроизводных.
Методы выращивания и кормления молоди осетровых рыб с использованием опытных добавок в комбикорма
Скорость развития эмбриона не меняется при добавлении триэтил- и трипропилоловохлоридов на ранней стадии развития костистых и осетровых рыб (Данильченко, Строганов, 1973; Данильченко, 1975). Но, если, летальные концентрации этилолова останавливают развитие на одной из стадий эмбриогенеза, в растворах (и-СзН7)з8пС1 оно продолжается до момента гибели зародыша. При помещении личинок осетра в растворы (CjHs SnCl с концентрациями 1,0 и 0,5 мг/л, они не проходят даже первого этапа личиночного периода; жаберные лепестки недоразвиваются, желточный мешок не дифференцируется на отделы кишечника, не развивается спиральный клапан. На вторые сутки личинки теряют подвижность, на третьи - погибают. При концентрации токсиканта ОД мг/л личинки севрюги и осетра погибают на этапе смешанного питания, личинки шипа - при переходе на активное жаберное дыхание. Концентрация (и-СзН7)з8пС1, равная 0,5 мг/л вызывает гибель личинок осетра через 10 ч.
Экспериментально установлено, что для раннего онтогенеза рыб допустимой концентрацией (С2Н5)з8пС1 является 0,01 мг/л, (н-СзН7)38пС1 -0,001 мкг/л (для эмбрионального периода развития), ОД нг/л - для предличиночного. Предполагается, что диэтилолово в концентрации 5 мг/л, полностью предотвращающей дробление, блокирует процесс митоза. При концентрации 0,5 мг/л развитие останавливается на стадии бластулы, что может быть связано с подавлением синтеза РНК.
Гибель взрослых рыб (верховки, пескари, гольцы) наблюдалась при концентрации 1 мг/л для (CsHs SnCl и ОД мг/л для (n Hj SnCl. Рыбы гибли в состоянии выраженной адинамии, реже - возбуждения. Среди характерных симптомов отмечали обильное выделение слизи и нарушение координации движения (переворачивание вверх брюхом, опускание на дно вниз головой, плавание на боку у поверхности воды), уменьшение числа дыхательных движений жаберными крышками до 26 в мин по сравнению с 40 в контроле. Периоды замирания чередовались с гиперактивностью (Wieke, Seinen, Opperhuizen, 1993).
Гибель рыб при остром воздействии определяется не столько общим содержанием соединения в организме, сколько скоростью его проникновения и включения в клеточные структуры. Максимальный уровень содержания оловоорганических соединений в остром и хроническом экспериментах отмечено в желчи рыб - почти в 200 раз больше, чем в других тканях. Возможно, это связано с интенсивной детоксикацией, проявляющейся в экскретировании ядов из печени с желчью с последующим выведением через кишечник. Фракционирование желчи показало, что до 63% оловоорганических соединений связано с желчными кислотами, обладающими комплексообразующими свойствами (Ларина, Озрина, 1989).
Многие оловоорганические соединения при распределении проявляют тканевую и видовую специфичность (Marks, Winer, Hanor, 1969) и в первую очередь накапливаются в тканях с высоким уровнем обменных процессов и повышенным содержанием липидов, таким как печень, почки, кишечник, красная мускулатура. Особое значение имеет концентрирование соединений олова в селезенке рыб, приводящее к нарушению ее кроветворной функции. Известно, что ди- и трибутильные производные олова in vitro ингибируют стимулированную митогенами пролиферацию лимфоцитов селезенки и лейкоцитов головной почки радужной форели (Botton, Hodge, Gonzalez, 1998). Под действием низких доз фунгицида (C6H5)3SnOCOOH3 наблюдается дозозависимое лимфоцитарное истощение селезенки и увеличение эритрофагии, и в некоторых случаях некроз клеток (Schwaiger, Fent, Stecher etal.,1996).
Тканевое распределение трибутилолова исследовали на двух видах камбаловых рыб - Pleuronectes vetulus и Platichthys stallatus. Хлорид трибутилолова вводили внутримышечно в концентрации 0,93 мг/кг массы тела и в течение 3 недель исследовали распределение трибутилолова и продуктов его биотрансформации - дибутилолова и монобутилолова. Максимальные концентрации трибутилолова были отмечены в желчи, затем в печени и почках, и, наконец, в селезенке и мышцах. Концентрация дибутилолова в печени увеличивалась со временем (Krone, Stein, 1999).
Однако, при изучении аккумуляции трибутилолова тканями азиатского паралихта было выявлено, что, после 30 дней экспозиции, максимальная концентрация токсиканта обнаруживалась в сыворотке крови рыб, затем в жабрах, печени и, наконец, в мышцах. У Pleuronkhthys cornutus, выловленной у юго-восточного побережья Корейского п-ва, содержание трибутилолова в крови в 40 раз превышало его концентрацию в печени (Shim Won-Joon, Jeon Joon Kyun, Oh Jae Ryoung et al., 2002).
Оловоорганические соединения обладают липофильными свойствами, но способность к биоаккумуляции зависит не только от них, о чем свидетельствуют более низкие концентрации (C4H9)3SnX и (С6Н5)з8пХ в подкожном жире водоплавающих птиц по сравнению с содержанием в печени и почках (Curtis, КІп1еу,1998).
Исследовано влияние трибутилолова на ранних эмбрионов данио-ренио. При высоких концентрациях - 92-154 нМ - наблюдалась гибель всех эмбрионов через 24-120 часов после оплодотворения. Концентрация равная 31 нМ гибели не вызывала. Интоксикация трибутилоловом вызывала у эмбрионов развитие эдемы (отека) вокруг сердца, глаз и желточного мешка, дегенеративные процессы и атрофию плавников, нарушению морфогенеза (Muramoto Wakana, Shirato Reiko, Kumagai Yoshihiro et al., 2002).
В 2000 году в Каспийском море наблюдалась массовая гибель тюленей (Phoca caspica). В печени и ворвани погибших животных помимо полихлорированных бифенилов и хлорорганических пестицидов были обнаружены и оловоорганические соединения - бутил- и октилолово. Общее содержание бутилолова колебалось от 0,49 до 17 нг/г; при этом концентрация трибутилолова составляла 0,49 - 6,8 нг/г; дибутилолова - 11 нг/г и монобутилолова - 6,0 - 9,3 нг/г.
Совместное влияние оловоорганических соединений и антиоксидантов на перекисное окисление липидов рыбной муки
Длительное хранение полноценных кормов для индустриального рыбоводства невозможно, т.к. происходящие в кормах процессы приводят к снижению их питательной ценности, вплоть до полной непригодности. Из-за высокой ненасыщенности жиры рыбной муки быстро окисляются и прогоркают. В зависимости от вида рыб, используемых для изготовления муки, технологии производства и условий хранения процессы окисления протекают с разной интенсивностью (Остроумова, 2001). При хранении рыбной муки в сыром и теплом помещении окисление идет в 10 раз быстрее, чем при хранении в сухом и холодном месте (Колотилова, Глушанков, 1976).
На процессы окисления в немалой степени способны повлиять токсические примеси. Присутствие в рыбной муке оловоорганических соединений может стать причиной усиления окислительных процессов. Подтверждением тому служат опыты на высших ненасыщенных кислотах -олеиновой кислоте и ее метиловом эфире, входящих в состав липидов (Шпаковский, 2004). Поскольку, производные олова усиливают перекисное окисление олеиновой кислоты, с большой долей вероятности можно ожидать, что они будут промотировать окисление липидов рыбной муки.
Гидролиз и перекисное окисление липидов влекут за собой накопление токсичных продуктов, разрушение полиненасыщенных жирных кислот (Егорова, Трещева, 1971; Шабалина, 1976), витаминов А, С, Е (Лукошкина, 1988; Остроумова, Лукошкина, Козьмина, 1991), снижают содержание и доступность незаменимых аминокислот - лизина, аргинина, метионина (Ермакова, Мосейчук, 1986). Применение окисленных кормов негативно сказывается на скорости роста рыб, вызывает заболевания, а порой и массовую гибель. Особенно чувствительны к качеству жира рыбы ценных видов — лососевые, сиговые, осетровые (Остроумова, 2001),
В рыбхозы нередко поступают корма с изначальным превышением допустимой окисленности липидов. Есть данные, что при проведении комплексного анализа 120 проб рыбной муки, выработанной рыбопромышленными предприятиями и флотами Каспийского, Северного, Дальневосточного бассейнов, пригодными для кормления рыб оказались лишь 11% от всех исследованных партий (Харенко, 1998).
Кормление рыб недоброкачественными окисленными кормами способствует развитию патологических процессов и гибели. При этом, чем моложе рыба, тем быстрее и тяжелее болезненная реакция. Реакция рыб на окисленные корма неодинакова. Дня радужной форели основными симптомами заболевания являются анемия и поражение печени (Остроумова, 1979). Развивается некроз плавников, пучеглазие, потемнение покровов. Отмечается снижение реакции и координации движений. Уровень гемоглобина и числа эритроцитов резко падает. Размеры печени увеличиваются, окраска приобретает светлый песочный оттенок; уровень витаминов С, А, Е резко снижается. На гистологических препаратах печень выглядит ажурной, с многочисленными полостями, демонстрирующими степень жирового перерождения органа, которое часто переходит в цероидную дегенерацию. Образование крупных капель жира в клетках под влиянием токсического действия свободнорадикального окисления липидов свидетельствует об ослаблении биоантиокислительной защиты (Журавлев, 1975). Исчезновение из тканей сильного природного антиоксиданта а-токоферола сопровождается накоплением перекисей ненасыщенных жирных кислот, которые в дальнейшем могут образовывать полимеры с аминогруппами белков - липофусцин (цероид). Нарушение кровообращения в печени приводит к белковой дегенерации. В цитоплазме гепатоцитов появляется много белковых зернышек. С нарастанием дистрофии ядра клеток разрушаются, начинается некроз ткани. Разрушенные клетки образуют мелкозернистую массу; белковые зерна сливаются, образуя крупные глыбки. Регенерационная способность ткани печени нарушается, что неизбежно приводит к гибели рыб (Остроумова, 2001).
При продолжительной интоксикации у карпа отмечается дряблость мышц, симптом «острой спины» (Хасимото, Аоэ, Икэда и др., 1975), изменение паренхимы печени; заболевание объясняют снижением содержания витамина Е. У канального сома развивается анемия и в печени появляются очаги некроза. Кормление окисленными кормами тихоокеанских лососей приводит к гибели рыб, вызванной нарушениями функции печени, кожного и жаберного дыхания, кроветворения. У атлантического лосося хроническое отравление выражается в деформации жаберных крышек, многочисленных внешних и внутренних кровоизлияниях.
Для торможения процессов окисления липидов применяют синтетические и природные антиокислители, которые обычно добавляют в корма в количестве до 0,02% (200мг/кг жира) (Борисочкина, 1976).
Из естественных традиционно используют токоферол, аскорбиновую кислоту, лецитин. Среди синтетических для стабилизации рыбной муки и кормов чаще всего использовали бутилоксианизол, бутилокситолуол (ионол), сантохин (этоксиквин), дилуидин (Егорова, Трещева, 1971; Борисочкина, 1976), кормолан (Сергеева, Лемперт, Клименко и др., 1996), эхинолан, анфелен (Харенко, Боева, Сопина, 1998). Эффективным является введение антиокислителей на более ранней стадии технологического процесса производства рыбной муки (в рыбное сырье), когда свободных радикалов в системе еще немного (Егорова, Трещева 1971). Однако, синтетические антиокислители представляют собой чуждые для организма соединения и в зависимости от природы и дозировки могут оказаться токсичными (Плацер, Веселова, Схахобова, 1964), в связи с чем их действие должно быть тщательно исследовано. Кроме того, известно, что при длительной терапии, либо при введении в организм больших доз антиокислителей извне, концентрация собственных антиокислителей в тканях снижается. Это вызвано конкурентными отношениями между биоантиокислителями с целью поддержания суммарной антиокислительной активности каждой ткани. Поэтому основной целью введения антиокислителей должно быть усиление системы естественной защиты (Журавлев, 1975).
Использование ингибиторов радикальных процессов, таких как токоферол, фенольный порфирин, 2,6-ди-трет-бутилфенол для подавления окисления олеиновой кислоты, вызванного оловоорганическими соединениями, дало положительные результаты (Шпаковский, 2004). Следовательно, их применение в дальнейших опытах вполне обосновано.
Проведенный анализ современных литературных данных доказывает своевременность проведения исследований по изучению влияния оловоорганических соединений на осетровых рыб с целью разработки методов по повышению эффективности искусственного воспроизводства молоди ценных видов проходных рыб и в дальнейшем сохранения их генофонда.
Совместное влияние триметилоловохлорида и атокоферола на молодь русского осетра
Максимальная окислительная активность среди изученных соединений отмечена для ВіізЗпСІ: добавление данного токсиканта в корм в концентрации 0,10 ммоль/кг, т.е. в 7,5 раз меньше рабочей дозы, привело к увеличению показателей ПОЛ в 2,0 - 2,3 раза.
Определение действия Bi SnCl в концентрации 0,75 ммоль/кг было осложнено тем, что молодь отказывалась от корма, и поступление токсиканта в организм оказалось ограниченным. Возможно также, что истощение организма в результате голодания способствовало торможению внутренних процессов, в том числе ПОЛ.
Есть данные (Kook, Wong, Kumar, 1991; Veno, Susa, Furukawa, Sugiyama, 1994) о том, что трибутилолово не проявляет гепатотоксичности, а поражение печени при отравлении трибутилоловом обусловлено действием дибутилолова, образующегося при дезалкилировании. Это согласуется с общими представлениями о закономерностях действия оловоорганических соединений, согласно которым основной мишенью три производных оказывается нервная система, а дипроизводных - печень и желчные пути.
В настоящем исследовании установлено, что скорость ферментативного окисления липидов печени молоди при добавлении в корм BU2SnCl2 увеличивается в 2,8 раза, скорость неферментативного - в 2,6 раза, при этом количество МДА возрастает в 2,9 раза. Изменение интенсивности окислительных процессов в печени указывает на значительную опасность данного токсиканта, несмотря на отсутствие внешних признаков интоксикации и существенного снижения скорости роста молоди при добавлении в корм Bi SnCb.
Таким образом, токсическое воздействие трибутилолова Bi SnCl складывается из влияния исходного токсиканта, поражающего нервную систему и влияния метаболита - дибутилолова, обладающего выраженной гепатотоксичностью. Кроме того, известно, что производные бутилолова проявляют иммунодепрессивное действие (Pieters, Bol, Seinen, Penninks, 1994). Развитие обширных патологических процессов в организме в результате комбинированного повреждающего воздействия трибутилолова доказывает исключительно высокую токсичность данного токсиканта.
Существенно возрастала скорость перекисного окисления липидов в печени под действием арильных производных олова. При этом гепатотоксичность трифенилпроизводного оказалась немного выше. Под действием Ph3SnCl показатели ПОЛ выросли в 1,5 - 2,5 раза, в то время как для Ph2SnCl2 изменение составило 1,4 - 2,0 раза.
Таким образом, проведенные исследования подтвердили, что наиболее вероятным механизмом высокой токсичности оловоорганических соединений является промотирование свободно-радикальных окислительных процессов в организме и развитие окислительного стресса. Основным следствием этого становится окислительное повреждение биологических мембран, в том числе мембран нервных клеток, что проявляется в нарушениях нервной деятельности (расстройство координации движений рыб, случаи потери равновесия, отсутствие ответной реакции на раздражитель).
В результате исследования перекисного окисления липидов рыбной муки установлено, что в присутствии антиоксидантов окислительная активность оловоорганических соединений значительно снижается. Поэтому была предпринята попытка использовать антиоксиданты для уменьшения токсического воздействия органических производных олова на молодь осетровых рыб, для чего определяли биологические и биохимические показатели выращивания молоди русского осетра при совместном введении в корм природного антиоксиданта - а-токоферола и триметилоловохлорида.
Поскольку сс-токоферол относится к жирорастворимым витаминам и способен накапливаться в организме, его избыточное введение может привести к гипервитаминозу. Негативным следствием этого может стать проявление витамином Е прооксидантной активности. Кроме того, известно, что при введении в организм больших доз антиокислителей извне концентрация собственных антиоксидантов в тканях снижается (Журавлев, 1975).
Поэтому предварительно нами было исследовано влияние различных концентраций а-токоферола в корме на рост молоди севрюги (табл. 17) и на скорость перекисного окисления липидов в печени рыб (рис. 18).
Исследования показали, что повышенное содержание а-токоферола (более 150 мг/кг) в корме не оказывает благоприятного воздействия на состояние молоди севрюги, о чем свидетельствует возрастание уровня окислительных процессов в печени и снижение темпов роста.
Но, как уже было показано, при использовании кормов, содержащих токсические примеси металлоорганических соединений, обычной концентрации витамина Е (100 мг/кг) оказывается недостаточно для того, чтобы нейтрализовать негативное влияние токсикантов. В последующих опытах было установлено, что дополнительное обогащение корма с добавками МезБпСІ, уже включающего витаминный премикс, а-токоферолом в концентрации 150 мг/кг, способствует уменьшению токсического влияния Me3SnCl: молодь не теряла в весе, сохраняла подвижность, обесцвечивания кожных покровов - характерного симптома воздействия триметилолова - не наблюдалось (табл. 18).
