Введение к работе
Актуальность проблемы. Важность изучения механизма действия нейропротекторов, обладающих антиоксидантными свойствами, определяется тем, что окислительный стресс является одной из основных причин повреждения и гибели нервных клеток мозга при болезнях, связанных с нейродегенеративными и ишемическими поражениями мозга. Эти болезни являются одной из основных причин старческого слабоумия и смерти людей в пожилом возрасте, они широко распространены и являются очень затратными для общества (Leicht et al, 2011; Naylor et al, 2012). Долгое время большие надежды при лечении таких болезней, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инсульт и травмы мозга связывали с применением высоких доз классических антиоксидантов (прежде всего витамина Е), обладающих способностью прерывать свободно-радикальные цепи, непосредственно реагируя со свободными радикалами. Но анализ результатов клинических испытаний витамина Е показал, что у пациентов с различными болезнями и людей в группах риска, получавших витамин Е в высоких дозах, смертность от разных причин была достоверно выше, чем у людей, получавших плацебо (Muller et al., 2005; Bjelakovic et al, 2007).
По современным представлениям важную роль в защитном эффекте соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, таких, как флавоноиды, N-ацетил-Ь-карнозин, карнитин и другие, играет модуляция ими сигнальных систем, которая в большой мере определяет их способность снижать интенсивность окислительного стресса в клетках (Zingg et al., 2007; Kulebyakin et al., 2012). К таким соединениям относятся и ганглиозиды мозга.
Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, содержащие сиаловые кислоты. Ганглиозиды являются характерными компонентами мембран нервных клеток. Основные ганглиозиды мозга (GM1, GDla, GDlb и GTlb) оказывают защитный эффект и предохраняют от гибели нервные клетки мозга при их введении животным, подвергнутым действию ишемии или токсинов (Hadjiconstantinou, Neff, 1998; Saito et al., 2007). В опытах in vivo и in vitro чаще всего используется наиболее стабильный ганглиозид GM1. При широкомасштабных клинических испытаниях ганглиозида GM1 (препарата Sygen), как лекарства при инсультах мозга и повреждении спинного мозга, не удалось выявить достоверного долгосрочного улучшения состояния больных (Geisler et al, 2001; Candelise, Ciccone, 2002; Becker et al, 2003; Wahlgren, Ahmed, 2004). По-видимому, для успешных клинических испытаний ганглиозида GM1, необходимо расшифровать механизм его защитного действия на нервные клетки, который пока далек от понимания.
Основные ганглиозиды мозга обладают способностью снижать интенсивность окислительного стресса в клетках, что было впервые показано в работах нашей лаборатории (Avrova et al., 1998, 2002). Затем антиоксидантный эффект ганглиозида GM1 был подтвержден в работах зарубежных исследователей (Fighera et al, 2003, 2006; Sergent et al, 2005; Gorria et al, 2006; Tanaka et al., 2010). Под антиоксидантной активностью нейропротекторов мы
понимаем их способность снижать аккумуляцию активных форм кислорода (АФК) в нервных клетках и клетках нейрональных линий, предотвращая тем самым развитие в них окислительного стресса. В литературе нам не встретилось исследований зависимости антиоксидантного эффекта GM1 или других основных ганглиозидов мозга от модуляции ими сигнальных путей.
Выяснение механизма действия ганглиозидов может способствовать успешному проведению клинических испытаний этих соединений как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизмов защитного и антиоксидантного действия ганглиозидов GM1 и GDI а в микро- и наномолярных концентрациях на клетки нейрональной линии PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода и бактериального липополисахарида (ЛПС), выявление той роли, которую играет модуляция ганглиозидом GM1 различных протеинкиназ в повышении им жизнеспособности клеток PC 12 и снижении накопления в них АФК в условиях окислительного стресса.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга (GDIa, GTla и GTlb) в микро- и наномолярных концентрациях на жизнеспособность клеток PC 12 при действии на них токсических концентраций перекиси водорода.
-
Изучить влияние ингибиторов тирозинкиназы Trk-рецепторов, киназы киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1/2 (киназы ERK1/2 -МЕК1/2), фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы С (РКС) и протеинкиназы А на защитный и антиоксидантный эффекты ганглиозида GM1 в клетках PC 12, подвергнутых действию перекиси водорода. Методом иммуноблоттинга изучить влияние ганглиозида GM1 на активность тирозинкиназы Trk-рецепторов, ERK1/2 и протеинкиназы В (Akt), которая активируется PI3K, изучить влияние перекиси водорода и преинкубации с ганглиозидом GM1 на активность этих протеинкиназ.
-
Изучить влияние ганглиозида GM1 и ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов на окислительную инактивацию Na , К - АТФазы в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода.
4. Изучить способность ганглиозидов GM1 и GDI а повышать
жизнеспособность клеток PC 12 и снижать в них накопление АФК при действии
на клетки токсических концентраций бактериального ЛПС.
Научная новизна. Впервые изучена роль модуляции активности сигнальных путей ганглиозидом GM1 в реализации его антиоксидантного эффекта. Найдено, что способность GM1 снижать аккумуляцию АФК в клетках нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса зависит от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов, активации ERK1/2 и Akt и от модуляции активности РКС.
Впервые найдено, что ганглиозид GM1 в наномолярных концентрациях, повышает жизнеспособность клеток PC 12 и уменьшает в них аккумуляцию
АФК в условиях окислительного стресса, причем эти эффекты GM1 зависят от активации им тирозинкиназы Trk-рецепторов. Эти данные представляют интерес в связи с тем, что наномолярные концентрации ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга являются их физиологическими концентрациями в межклеточном пространстве мозга.
Впервые найдено, что способность ганглиозида GM1 в микро- и наномолярных концентрациях уменьшать окислительную инактивацию Na ,К -АТФазы, индуцированную перекисью водорода в клетках нейрональной линии, не выражена в присутствии ингибитора тирозинкиназы Trk-рецепторов.
Впервые показано, что ганглиозид GM1 повышает жизнеспособность клеток нейрональной линии при действии на них токсических концентраций бактериального ЛПС и снижает в них аккумуляцию АФК.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Модуляция ганглиозидом GM1 активности одних и тех же
протеинкиназ определяет как его защитный, так и антиоксидантный эффекты
на клетки нейрональной линии PC 12 в условиях окислительного стресса. Эти
эффекты опосредуются тирозинкиназой Trk-рецепторов и протеинкиназами,
которые активируются после этого фермента - ERK1/2, Akt и РКС.
2. Ганглиозиды GM1 и GDI а в наномолярных концентрациях, повышают
жизнеспособность клеток нейрональной линии PC 12, подвергнутых действию
перекиси водорода, причем этот эффект, как и их эффект в более высоких
концентрациях, связан с активацией тирозинкиназы Trk-рецепторов.
3. Ганглиозиды GM1 и GDI а повышают жизнеспособность клеток
нейрональной линии PC 12 при токсическом действии на них бактериального
ЛПС и снижают образование АФК в этих клетках. Выявлены различия в
механизмах защитного действия ганглиозидов против токсического
воздействия перекиси водорода и бактериального ЛПС.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют представления о биологических эффектах основных ганглиозидов мозга. Найдено, что ганглиозиды GM1 и GDI а повышают жизнеспособность клеток нейронального происхождения при действии на них природного прооксиданта - перекиси водорода или бактериального ЛПС, а не только возбуждающих аминокислот (Scaper et al, 1991; Avrova et al, 1998; Bachis et al, 2003) или амилоидного бета-пептида (Sokolova et al, 2007; Kreutz etal.,2011).
В настоящей работе показано, что защитный и антиоксидантный эффект на клетки PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода, характерен для ганглиозида GM1 и других ганглиозидов в различных концентрациях, вплоть до наномолярных, являющихся физиологическими концентрациями ганглиозидов мозга во внеклеточном пространстве этого органа. Эти данные помогают понять, в каких концентрациях в условиях окислительного стресса эндогенные ганглиозиды, высвобождающиеся в межклеточное пространство мозга при разрушении нервных клеток, вызванном токсическими
воздействиями на мозг, могут оказывать защитный эффект на оставшиеся неповрежденными нейроны.
Проведенное исследование уточняет представления о том, какой вклад вносят протеинкиназы, активирующиеся после активации тирозинкиназы Trk-рецепторов, в защитный эффект ганглиозидов на клетки, имеющие нейрональное происхождение. Такого рода исследования были единичными и фрагментарными (Ruy et al, 1999; Choi et al, 2003). Нами найдено, что активация ганглиозидом GM1 ERK1/2 и Akt, а также модуляция активности РКС вносят свой вклад в повышение им жизнеспособности клеток PC 12 в условиях окислительного стресса.
Выяснение механизма действия на клетки, имеющие нейрональное происхождение, антиоксидантов, таких как флавоноиды, N-ацетил-Ь-карнозин, карнитин и другие, эффект которых основан на модуляции сигнальных систем, призвано способствовать более успешному проведению клинических испытаний этих соединений как лекарств при болезнях, связанных с поражением мозга. По-видимому, наиболее эффективным является применение в клинике комплекса природных протекторов, обладающих антиоксидантным действием и взаимодополняющих эффекты друг друга (Prasad et al., 2000; Kedar, 2003; Mancuso et al, 2007). Ганглиозиды, повышающие жизнеспособность клеток и снижающие интенсивность окислительного стресса в них благодаря модуляции активности сигнальных систем, могут стать одним из компонентов такого комплекса.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на конференции с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (Санкт-Петербург, 2008), на VIII Международной научно-практической конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), на научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011), на XIV Международном совещание и VII школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), на XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, 5 из которых статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 1 статья в международном журнале), 6 - тезисы докладов.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского министерства образования и науки (грант 14.740.11.0918), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты -06-04-48603, 10-04-00315, 12-04-31158).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: общей характеристики работы, обзора литературы, глав с изложением материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы,
включающего 316 источников, из них 13 отечественных и 303 иностранных. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 6 таблиц.
