Регуляция экспрессии генов плацентарного трансформирующего фактора роста-Z и Z-рецептора тромбоцитарного фактора роста кальцитриолом в клетках LNCaP рака предстательной железы Назарова Надежда Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

1.1 Актуальность проблемы 6

1.2 Цели и задачи исследования 7

1.3 Основные положения, выносимые на защиту 7

1.4 Научная новизна , 8

1.5 Научное и практическое значение работы 9

2 Обзор литературы 10

2.1 Открытие и структура витамина Д 10

2.2 Метаболизм и транспорт витамина Д 11

2.3 Молекулярные механизмы действия кальцитриола 14

2.3.1 Регуляция экспрессии генов 14

2.3.2 "Быстрое" негеномное действие кальцитриола 20

2.4 Биологические функции витамина Д 20

2.5 Предстательная железа как орган-мишень кальцитриола 23

2.5.1 Эпидемиологические исследования 23

2.5.2 Метаболизм витамина Д и экспрессия гена VDR в предстательной железе 25

2.5.3 Действие кальцитриола на клетки рака предстательной железы 26

2.5.3.1 Подавление пролиферации 26

2.5.3.2 Индукция дифференцировки 27

2.5.3.3 Индукция апоптоза 28

2.5.3.4 Подавление ангиогенеза и инвазии клеток 28

2.5.4 Взаимодействие между сигнальными системами кальцитриола и андрогенов 29

2.6 Сунерсемейство факторов роста TGF-p и рак предстательной железы 32

2.7 Суперсемейство факторов роста PDGF/VEGF и рак предстательной железы 42

2.8 Заключение 46

3 Материалы и методы. 48

3.1 Препараты, приготовление растворов 48

3.2 Методы клеточной биологии 48

3.2.1 Культивирование клеток 48

3.2.2 Обработка клеток гормонами и факторами роста 49

3.2.3 Анализ скорости роста клеток 50

3.2.3.1 Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Kueng, 1989) 50

3.2.3.2 Оценка количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего (Tennant, 1964) 51

3.2.4 Анализ адгезивных свойств клеток (Monboisse, 1991) 51

3.3 Методы анализа нуклеиновых кислот 51

3.3.1 Выделение РНК 51

3.3.2 Электрофорез РНК (Masek, 2005) 52

3.3.3 Скрининг генов на микрочипах кДНК 53

3.3.3.1 Получение меченой кДНК 53

3.3.3.2 Гибридизация кДНК с микрочипами 53

3.3.3.3 Обработка данных 54

3.3.4 Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени54

3.3.5 Анализ стабильности РНК (Leclerc, 2002) 56

3.4 Методы белковой химии 57

3.4.1 Выделение белков из культуры клеток 57

3.4.2 Аналитический электрофорез белков в присутствии SDS (Laemmli, 1970) 57

3.5 Высокоэффективная жидкостная хроматография 58

4 Результаты. 60

4.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP 60

4.2 Индукция экспрессии гена плацентарного трансформирующего фактора роста-р (PTGF-Р) кальцитриолом 64

4.2.1 Кальцитриол индуцирует экспрессию гена PTGF-Р в клетках LNCaP 64

4.2.2 Действие пифитрина-а на содержание мРНК PTGF-р в клетках LNCaP, инкубированных с кальцитриолом 71

4.2.3 Действие PTGF-p на клетки LNCaP. Его регуляция кальцитриолом 72

4.2.3.1 Рекомбинантный PTGF-p подавляет рост клеток LNCaP 72

4.2.3.2 Рекомбинантный PTGF-p не влияет на адгезию клеток LNCaP к белкам базальной мембраны 73

4.2.3.3 Рекомбинантный PTGF-p индуцирует фосфорилирование киназ, регулируемых внеклеточными сигналами (ERK1 и ERK2) 74

4.2.3.4 Антитела к PTGF-p частично восстанавливают рост клеток LNCaP, инкубированных с кальцитриолом 75

4.2.4 Взаимодействие между кальцитриолом и 5а-дигидротестостероном (DHT) в регуляции

экспрессии reHaPTGF-P 77

4.3 Подавление экспрессии гена р-рецептора тромбоцитарного фактора роста

(PDGFRP) под действием кальцитриола 83

4.3.1 Экспрессия генов рецепторов PDGF в клетках эпителия и стромы предстательной железы человека 83

4.3.2 Кальцитриол подавляет экспрессию гена PDGFRp в клетках предстательной железы линий LNCaPHP29SN 88

4.3.3 PDGF-BB усиливает рост клеток LNCaP в присутствии EGF 91

5 Обсуждение результатов 94

5.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках LNCaP 94

5.2 Индукция экспрессии гена PTGF-Р кальцитриолом 94

5.3 Взаимодействие между кальцитриолом и DHT в регуляции экспрессии гена PTGF-p 100

5.4 Подавление экспрессии гена PDGFRp кальцитриолом 101

6 Выводы. 104

7 Благодарности 105

8 Список литературы. 106

• Основные положения, выносимые на защиту
• Молекулярные механизмы действия кальцитриола
• Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Kueng, 1989)
• Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP

Введение к работе

1.1 Актуальность проблемы

Аденокарцинома предстательной железы является одной из самых распространенных форм рака среди мужчин. С каждым годом частота этого заболевания стабильно увеличивается, и, несмотря на то, что в большинстве случаев аденокарцинома развивается медленно, она занимает второе место в мире по смертности от рака среди мужчин (Gurel, 2008). Из-за высокой частоты и длительного скрытого периода развития заболевания, предпочтительной стратегией лечения аденокарциномы предстательной железы является первичная химиотерапия на ранней стадии.

Важным фактором в развитии аденокарциномы предстательной железы является генетическая предрасположенность. Другую значительную долю риска отводят на факторы образа жизни. В 1990 году Шварц и Хулка выдвинули гипотезу о том, что недостаточность витамина Д является фактором риска развития рака предстательной железы. Авторы этой гипотезы предположили, что метаболиты витамина Д поддерживают клетки рака предстательной железы в дифференцированном состоянии, а их недостаточность провоцирует переход от скрытой к выраженной форме заболевания (Schwartz, Hulka, 1990). В поддержку этой гипотезы служат данные о противоопухолевом действии витамина Д на другие гормон-зависимые типы рака (кишечника и молочной железы). Гипотеза о том, что недостаточность витамина Д является фактором риска развития гормон-зависимых типов рака получила подтверждение в многочисленных эпидемиологических и экспериментальных исследованиях. Исследования in vitro показали, что кальцитриол, активный метаболит витамина Д, контролирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и миграцию гормон-зависимых раковых клеток, а также ангиогенез.

В настоящее время активно исследуются механизмы противоопухолевого действия кальцитриола, а также природа повышенной чувствительности гормон-зависимых раковых клеток к его действию. Кальцитриол обладает секо-стероидной структурой и в функциональном отношении подобен классическим стероидным гормонам, действие которых реализуется через связывание с рецептором — транскрипционным фактором и регуляцию экспрессии генов-мишеней. Поэтому необходимым этапом в понимании феномена противоопухолевого действия витамина Д является расшифровка спектра генов-мишеней кальцитриола и выявление среди них генов, задействованных в контроле апоптоза, пролиферации,

дифференцировки и миграции клеток. К настоящему времени скрининг генов, регулируемых кальцитриолом и его аналогами в клетках рака предстательной железы, позволил выявить такие механизмы антипролиферативного действия витамина Д, как регуляция сигнальных путей инсулиноподобного фактора роста (Boyle, 2001) и ряда антиапоптозных белков (Blutt, 2000). Регуляция экспрессии других генов, определяющих скорость роста клеток, кальцитриолом остается неисследованной.

1.2 Цели и задачи исследования

Целью данного исследования было выявление новых генов-мишеней кальцитриола, вовлеченных в регуляцию роста гормон-зависимых клеток рака предстательной железы линии LNCaP. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках LNCaP, на микрочипах кДНК и определить потенциальные гены-мишеии кальцитриола на основании результатов скрининга и данных литературы.

2. Провести анализ экспрессии выбранных генов-мишеней под действием кальцитирола в клетках LNCaP методами ОТ-ПЦР (обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией) в режиме реального времени и иммуноблоттинга.

3. Оценить значение регуляции экспрессии выбранных генов-мишеней для подавления роста клеток LNCaP кальцитриолом.

1.3 Основные положения, выносимые на защиту

4. Кальцитриол индуцирует экспрессию гена плацентарного трансформирующего фактора роста-Р (PTGF-p) в клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP. Кальцитриол не влияет на стабильность мРНК PTGF-p. Индукция транскрипции гена PTGF-p кальцитриолом не зависит от белкового синтеза.

5. Индукция транскрипции гена PTGF-P кальцитриолом не зависит от действия андрогенов.

6. PTGF-p подавляет рост клеток LNCaP и вызывает активацию киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, ERK1 и ERK2.

7. Кальцитриол подавляет экспрессию гена Р - рецептора громбцитарного фактора роста (PDGFRP), индуцированную эпидермальным фактором роста, в клетках LNCaP.

1.4 Научная новизна

Выявлен ряд новых потенциальных генов-мишеней калыдитриола, включающий гены таких ферментов метаболизма как синтаза жирных кислот (FAS), фосфорибозилглицинамид-формилтрансфераза (GART), стеароил-КоА-десатураза (SCD), гистидин-аммиак-лиаза (HAL) и дофахром таутомераза, а также гены, кодирующие компоненты сигнальных путей факторов роста, такие как плацентарный трансформирующий фактор роста-(3, Р-рецептор тромбоцитарного фактора роста, трансформирующий фактор роста-а, эпидермальный фактор роста, фактор некроза опухоли-а.

Впервые выявлена и исследована индукция экспрессии гена плацентарного трансформирующего фактора роста-Р (PTGF-P) кальцитриолом. Охарактеризована зависимость содержания мРНК и белка PTGF-P от времени воздействия и концентрации калыдитриола в клетках LNCaP. Исследовано действие 5а-д и гидротестостерона (DHT) на содержание мРНК PTGF-P в клетках LNCaP в присутствии и в отсутствие кальцитриола. Показано, что индукция транскрипции гена PTGF-P кальцитриолом не изменяется в присутствии DHT, а также не подавляется антиандрогеном Касодекс, что указывает на андроген-независимыЙ! механизм индукции транскрипции этого гена кальцитриолом.

Впервые исследованы два возможных пути передачи сигнала PTGF-P в клетках LNCaP: не обнаружено влияния PTGF-P на фосфорилирование белков SMAD в этих клетках, выявлено быстрое и краткосрочное фосфорилирование киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, ERK1 и ERK2.

Впервые показано подавление экспрессии гена р - рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFRp) кальцитриолом. Подавление экспрессии этого гена выявлено в клетках линии LNCaP, выращенных в присутствии эпидермального фактора роста (EGF), и в клетках стромы предстательной железы линии P29SN. Показано, что клетки предстательной железы линий LNCaP и РС-3, имеющие эпителиальное происхождние, характеризуются очень низким уровнем экспрессии генов рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGFRa и PDGFRP) по сравнению с клетками первичной культуры стромы предстательной железы P29SN и P32S. Уровень экспрессии гена исследованной изоформы тромбоцитарного фактора роста (PDGF-B), напротив, значительно выше в эпителиальных клетках линий РС-3 и LNCaP, чем в клетках первичной культуры стромы. Такой характер экспрессии предполагает преобладание паракринного механизма действия PDGF в предстательной железе.

Впервые выявлено индуцирующее действие эпидермального фактора роста (EGF) на экспрессию гена PDGFRP и на способность тромбоцитарного фактора роста усиливать рост клеток. Продемонстрирована зависимость увеличения количества клеток линий LNCaP и P29SN под действием PDGF-BB от уровня экспрессии рецепторов PDGFRa и PDGFRp в этих клетках и показано, что вызванное EGF повышение уровня экспрессии гена PDGFRP в клетках LNCaP сопровождается повышением восприимчивости этих клеток к действию PDGF-BB.

1.5 Научное и практическое значение работы

Открытие новых механизмов подавления роста клеток LNCaP кальцитриолом - индукции экспрессии гена PTGF-p и подавление экспрессии гена PDGFRp - вносит вклад в понимание природы антипролиферативного действия витамина Д на клетки рака предстательной железы, а также механизмов взаимодействия сигнальных путей витамина Д и факторов роста суперсемейств TGF-P и PDGF/VEGF. Полученные данные могут быть использованы при разработке комплексных средств терапии и профилактики рака предстательной железы, создаваемых на основе аналогов кальцитриола и специфичных ингибиторов действия факторов роста.

Выявление нового механизма взаимодействия PDGF и EGF - индукция экспрессии гена PDGFRP эпидермальным фактором роста - имеет значение для понимания согласованного действия факторов роста в клетках рака предстательной железы.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Открытие и структура витамина Д

Первые сведения о витамине Д появились в работах Мелланби (1919) и МакКоллума (1922), которые объявили об открытии в масле печени трески вещества, способного вылечивать рахит. Вскоре Стинбок и Блэк (1924) показали, что активность "витамина Д" можно индуцировать облучением экспериментальных животных или пищи ультрафиолетовым излучением, а значит, вещество из печени трески, строго говоря, не является витамином. Однако название "витамин Д" сохранилось. Витамин Д представлен группой жирорастворимых веществ, к которым относятся витамины Д2, ДЗ, Д4, Д5 и их производные. Наиболее важны из них витамин ДЗ (холекальциферол), синтезируемый в коже путем фотолиза 7-дегидрохолестерола или поступающий в организм с животной пищей, а также синтезируемый растениями витамин Д2 (эргокальциферол). За вклад в выделение, характеристику и химический синтез витамина Д вручена Нобелевская премия (Windaus, 1938).

Кальциферолы биологически инертны, однако в организме они превращаются" в активные полярные метаболиты. Кальцитриол (1,25-дигидроксивитамин ДЗ, 1,25(ОН)20з) является наиболее активным метаболитом витамина ДЗ, что было продемонстрировано в экспериментах на мышах, неспособных синтезировать кальцитриол из кальцидиола (25-гидроксивитамин ДЗ, 25OHD3) (Boyle, 1972; Wong, 1972). При введении физиологических доз кальцитриола увеличивалось всасывание кальция в поджелудочной железе и повышалось содержание кальция в костной ткани таких экспериментальных животных, чего не происходило при введении кальцидиола.

Кальцитриол (С27Н44О3, Mr 416.64) является полициклическим соединением липидной природы. В основе молекулы кальцитриола лежит стерольная структура, представляющая собой циклопентанпергидрофенантреновое (стерановое) ядро, состоящее из конденсированных между собой трех насыщенных шестичленных (А,В,С) и одного насыщенного пятичленного кольца (D). Однако, благодаря уникальной структурной особенности — наличию незамкнутого секо-В-кольца, которое позволяет вращение вокруг связи С6-С7, и придает А-кольцу способность претерпевать конформационные перестройки типа кресло-кресло - молекула кальцитирола обладает уникальной гибкостью по сравнению с другими стероидами, для которых характерна очень жесткая трехмерная структура. Конформационная

гибкость позволяет кальцитриолу принимать несколько функционально различных конформаций для связывания с транспортными белками и рецепторами (Norman, 1996).

_^л

Подвижная боковая цепь (изогнутыми стрелками обозначены связи С-С, претерпевающие вращение на 360)

Вращение вокруг связи

С6-С7 кольца В

(цис -н- транс изомеризация)

Конформационные перестановки кольца А типа chair-chair

(А конформер <-> В конформер)

Рис. 1. Схема структуры кальцитриола с указанием элементов, обладающих конфирмационной подвижностью (составлена на основании данных представленных Норманом (Norman, 1996)).

2.2 Метаболизм и транспорт витамина Д

Первый этап гидроксилирования витамина Д (в положении 25), с превращением его в кальцидиол, происходит в печени и осуществляется гидроксилазами семейства цитохрома- Р-450. Этот этап гидроксилирования слабо регулируется, поэтому уровень кальцидиола в плазме крови прямо пропорционален потреблению витамина Д (Holick, 1981) и используется как показатель его содержания. При этом кальцидиол - наиболее многочисленный метаболит витамина Д в плазме крови.

Второй» этап гидроксилирования (в положении 1а) происходит в основном в почках (Fraser, Kodicek, 1970). Активность 1а-гидроксилазы почек, в отличие от активности 25-гидроксилазы печени, тонко регулируется, что обусловлено необходимостью поддерживать содержание кальцитриола в плазме крови под строгим контролем во избежание его токсического действия. Основными регуляторами активности почечной 1 а-гидроксилазы являются кальций и фосфат. Кальций понижает активность фермента как прямо, так и через регуляцию уровня паратиреоидного гормона- (Omdahl, 1972). Недостаточность фосфата в пище приводит к повышению уровня экспрессии гена и активности 1 а-гидроксилазы (Tanaka, Deluca, 1973; Shinki, 1997), что, по-видимому, опосредовано регуляцией так

называемых, фосфатурических факторов (вызывающих фосфатурию - выход фосфата с мочой), таких как фактор роста фибробластов 23 (FGF 23) (Shimada, 2004; Gutierrez, 2005), белок, родственный "извитым" белкам-4 (FRP-4) (Berndt, 2003), экстраклеточный фосфогликопротеин матрикса (ЕРМ) (Rowe, 2000). Другим важным регулятором активности 1а-гидроксилазы является продукт экспрессии гена klotho, который значительно подавляет активность фермента (Tsujikawa, 2003). Сам кальцитриол регулирует свою концентрацию в плазме крови по типу обратной связи через подавление экспрессии гена 1 а-гидроксилазы, индуцированной паратиреоидным" гормоном, или через активацию экспрессии гена klotho (Brenza, 1998). Регуляция по типу обратной связи также важна для предотвращения интоксикации кальцитриол ом.

Не так давно стало очевидным, что помимо почек многие другие органы способны гидроксилировать кальцидиол в положении 1а. Клетки предстательной железы, молочной железы, кишечника, легких, паратиреоидной и поджелудочной желез, а также моноциты и кератиноциты содержат 1 а-гидроксилазу кальцидиола (Zehnder, 2001). Кальцитриол, синтезированный вне почек, выполняет, прежде всего, специфичные клеточные функции и не вносит значительного вклада в общий циркуляторный уровень, за исключением некоторых специфических состояний, таких как беременность (Gray, 1979), хроническая почечная недостаточность (Zerwekh, 1983), туберкулез (Cadranel, 1990) и ревматоидный артрит (Shaw, 1994). Регуляция внепочечной 1 а-гидроксилазы существенно отличается от ее регуляции в почках. Скорости локального синтеза и инактивации кальцитриола находятся под тонким контролем целого ряда цитокинов и факторов роста, которые поддерживают концентрации кальцитриола оптимальные для выполнения тканеспецифичных функций. Отдельная регуляция центрального и местного синтеза кальцитриола обеспечивает двойной контроль над концентрацией кальцитриола в тканях-мишенях.

Инактивация кальцитриола начинается с окислительных реакций в положении 24 и 23, приводящих к расщеплению боковой цепи. Фосфат, паратиреоидный гормон и кальцитриол регулируют экспрессию гена 24-гидроксилазы по механизму обратному для регуляции 1 а-гидроксилазы (Tanaka, Deluca, 1973; Henry, Norman, 1984; Armbrecht, Boltz, 1991; Ohyama, 1994; Wu, 1996).

В крови метаболиты витамина Д связаны с белками плазмы, преимущественно с так называемым белком, связывающим витамин Д (DBP). DBP обладает высоким сродством к метаболитам витамина Д в порядке уменьшения сродства: кальцидиол = 24,250H2D3 > кальцитриол > витамин ДЗ (Cooke, Haddad, 1989). Небольшое

количество метаболитов связано с альбуминами и липопротеинами плазмы (Fainaru и Silver, 1979). Связывание метаболитов витамина Д с белками плазмы ограничивает их доступ к клеткам мишеням, что обеспечивает дополнительный уровень защиты от интоксикации витамином Д, и продлевает время жизни метаболитов в циркуляторном русле (Cooke, Haddad, 1989). Очень незначительная фракция несвязанных метаболитов пассивно проникает в клетки мишени (Bikle, Gee, 1989). В клетки почек кальцидиол, связанный с DBP, проникает преимущественно путем мегалин-зависимого эндоцитоза (Nykjaer, 1999). Внутри клетки DBP расщепляется и кальцидиол связывается с так называемыми внутриклеточными белками, связывающими витамин Д (IDBP) (Wu, 2002) или вновь связывается с DBP и возвращается в циркуляторное русло (Dusso, 2005). IDBP являются гомологами шаперонов семейства белков теплового шока 70 (Hsp70) (Gacad и Adams, 1998). Показано, что IDBP-1 и IDBP-3 связываются с мембранным белком-переносчиком мегалином (Adams, 2003) и 1 а-гидроксилазой и облегчают перенос кальцидиола к митохондриям для¹ дальнейшего гидроксилирования. Кроме того, IDBP-1 и IDBP-3 облегчают перенос кальцитриола к ядерному рецептору витамина Д (VDR) (Wu, 2002), связывание с которым запускает цепь цепь событий, приводящих к изменению¹, интенсивности транскрипции генов-мишеней.

Основной формой VDR-содержащего транскрипционного фактора является гетеродимер VDR с рецептором цис-ретиноевой кислоты (RXR). Гиперфосфорилирование VDR индуцирует его гетеродимеризацию с одной из изоформ RXR, а, р или у (Yu, 1991; Kephart, 1996). Считается, что предпочтительность той или иной изоформы определяется структурой хроматина в регуляторной области гена-мишени. Поверхность димеризации VDR с RXR формируют последовательности в составе нескольких различных доменов молекулы VDR. In vitro VDR димеризуется также с рецепторами тиреоидных гормонов (TR) (Schrader, 1994), рецептором транс-ретиноевой кислоты (RAR) (Schrader, 1993) и образует гомодимеры. Показано, что гомодимеры VDR-VDR способны регулировать транскрипцию in vitro (Kahlen, Carlberg, 1994). Однако присутствие и роль подобных гетеро- и гомодимеров в транскрипции in vivo не известны.

В отсутствие лиганда VDR равномерно распределен между цитоплазмой и ядром и постоянно курсирует между ними, поскольку слабое взаимодействие между VDR и импортином-а ядерной поры не обеспечивает эффективную транслокацию VDR в ядро. Свободный RXR, напротив, находится в основном в ядре благодаря высокому сродству RXR к Р-импортину ядерной поры (Yasmin, 2005).

Конформационные изменения, которые претерпевает VDR в результате связывания лиганда и гиперфосфорилирования, приводят к открытию скрытого сигнала ядерной локализации в молекуле VDR, который направляет массовую транслокацию VDR в ядро. Димеры VDR-RXR рекрутируются к ядерной поре через связывание VDR с импортином-а (Yasmin, 2005), поскольку сродство RXR к импортину-Р уменьшается в результате гетеродимеризации. Таким образом, транслокация димеров VDR-RXR в ядро управляется, прежде всего, кальцитриолом.

2.3 Молекулярные механизмы действия кальцитриола 2.3.1 Регуляция экспрессии генов

Ядерный рецептор витамина Д (VDR) принадлежит суперсемейству ядерных рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов (NR). VDR человека - это 48 кДа фосфопротеин, обладающий характерной для белков суперсемейства NR модульной организацией (Vegeto, 1993). В геноме человека VDR кодируется единственным геном в составе 12 хромосомы и, в отличие от других NR, представлен единственной изоформой (Szpirer, 1991). Несмотря на то, что при транскрипции образуется несколько вариантов мРНК VDR, различающихся по последовательности 5'-конца, все они транслируются в один и тот же белок, состоящий из 427 аминокислотных остатков (Miyamoto, 1997).

Ядерная локализация

Связывание сДНК

Гетеро димеризация Трансакти вация

Связывание лиганда

S^l-P S18>PS208-P

A/BCD

E/F

Рис.2. Схема доменной организации VDR человека в сопоставлении с доменной организацией NR человека. Указаны участки, ответственные за выполнение различных функций рецептора и сайты фосфорилирования остатков серина, задействованные в трансактиваци и.

В'молекуле VDR выделяют несколько функциональных доменов. Домен А/В большинства ядерных рецепторов несет мотив,- выполняющий функцию автономной активации транскрипции, так называемую Функцию активации-1 (AF-1). А/В-домен VDR (1-20 а.к.) укорочен по сравнению с другими NR и, по-видимому, не функционален, т.к. удаление этого домена не отражается на функционировании VDR (Pike, Shevde, 2005). Домен С или ДНК-связывающий домен (DBD) NR представлен высококонсервативной'последовательностью «и содержит два цинковых пальца типа С2-С2 (Berg, 1989): DBD VDR связывается с так называемыми витамин Д-чувствительными«последовательностями (VDRE) в большой бороздке ДНК. Также он участвует в димеризации; рецептора и блокирует связывание с неправильно расположенными полусайтами VDRE (Umesonon Evans, 1989). Предполагается,, что С-домен VDR (21 - 92 а.к.) важен также для накопления-VDR в ядре (Luo, 1994). Вариабельный- домен D представляет собой очень гибкий линкерный- участок, состоящий из протяженной спирали, которая связывает ДНК-связывающий и лиганд-связывающий участки, и обеспечивает пластичность структуры рецептора (McDonnell, 1989; Shaffer,. 2005). Домен E/F умеренно вариабелен по последовательности, но высококонсервативен по третичной структуре. Он содержит* лиганд-связывающий домен (LBD), состоящий из 12 а-спиралей и Р-поворота, собранных в антипараллельный* сэндвич (McDonnell, 1989). На С-конце домена-находится участок под названием Функция- трансактивации-2 (AF-2), представленный короткой амфипатической а-спиралью. Этот участок молекулы рецептора служит платформой для многочисленных кофакторов, необходимых для проявления активности рецептора (MacDonald, 1995; Jin и Pike, 1996), а также участвует в димеризации с рецептором цис-ретиноевой кислоты (RXR). Уникальной> особенностью молекулы VDR, по сравнению с другими NR; является обширная вставка между доменами.D и E/F, которая кодируется-отдельным экзоном. Роль этого участка в функционировании.VDR не ясна и его относят иногда к D-домену (Pike, Shevde, 2005), а иногда к E/F-домену (Shaffer, 2005). Описано множество аллельных вариантов гена VDR человека, значительно различающихся среди рас и этнических групп (Morrison, 1994; Koshiyama, 1995; Nelson, 2000; Ojwang, 2001; Uitterlinden, 2004a). Выявлена взаимосвязь аллельных вариантов гена VDR с такими фенотипическими проявлениями как пониженная плотность костей (Eisman, 1999), гиперпаратироидизм (Carling, 1995), устойчивость к действию витамина Д (Kontula, 1997), а также восприимчивость к инфекциям; аутоиммунным заболеваниям и раку (Uitterlinden, 20046). Также был охарактеризован ряд функциональных

полиморфизмов VDR, влияющих на стабильность его мРНК и эффективность трансактивации (Morrison, 1994).

Кальцитриол связывается с VDR с высоким сродством (Kd=10"¹⁰ - 10"^ИМ) (Mellon, Deluca, 1979). Критическое значение для связывания с VDR имеют ОН-группы в молекуле кальцитриола (Okano, 1998), поэтому кальцидиол и 24,250H2D3 связываются с VDR гораздо слабее, чем кальцитриол (Mellon, Deluca, 1979). На основании данных кристаллографических исследований (Rochel, 2000) было показано, что в зависимости от связывания лиганда лигапд-связывающий домен VDR может принимать три различные конформации: apoVDR, holoVDR с агонистом, holoVDR с антагонистом (Moras и Gronemeyer, 1998; Nayeri и Carlberg, 1997). При этом основные коиформационные перестройки связаны с положением спирали AF-2 (Norman, 1999; Vaisanen, 2002). При связывании лиганда спираль AF-2 закрывает LBD и запирает агонист в лиганд-связывающем кармане (Swamy, 2000). Эта перестройка сопровождается изменением положения спиралей 3, 6, 11 и 12, приводящим к освобождению корепрессоров и рекрутированию коактиваторов (Herdick и Carlberg, 2000; Murayama, 2004; Hashimoto и Miyachi, 2005). Этап активации необходим также для рекрутирования моторных белков, обеспечивающих, быструю транслокацию VDR из цитоплазмы в ядро вдоль микротрубочек (Barsony, МсКоу, 1992; Racz и Barsony, 1999). При связывании, антагониста AF-2 занимает неправильное положение, препятствующее связыванию коактиваторов, тем самым, блокируя функцию рецептора.

Связывание с лигандом индуцирует гиперфосфорилирование VDR по нескольким остаткам серина (рис. 2). Фосфорилирование в положении S208 осуществляет казеин киназа II (Jurutka, 1993), S51 - протеинкиназа С и S182 -протеинкиназа A (Hsieh, 1991). Фосфорилирование VDR по различным сайтам по-разному отражается на транскрипционной активности VDR и обеспечивает ее тонкую регуляцию. Поскольку активность протеинкиназ находится под контролем различных гормонов, цитокинов и факторов роста, включая сам кальцитриол, регуляция VDR через фосфорилирование служит точкой пересечения многочисленных сигнальных путей (обсуждается также в главе 2.3.2).

Димер VDR-RXR распознает последовательности ДНК под названием витамин Д-чувствительные последовательности (VDRE) в регуляторных областях генов. Усредненный VDRE представляет собой прямой повтор двух гексамерных последовательностей A/GGG/TTCA, разделенных спейсером в 3 нуклеотида (DR3) (Noda, 1990). При взаимодействии с этой последовательностью гетеродимер VDR-

RXR ориентируется таким образом, что RXR занимает 5'-полусайт, a VDR — З'полусайт (Jin и Pike, 1996). VDRE различаются по длине спейсера и направлению повторов. Помимо DR3 встречаются DR4 (прямой повтор, разделенный спенсером в 4 нуклеотида), DR6 (прямой повтор, разделенный спейсером в 6 нуклеотидов), ER6 (обращенный повтор, разделенный спейсером в 6 нуклеотидов) и некоторые другие. Как правило, в регуляторных областях генов-мишеней витамина Д присутствует несколько VDRE. Так, например, в регуляторных областях гена, кодирующего 24-гидроксилазу кальцитриола (CYP24), и гена циклина С выявлено по четыре VDRE (Vaisanen, 2005; Sinkkonen, 2005). В регуляторных областях генов, кодирующих белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста (IGFBP1, IGFBP3 и IGFBP5) выявлено по три VDRE (Matilainen, 2005) и не менее трех VDRE - в регуляторной области гена, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ р21 (Saramaki, 2006). По крайней мере, два VDRE присутствуют в регуляторной области гена, кодирующего эпителиальный кальциевый канал, ответственный за всасывание кальция в кишечнике (TRPV6) (Meyer, 2006). Показано, что каждый VDRE способен обеспечивать трансактивацию сам по себе, поэтому считается, что наличие множественных VDRE служит для увеличения эффективности и точности трансактивации. Степень индукции транскрипции кальцитриолом часто не превышает трех раз, поскольку большинство, генов-мишеней кальцитриола транскрибируется под контролем нескольких транскрипционных факторов. Среди редких исключений ген CYP24, уровень транскрипции которого под действием кальцитриола может увеличиваться в тысячи раз (Lou, 2005; Sinkkonen, 2005). Высочайшую эффективность трансактивации этого гена кальцитриолом связывают с двумя причинами. Во-первых, гетеродимер VDR-RXR является основным, регулятором транскрипции гена CYP24, кодирующего 24-гидроксилазу, которая катализирует ключевую стадию инактивации кальцитриола. Во-вторых, базальный уровень транскрипции этого гена очень низок по сравнению с другими генами-мишенями витамина Д (Dunlop, 2005), где уровень транскрипции поддерживается другими транскрипционными факторами.

Явление трансрепрессии кальцитриолом, так же как и другими стероидными гормонами, менее изучено, чем явление трансактивации. Структура репрессирующего VDRE (nVDRE) не ясна. По одной из моделей репрессия транскрипции происходит при связывании димера VDR-RXR с классическим активирующим VDRE, которое сопровождается рекрутированием специфичного комплекса корепрессоров. В поддержку этой гипотезы служит идентификация

нескольких nVDRE, обладающих структурой, подобной классическим VDRE (Koszewski, 1999). По альтернативной модели, в поддержку которой служит факт обнаружения nVDRE, не содержащих классической A/GGG/TTCA последовательности, nVDRE характеризуются специфической структурой. Например, nVDRE, обнаруженный в регуляторной< области гена 1а-гидроксилазы, и получивший название lanVDRE состоит из двух участков ДНК, подобных последовательности Е-box (Мигауата, 2004). Однако, в этом случае, VDR непосредственно не связывается с Ian VDRE, а взаимодействие обеспечивает так называемый репрессор, взаимодействующий с VDR (VDIR). В отсутствие кальцитриола VDIR, активированный протеинкиназой А, рекрутирует коактиваторы семейства рЗОО, относящиеся к ацетилтрансферазам гистонов (HAT). Связывание кальцитриола вызывает освобождение коактиваторов и рекрутирование корепрессоров - деацетилаз гистонов (HDAC) и Sin3A, что приводит к трансрепрессии. Таким образом, обе модели постулируют, что в основании трансрепрессии лежит феномен переключения корегуляторов. Интересно, что точечные мутации в nVDRE способны сделать его активирующим. Так, изменение двух оснований в 5'-половине элемента DR3 в регуляторною области гена, паратиреоидного гормона индуцирует переключение от трансрепрессии к трансактивации VDR (Koszewski, 1999). Поэтому было выдвинуто предположение о том, что основанием для трансрепрессии может служить изменение полярности VDR/RXR-VDRE комплекса, в котором VDR занимает 5'-полусайт.

Комплексы, ремоделирующие хроматин, дают возможность ядерным рецепторам связываться с гормон-чувствительными последовательностями в регуляторных областях генов-мишеней. Эти многосубьединичные комплексы используют энергию гидролиза АТФ для локального разрушения лучей нуклеосом (Johnson, 2005). Ремодулирующий хроматин комплекс, участвующий в трансрегуляции VDR, был идентифицирован в 2003 году (Kitagawa, 2003) и получил название WINAC (комплекс сборки нуклеосом, содержащий Williams Syndrome Transcription Factor (WSTF)). WINAC принадлежит к классу SWI/SNF н содержит субьединицы BRG1 или hBRM в качестве АТФаз. WINAC рекрутируется как к активирующим так и к репрессирующим VDRE, независимо от связывания лиганда (Kato, 2004). Поэтому предполагается, что особенности индивидуальных последовательностей VDRE служат аллостерическими модуляторами конформации VDR, направляющими рекрутирование коактиваторов или корепрессоров, которые, в свою очередь, направляют действие WINAC. Два участка в составе E/F домена VDR

обеспечивают адапторные поверхности для связывания корегуляторов (Carlberg, 2004). Коактиваторы действуют синергично с VDR, усиливая эффективность активации. Многие коактиваторы VDR, такие как, например, белки семейства SRC и СВР/рЗОО, обладают активностью ацетилтрансферазы гистонов (HAT) (Kim, 2005). Эти коактиваторы дестабилизируют нуклеосомы в регуляторной области генов-мишеней путем ацетилирования остатков лизина N-хвостов гистонов. Дестабилизация нуклеосом облегчает связывание следующего комплекса коактиваторов, так называемого комплекса белков, взаимодействующих с VDR (DRIP), в состав которого входит около 20 белков. DRIP был открыт как комплекс белков, обеспечивающих лиганд-зависимую трансактивацию VDR-RXR in vitro (Rachez, 1998), и оказался подобным или идентичным известным комплексам SMCC/TRAP/ARC/CRSP/NAT/Mediator, участвующим в действии других NR. За связывание с AF-2 мотивом VDR отвечает DRIP205 субъединица комплекса (Rachez, 2000), которая служит "мостиком" между VDR и базальной транскрипционной машиной РНК-полимеразы II и, таким образом, облегчает сборку преинициационного комплекса (Rachez и Freedman, 2000; Jurutka, 2001).

При связывании гетеродимера VDR-RXR с репрессирующими VDRE
происходит рекрутирование корепрессоров семейства гистоновых деацетилаз
(FIDAC), таких как NCoR-l/RIP13, NCoR-2/SMRT/TRAC2 и

Hairless/TRIP8/KIAA1380, которые деацетилируют остатки лизина N-хвостов гистонов, что вызывает локальную конденсацию хроматина и "молчание" генов (Polly, 2000; Banwell, 2003). Интересно бифункциональное действие комодулятора NCoA62/Skip, который способствует как VDR-зависимой трансактивации так и VDR-зависимой трансреспессии, в зависимости от типа клеток (Leong, 2004). Действие Skip (SKI-interacting protein) направляется характером экспрессии других корегуляторов в клетке. Так, коактиваторы СВР/р300 и корепрессоры NCoR и SMRT взаимодействуют с одним и тем же N-концевым участком молекулы Skip, и относительный уровень экспрессии этих кофакторов определяет, будет Skip активировать или репрессировать VDR-зависимую транскрипцию.

Предполагается, что баланс коактиваторов и корепрессоров обеспечивает эпигенетический контроль над транскрипцией генов-мишеней кальцитриола. Показано, что сверхэкспрессия генов корепрессоров блокирует VDR-зависимую транскрипцию и вызывает нечувствительность к антипролиферативному действию кальцитриола (Ting, 2007). Напротив, инкубация клеток рака предстательной железы линий РС-3, LNCaP или DU145 с комбинацией кальцитриола и ингибиторов HDAC

(трихостатином А или бутиратом Na) значительно усиливает антипролиферативное действие кальцитриола (Gommersall, 2004; Ting, 2007). Интересно, что кальцитриол индуцирует экспрессию генов двух своих корегуляторов, коактиватора TIF2 и корепрессора SMRT, что свидетельствует о его собственной способности модулировать транскрипционную компетентность клеток-мишеней (Dunlop, 2004).

2.3.2 "Быстрое" негеномное действие кальцитриола

Метаболиты витамина Д, подобно другим стероидным гормонам, помимо регуляции транскрипции генов, вызывают "быстрые" клеточные ответы. Эти изменения проявляются в течение нескольких минут после начала воздействия гормона и не связаны с регуляцией транскрипции. Так, после нескольких минут контакта с клеткой кальцитриол стимулирует метаболизм фосфоинозитидов (Bourdeau, 1990; Lieberherr, 1989), увеличивает уровень кальция в цитозоле (Lieberherr, 1987; Hruska, 1988), уровень cGMP (Guillemant и Guillemant, 1980; Vesely и Juan, 1984), усиливает активность протеинкиназы С (Sylvia, 1996) и МАР киназ (Вепо, 1995; Song 1998), вызывает открытие хлоридных каналов (Zanello и Norman, 1996). Предполагается, что "быстрое" действие передается через связывание кальцитриола с мембранным рецептором витамина Д, природа которого, однако, не ясна. К настоящему времени идентифицированы два белка, которые могут претендовать на эту роль. Это так называемый белок быстрого ответа, связывающий стероиды (1,25D3-MARRS), выделенный из базолатеральной мембраны клеток кишечника курицы (Nemere, 1994; Nemere, 1998), и аннексии II из плазматической мембраны клеток остеосаркомы крысы линии ROS 24/1 (Вагап, 2000). Значение негеномного действия кальцитриола также остается неясным. Было выдвинуто предположение о том, что негеномные ответы, по крайней мере, активация протеинкиназ, служат для дополнительной регуляции геномного действия кальцитриола. Однако до сих пор влияние "быстрого" действия кальцитриола на VDR-зависимую транскрипцию обнаружить не удается.

2.4 Биологические функции витамина Д

Витамин Д был открыт как вещество, способное вылечивать рахит, и, соответственно, первым было изучено действие кальцитриола, направленное на регуляцию уровня кальция во внеклеточной жидкости, обеспечивающего поддержание жизнедеятельности клеток и целостность скелета. Эндокринная система кальцитриола представляет собой неотъемлемый компонент взаимодействия между

почками, скелетом, паращитовидной железой и кишечником по поддержанию гомеостаза кальция и фосфора в организме. Основное и непосредственное действие кальцитриол оказывает на всасывание кальция и механизмы транспорта кальция и фосфата в кишечнике. Кальцитриол стимулирует активное всасывание кальция и транспорт путем индукции экспрессии генов эпителиальных кальциевых каналов TRPV6 (transient receptor potential vanilloid type 6) и TRPV5 (van Abel, 2003). Кроме того, кальцитриол увеличивает активный транспорт фосфата путем индукции экспрессии гена Na-Pi котранспортера (Tatsumi, 1998) и изменения состава плазматических мембран эндоцитов (Putkey, 1982).

В свете данных, полученных на лишенных VDR мышах (VDR-knockout mice), ведущее значение кальцитриола в регуляции роста, созревания и ремоделирования кости, еще недавно считавшееся очевидным, было поставлено под сомнение. Было показано, что содержание VDR нокаутных мышей на диете с высоким содержанием кальция, фосфора и лактозы предотвращает нарушение минерального обмена в костной ткани (Li, 1998). На основании этих данных было выдвинуто предположение о том, что вклад кальцитриола в поддержание целостности скелета отражает не прямое действие кальцитриола в костной ткани, а его действие на обмен кальция и фосфора в кишечнике. Однако, по результатам других исследований, нормализация уровня кальция в плазме крови только частично восполняет дефект сигнальной системы кальцитриол-VDR в поддержании гомеостаза костной ткани VDR нокаутных мышей (Panda, 2004). Показано, что кальцитриол непосредственно участвует, по крайней мере, в процессах развития хрящевых ростовых пластинок и резорбции кости остеокластами, а также необходим для нормального согласования процессов ремоделирования кости (остеогенеза и остеокластогенеза) (Panda, 2004).

Кальцитриол контролирует функционирование паращитовидной железы. Недостаточность витамина Д приводит к гиперплазии (избыточному росту клеток) паращитовидной железы и повышенному синтезу и секреции паратирсоидного гормона (РТН). Кальцитриол репрессирует транскрипцию гена РТН (Silver, 1985; Okazaki, 1988). Кроме того, кальцитриол регулирует ответ паращитовидной железы на кальций путем трансактивации гена так называемого кальций-чувствительного рецептора (CASR) (Brown, 1996). Ингибирование сигнального пути трансформирующего фактора роста-а (TGF-а), а также индукция экспрессии генов ингибиторов циклин-зависимьгх киназ р21 и р27 кальцитриолом отражается в замедлении пролиферации и роста клеток паращитовидной железы (Cozzolino, 2001; Tokumoto, 2002). Предполагается, что действие кальцитриола на паращитовидную

железу также может являться вторичным по отношению к его действию на кальциевый обмен в кишечнике, поскольку богатая кальцием диета устраняет повышение уровня РТН в плазме VDR нокаутных мышей (Panda, 2004).

Наконец, кальцитриол стимулирует резорбцию кальция и фосфата, а также экспрессию гена кальбиндина в почках (Friedman и Gesek, 1993). Значение действия кальцитриола в почках также является спорным, поскольку вызванное кальцшриолом повышение уровня РТН в крови, а также усиление всасывания кальция и фосфата в кишечнике сами по себе повышают нагрузку почек этими ионами, а эффект кальцитриола может быть вторичным.

"Неклассическое" действие. Открытие ядерного рецептора витамина Д, VDR, который был идентифицирован практически во всех тканях организма человека, включая ткань поджелудочной железы (Pike, 1980), плаценты (Pike, 1980), вилочковой железы (Haussler, 1980), яичников (Dokoh, 1983), семенников (Мегке, 1983), молочной железы (Colston, 1980), сердца (Walters, 1986), предстательной железы (Miller, 1992), желудка (Stumpf, 1979), кожи (Stumpf, 1979) и др., в том числе даже в некоторых нейронах головного мозга (Stumpf, 1982), привело к выявлению ряда новых функций кальцитриола. Результаты эпидемиологических и генетических исследований также указывают на взаимосвязь дефектов эндокринной системы витамина Д и некоторых симптомов, не связанных напрямую с гомеостазом кальция, таких как повышенное давление крови (Li, 2002; Li, 2003), нарушенная функция мышц (Boland, 1986; Endo, 2003), повышенная восприимчивость к инфекциям (Hayes, 2003), аутоиммунным заболеваниям (Hayes, 2003) и раку (Garland, 2006). Оказалось, что клетки различного происхождения, включая потомки фибробластов, хондроцитов, остеобластов, миобластов, гематопоэтические и лимфопоэтические клетки и другие типы клеток, в культуре восприимчивы к действию кальцитриола. Показано, что кальцитриол подавляет рост, стимулирует дифференцировку и вызывает апоптоз VDR-содержащих раковых клеток, включая клетки рака предстательной железы, молочной железы, кишечника, легких и меланомы. При этом механизм действия кальцитриола зависит от типа клеток. "Неклассическое" действие кальцитриола указывает на возможную роль витамина Д в предупреждении рака, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также на потенциальную возможность использования кальцитриола и его аналогов в их лечении. Антипролиферативное действие кальцитриола и его аналогов в настоящее время широко используется для лечения псориаза (гиперпролиферативного заболевания кожи) (Berth-Jones и Hutchinson, 1992).

2.5 Предстательная железа как орган-мишень

кальцитриола

2.5.1 Эпидемиологические исследования

В 1990 году впервые была опубликована гипотеза о том, что недостаточность витамина Д лежит в основании основных известных к тому времени факторов риска возникновения рака предстательной железы, включая проживание в северных широтах, пожилой возраст и черный цвет кожи (Schwartz и Hulka, 1990). Все перечисленные факторы риска связаны с низким потреблением солнечного ультрафиолетового излучения, которое определяет количество активных метаболитов витамина Д в циркуляторном русле (ультрафиолетовое излучение в диапазоне длин волн 280-320 нм, UVB). Низкая солнечная активность в северных широтах не обеспечивает количества UVB, достаточного для эффективного синтеза витамина Д. Пигмент черной кожи меланин конкурирует с 7-дегидрохолестеролом за UVB и, таким образом, замедляет продукцию витамина Д в коже (Holick, 1981). Высокая степень недостаточности витамина Д у пожилых людей связана с недостаточной продолжительностью нахождения на открытом воздухе и истончением эпидермиса, содержащего меньше 7-дегидрохолестерола. Недостаточность витамина Д среди пожилых людей широко распространена во всем мире, особенно среди людей прикованных к постели, а также среди американцев и европейцев более молодого возраста (Li, 2007; Porojnicu, 2007). В поддержку гипотезы о противоопухолевом действии витамина Д служат данные о пониженном риске рака предстательной железы среди японцев, проживающих в Японии, для которых характерен очень высокий уровень кальцидиола в крови (Nakamura, 1999; Nakamura, 2000), связанный с традиционно высоким потреблением жирной рыбы. Шварц и Хулка предположили, что витамин Д поддерживает клетки предстательной железы в дифференцированном состоянии, а недостаточность витамина Д приводит к переходу от начальной стадии, гиперплазии (доброкачественного избыточного роста клеток), к злокачественному заболеванию (Schwartz и Hulka, 1990). Эта гипотеза согласовывалась с наблюдениями о противоопухолевом действии витамина Д по огношению к другим гормон-зависимым типам рака, таким как рак кишечника и рак молочной железы (Garland, 1989), и пробудила интерес к исследованию действия кальцитриола в предстательной железе.

Результаты эпидемиологических исследований, направленных на выявление взаимосвязи между содержанием метаболитов витамина Д в плазме крови и риском

развития рака предстательной железы неоднозначны. Данные наиболее крупных сероэпидемиологических исследований по методике "случай-контроль" в рамках когортного исследования (nested case-control) поддерживают положение о том, что недостаточность витамина Д может служить причиной развития рака предстательной железы. Так, по данным исследования, проведенного Кордер и коллегами, низкий уровень кальцитриола в плазме крови связан с более высокой вероятностью развития опухоли предстательной железы (Corder, 1993). По данным другого крупного ретроспективного исследования, проведенного среди 19000 мужчин среднего возраста проживающих в Финляндии, низкий уровень кальцидиола в плазме крови ассоциирован с более ранним возникновением и более быстрым развитием рака предстательной железы (Ahonen, 2000). За 13 лет наблюдения в этом исследовании было выявлено 149 случаев рака предстательной железы. Туохимаа и коллеги в крупном исследовании, проведенном среди мужчин, проживающих в Норвегии, Швеции и Финляндии показали, что как очень низкий, так и очень высокий уровень кальцидиола в плазме связан с повышенным риском возникновения рака предстательной железы (Tuohimaa, 2004). В исследовании, проведенном Ли и коллегами среди 14916 американских врачей в рамках проекта Physicians' Health Study, в течение 18 лет было выявлено 1066 случаев рака предстательной железы. В этом исследовании было показано, что низкий уровень кальцидиола и кальцитриола в плазме крови коррелирует с повышенным риском развития тяжелых форм рака предстательной железы (Li, 2007). Между тем, опубликованы результаты ряда сероэпидемиологических исследований, не обнаруживших связи между риском развития рака предстательной железы и уровнем метаболитов витамина Д в циркуляторном русле (Braun, 1995; Gann, 1996; Nomura, 1998; Faupel-Badger, 2007; Ahn, 2008).

По данным многочисленных исследований выявляется взаимосвязь между полиморфизмом VDR и риском развития рака предстательной железы (Taylor, 1996; Ingles, 1997; Correa-Cerro, 1999; Hamasaki, 2002; Medeiros, 2002; Xu, 2003). Интересные данные были получены Ma и коллегами (Ma, 1998). В крупном исследовании, среди 372 случаев рака предстательной железы на 591 контрольных, они не обнаружили связи между полиморфизмом VDR и риском возникновения рака предстательной железы. Однако, при отдельном анализе случаев с пониженным уровнем кальцидиола плазмы, была обнаружена значимая корреляция. Таким образом, полиморфизм VDR может выступать фактором риска возникновения рака

предстательной железы, если он сопряжен с низким уровнем кальцидиола в циркуляторном русле.

Несколько эпидемиологических исследований было посвящено изучению связи количества потребляемого солнечного излучения и риска возникновения рака предстательной железы. Бодивала и коллеги показали наличие обратной корреляции между продолжительностью нахождения на солнце и риском возникновения рака предстательной железы у взрослых (Bodiwala, 2003). Исследования Джона и коллег подтвердили, что проживание в южных широтах, особенно в детском возрасте уменьшает риск развития рака предстательной железы (John, 2004; John, 2007). Интересные данные были получены при исследовании сезонных изменений содержания метаболитов витамина Д в плазме крови, проведенном среди 14000 мужчин в возрасте от 16 до 80, проживающих в Норвегии. Было показано, что вероятность положительного прогноза при гормон-зависимых формах рака (кишечника, молочной и предстательной желез и лимфомы) значительно изменяется в зависимости от сезона диагностики заболевания, достигая наивысших значений в летне-осенний период, который характеризуется максимальным уровнем кальцидиола в плазме пациентов. Уровень кальцитриола был примерно постоянным в течение года (Porojnicu, 2007).

2.5.2 Метаболизм витамина Д и экспрессия гена VDR в

предстательной железе

В 1998 году впервые были опубликованы данные о наличии 1 а-гидроксилазы кальцидиола в клетках предстательной железы человека (Schwartz, 1998). Присутствие 1 а-гидроксилазы говорит о способности клеток синтезировать кальцитриол и, следовательно, о наличии аутокринной петли действия кальцитриола в клетках предстательной железы. Однако действие кальцитриола в клетках предстательной железы мало изучено. Выдвинута гипотеза о том, что нарушение баланса между 1а-гидроксилазой кальцидиола и 24-гидроксилазой кальцитриола служит одним из ключевых факторов развития рака предстательной железы. Действительно, показано, что в раковых клетках (LNCaP, DU145) экспрессия гена 1а-гидроксилазы понижена, а 24-гидроксилазы - повышена по сравнению с нормальными клетками предстательной железы (PZHPV-7, PNT-2), что может приводить к недостаточной продукции кальцитриола в раковых клетках и, соответственно, к ослаблению кальцитриол-зависимого контроля клеточной пролиферации (Khorchide, 2005).

Наличие VDR в предстательной железе человека было показано в 1992 году (Miller, 1992). Впоследствии VDR был обнаружен в культивируемых клетках предстательной железы различных линий, включая клетки стромы и эпителия, нормальные, раковые и клетки гиперплазии (ВРН) (РееЫ, 1994). Данные иммуногистохимических исследований проб, полученных из предстательной железы прооперированных пациентов, показывают, что индивидуальный уровень VDR в клетках предстательной железы значительно варьирует (Kivineva, 1998). Внутриклеточный уровень VDR регулируется как лигандами VDR, так и другими гормонами и факторами роста. Показано, что кальцитриол повышает содержание белка VDR в клетках-мишенях, благодаря лиганд-зависимой защите VDR от протеосомной деградации (Li, 1999).

2.5.3 Действие кальцитриола на клетки рака предстательной

железы

2.5.3.1 Подавление пролиферации

Способность кальцитриола подавлять рост как нормальных, так и раковых клеток предстательной- железы была продемонстрирована на первичных культурах клеток и на клеточных линиях, а также на клетках опухолей, привитых экспериментальным животным (xenograft models), и предстательной железе крыс in vivo (Peehl, 1994; Skowronski, 1995). Было показано, что систематическое употребление крысами кальцитриола в течение 3 недель приводит к уменьшению размера предстательной железы на 40% вследствие потери как эпителиальных клеток, так и клеток стромы (Konety, 1996; Getzenberg, 1997). В культуре кальцитриол подавляет рост клеток рака предстательной железы в разной степени в зависимости от клеточной линии. Из наиболее известных, кальцитриол значительно подавляет рост клеток LNCaP и в меньшей степени - клеток РС-3 (Skowronski, 1993). Клетки линии DU145 устойчивы к антипролиферативному действию кальцитриола (Skowronski, 1993). Среди менее изученных клеточных линий, кальцитриол в разной степени подавляет рост клеток ALVA 31 (Hedlund, 1996а), РРС-1 (Yu, 1998), MDA РСа (Zhao, 2000) и не влияет на рост клеток JCA-1 (Hedlund, 1996b). Молекулярные механизмы подавления роста клеток кальцитриолом зависят от типа клеток. Для ряда клеточных линий, включая LNCaP, ключевым этапом антипролиферативного действия кальцитриола является блокирование клеточного цикла с последующим накоплением клеток в фазе G0/G1 (Blutt, 1997; Zhuang и Burnstein, 1998). Как правило, блокирование клеточного цикла связано с индукцией ингибиторов циклин-

зависимых киназ р21 и р27 и белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста IGFBP-3 и IGFBP-5, и сопровождается ингибированием циклин-зависимых киназ CDK2, CDK4 и/или CDK6 (Johnson, 2002). Так, в клетках LNCaP кальцитриол индуцирует экспрессию гена р21, что приводит к уменьшению активности CDK2 с последующим дефосфорилированием белка ретинобластомы (Rb) (Zhuang и Burnstein, 1998). Вызванная дефосфорилированием Rb инактивация транскрипционного фактора E2F и приводит к блокированию клеточного цикла. Интересно, что, несмотря на наличие нескольких функционирующих VDRE в регуляторной области гена р21 (Saramaki, 2006), в клетках LNCaP кальцитриол индуцирует экспрессию этого гена не прямо, а через индукцию IGFBP-3. Показано, что антитела, нейтрализующие IGFBP-3, предотвращают индукцию экспрессии гена р21 кальцитриолом, а также вызванное кальцитриолом подавление роста клеток LNCaP, (Boyle, 2001).

Недавно были опубликованы данные о том, что кальцитриол усиливает пролиферацию клеток рака предстательной железы при выращивании этих клеток в совместной культуре с клетками кости (Herring, 2007). Эти данные необходимо учитывать при рассмотрении возможности применения кальцитриола и его аналогов у пациентов с наличием метастаз в костную ткань.

2.5.3.2 Индукция дифференцировки

Несмотря на то, что гипотеза о стимулирующем действии витамина Д на дифференцировку клеток предстательной железы была опубликована еще в 1990 году (Schwartz и Hulka, 1990), однозначного экспериментального подтверждения она пока не получила. В поддержку этой гипотезы служат данные об индукции кальцитриолом экспрессии генов некоторых маркеров дифференцировки эпителиальных клеток предстательной железы, таких как специфический антиген предстательной железы (PSA) (Feldman, 1995) и Е-кадгерин (Campbell, 1997), в клетках LNCaP и РС-3. В клетках предстательной железы крысы линии NRP-152 кальцитриол индуцирует экспрессию генов трансформирующих факторов роста 2 и 3 (TGF-P2 и TGF-рЗ), что сопровождается индукцией экспрессии генов фибронектина и тромбоспондина (Danielpour, 1996). Косвенно, в поддержку гипотезы об участии кальцитриола в дифференцировке клеток предстательной железы служит тот факт, что подавление роста клеток кальцитриолом носит стабильный и необратимый характер. С другой стороны, никаких изменений морфологии клеток и характера

экспрессии генов цитокератинов в первичной культуре клеток предстательной железы человека, инкубированных с кальцитриолом, не обнаружено (РееЫ, 1994).

Показано, что индукция экспрессии гена PSA кальцитриолом осуществляется через активацию сигнальной системы андрогенов (РееЫ, 1994). Кальцитриол индуцирует экспрессию гена рецептора андрогенов (AR) (Hsieh и Wu, 1997), гормонов, которые являются основными факторами, запускающими дифференцировку клеток предстательной железы (Wilson, 1972). При исследовании эпителия предстательной железы кастрированных крыс, было показано, что наибольшего уровня дифференцировки достигает эпителий предстательной железы животных, получавших комбинацию кальцитриола и DHT, а не отдельных стероидов (Konety, 1996).

2.5.3.3 Индукция апоптоза

Кальцитриол вызывает апоптоз клеток различных линий рака предстательной железы (Hsieh и Wu, 1997; Guzey, 2002). То, что механизмы индукции апоптоза кальцитриолом зависят от типа клеток, позволяет объяснить то, что степень кальцитриол-зависимого апоптоза сильно варьирует в клетках различных линий. В клетках LNCaP индукция апоптоза кальцитриолом сопровождается подавлением экспрессии генов таких антиапоптотических белков как Вс1-2 и Всі-Xl (Blutt, 2000). Эти белки блокируют выход цитохрома С из митохондрий, и, соответственно, предотвращают активацию каспазы-3 и каспазы-9, инициирующих митохондриальный каскад реакций апоптоза (Tsujimoto, 1998). Также кальцитриол подавляет экспрессию генов таких антиапоптотических белков как Mcl-1, BAG1L, XIAP, cIAPl и СІАР2 (Blutt, 2000). Показано, чго в клетках со сверхэкспрессией гена Вс1-2 кальцитриол не вызывает апоптоз, однако подавление роста клеток кальцитриолом сохраняется, что подтверждает гипотезу о плейотропной природе противоопухолевого действия кальцитриола (Blutt, 2000).

2.5.3.4 Подавление ангиогенеза и инвазии клеток

Ангиогенез играет ключевую роль в развитии опухоли, поскольку без создания своего собственного кровеносного русла опухоль не может превысить в размере 2-5 мм (Weidner, 1993). Подавление ангиогенеза приводит к гипоксии клеток опухоли и остановке ее роста. Способность кальцитриола подавлять ангиогенез опухоли предстательной железы была продемонстрирована как in vivo, так и in vitro (Majewski, 1996; Mantell, 2000). Механизмы подавления ангиогенеза кальцитриолом не ясны. Один из возможных механизмов связан с подавлением экспрессии гена а-

субьединицы фактора-1, индуцируемого при гипоксии (HIF-1), кальцитриолом. Транскрипционный фактор HIF-1 является одним из ключевых индукторов ангиогенеза. Показано, что кальцитриол подавляет экспрессию и транскрипционную активность HIF-1, что приводит к подавлению транскрипции генов-мишеней HIF-1, задействованных в процессе ангиогенеза, включая VEGF, ЕТ-1 и Glut-1 (Ben-Shoshan, 2007).

Кальцитриол подавляет способность клеток рака предстательной железы к адгезии, и миграции и, тем самым, уменьшает инвазивный потенциал опухоли (Schwartz, 1997; Donald, 1998; Sung и Feldman, 2000; Grant, 2008). Показано, что подавление кальцитиолом способности клеток LNCaP, РС-3 и DU145 к инвазии in vitro сопровождается уменьшением активности нескольких основных протеаз, вовлеченных в процесс инвазии опухоли, а именно, металлопротеиназы матрикса-9 (ММР-9) и катепсинов и увеличением активности тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (ТІМР-1) и ингибиторов катепсинов (Вао, 2006). Кальцитриол-зависимая индукция активности ТІМР-1 приводит к блокированию активности металлопротеиназ и подавлению инвазии опухоли. В клетках рака предстательной железы линий' RWPE-1 и RWPE2-W99 кальцитриол также подавляет активность металлопротеиназ матрикса (ММР-2 и ММР-9) и, соответственно, способность клеток к инвазии (Tokar и Webber, 2005). Также было показано, что кальцитриол подавляет экспрессию генов интегрина-аб и интегрина-рМ в клетках рака предстательной железы линии С4-2 (Shen, 2007).

2.5.4 Взаимодействие между сигнальными системами кальцитриола и андрогенов

В 1941 году Хаггинс и Ходжес обнаружили, что развитие предстательной железы, а также ее заболеваний находятся под контролем стероидных гормонов андрогенов. Андрогены необходимы для развития предстательной железы в эмбриогенезе, а также для поддержания нормального роста и дифференцировки клеток зрелой предстательной железы. С другой стороны, андрогены стимулируют развитие рака предстательной железы, поэтому устранение их действия в течение многих лет лежит в основе лечения этого заболевания. Прямое действие андрогенов, направленное на стимуляцию роста опухоли, хорошо изучено. В настоящее время интерес исследователей начинает привлекать также область непрямого действия андрогенов, связанного с регуляцией экспрессии генов факторов роста и цитокинов. Андрогены связываются с рецептором - лиганд-зависимым транскрипционным

фактором (AR). Ген AR экспрессируется, прежде всего, в дифференцированных секреторных клетках эпителия предстательной железы в нормальном состоянии, а также при гиперплазии и в раковых клетках (Aumuller, 1998; Cooke, 1991; Sweat, 1999). Клетки стромы предстательной железы также синтезируют AR, однако, на более низком уровне (Olapade-Olaopa, 1999). В ответ на андрогены клетки стромы предстательной железы выделяют цитокины, которые индуцируют рост и дифференцировку эпителиальных клеток. Интересно, что в физиологических концентрациях (0.01 - 1 нМ) наиболее активный андроген человека, 5а-дигидротестостерон (DHT), стимулирует рост клеток рака предстательной железы линии LNCaP, а в высоких (>10 нМ) — подавляет (Lee, 1995).

Поскольку клетки LNCaP проявляют высокую чувствительность к антипролиферативному действию кальцитриола и содержат AR, в то время как клетки ALVA31, CWR22R и ряда других линий рака предстательной железы не содержат AR и менее чувствительны к действию кальцитриола, было выдвинуто предположение о том, что андрогены - необходимый компонент антипролиферативного действия кальцитриола (Zhao, 1997; Вао, 2004). Действительно, индукция экспрессии специфического антигена предстательной _г железы (PSA) и синтазы жирных кислот (FAS) кальцитриолом в восприимчивых к андрогенам клетках рака предстательной железы происходит только при наличии андрогенов в культуральной среде и блокируется антиандрогеном Касодекс (Zhao, 1997; Zhao, 2000; Qiao, 2003). Кроме того, было показано, что блокирование AR-зависимого сигнального пути Касодексом (Zhao, 1997; Qiao, 2003) или направленным разрушением РНК или белка AR (Вао, 2004) приводит к подавлению антипролиферативного действия кальцитриола.

При исследовании молекулярных механизмов взаимодействия сигнальных путей VDR и AR рассматриваются такие характерные для лиганд-зависимых ядерных рецепторов механизмы взаимодействия как конкуренция за кофакторы, реципрокная регуляция экспрессии генов рецепторов и ферментов метаболизма лигандов. Так, показано, что кальцитриол индуцирует экспрессию гена AR в клетках LNCaP, что сопровождается повышением содержания AR в ядре и повышением связывания лиганда (Hsieh и Wu, 1997). Однако кальцитриол не оказывает прямого действия на транскрипцию гена AR (Zhao, 1999а), и факторы, через которые передается действие кальцитриола на экспрессию этого гена, не известны. DHT, в свою очередь, индуцирует экспрессию гена VDR, что продемонстрировано на клетках рака яичника (Ahonen, 2000).

Однако было бы неверно говорить о том, что антипролиферативное действие кальцитриола на клетки рака предстательной железы полностью зависит от андрогенов, поскольку кальцитриол может подавлять рост невосприимчивых к андрогену клеток рака предстательной железы. Так, Чен и коллеги обнаружили, что кальцитриол подавляет рост первичной культуры клеток рака предстательной железы РС-3, стабильно трансфицированных конструкцией, экспрессирующей VDR, и не содержащих AR (Chen, 2000). Подавление роста клеток рака предстательной железы линии MDA РСа кальцитриолом также не зависит от действия андрогенов, поскольку не отменяется антиандрогеном Касодекс (Zhao, 2000). Клетки MDA РСа экспрессируют мутантный AR с очень низким сродством к андрогенам (Zhao, 1999b). Клегки линии LNCaP-104Rl, экспрессирующие AR, но не требующие андрогена для роста и пролиферации, также сохраняют восприимчивость к антипролиферативному действию кальцитриола (Yang, 2002). Подавление роста этих клеток кальцитриолом сопровождается индукцией экспрессии гена р27, активацией CDK2 с последующим накоплением клегок в фазе G0/G1 клеточного цикла и не блокируется антиандрогеном Касодекс. Введение AR в экспрессирующие VDR, но устойчивые к антипролиферативному действию кальцитриола, клетки линии ALVA31, t не восстанавливает восприимчивости к кальцитриолу (Yang, 2002). Как видно, не существует корреляции между чувствительностью клеток рака предстательной железы к андрогенам и их восприимчивостью к антипролиферативному действию кальцитриола. Очевидно, что наряду с андроген-зависимыми существуют и андроген-независимые механимы действия кальцитриола. Возможно, кальцитриол задействует различные механизмы при подавлении роста невосприимчивых к андрогенам клеток и клеток, чувствительных к андрогенам, что может оказаться особенно важным при использовании кальцитриола или его аналогов в лечении поздних андроген-независимых стадий рака предстательной железы.

К интересному выводу привели результаты исследования регуляции экспрессии гена специфичного мембранного антигена предстательной железы (PSMA) кальцитриолом и андрогенами в клетках рака предстательной железы (Serda, 2008). Уровень экспрессии гена PSMA прямо коррелирует со степенью тяжести рака предстательной железы и увеличивается при переходе от гормон-зависимой к і ормон-независимой стадии. Кальцитриол, а также сверхэкспрессия гена VDR, подавляли экспрессию гена PSMA, а также уменьшали его количество на поверхности клеток. С использованием вектора, несущего ген-репортер, было показано, что подавление экспрессии гена PSMA кальцитриолом передается через

энхансер, расположенный в одном из интронов этого гена. Подавление трансляции AR с помощью технологии siRNA устраняло кальцитриол-зависимое подавление экспрессии гена PSMA, однако действие кальцитриола на экспрессию этого гена не зависело от наличия андрогенов в среде. Авторы делают вывод о том, что в этой регуляции задействован AR, но не андрогены (Serda, 2008).

2.6 Суперсемейство факторов роста TGF-p и рак предстательной железы

Суперсемейство трансформирующего фактора роста-(3 (TGF-p) у человека включает, по разным данным, от 29 до 42 структурно-родственных факторов роста и подразделяется на TGF-p, активины, ингибины, морфогенетические белки кости и более мелкие подсемейства (Feng и Derynck, 2005). Белки суперсемейства TGF-p синтезируются практически во всех клетках организма и регулируют пролиферацию, дифференцировку, выживание и адгезивные свойства клеток, играя ключевую роль в морфогенезе тканей при заживлении ран, в иммунных реакциях, ангиогенезе и канцерогенезе. В нормальной предстательной железе и при гиперплазии, TGF-p (Merz, 1994; Story, 1996; Cardillo, 2000; Parada, 2004), активины, ингибины (Ying, 1997) и BMP (Harris, 1994; Bobinac, 2005) синтезируются на высоком уровне и действуют по паракринному или аутокринному механизму. Исключение представляют ингибины, которые в значительных количествах поставляются в предстательную железу из клеток Сертоли семенников через циркуляторное русло (De Jong, 1988; Kumanov, 2005).

На ранних стадиях канцерогенеза факторы подсемейства TGF-p формируют путь супрессии опухолеобразования, благодаря своей антипролиферативной активности, способности индуцировать апоптоз и поддерживать генетическую стабильность. Однако на поздних стадиях канцерогенеза эти факторы могут переключаться на противоположную роль, стимулировать рост опухоли, развитие метастаз, дедифференцировку, экспрессию генов металлопротеиназ матрикса, ангиогенез и подавлять иммунный надзор (immunosurveillance). Таким образом, биологическое действие факторов TGF-p неоднозначно, зависит от клеточного окружения и свойств среды. Говорят о "двойственной" роли факторов подсемейства TGF-P в канцерогенезе. В предстательной железе TGF-рі синтезируется преимущественно клетками стромы, секретируется и действует, прежде всего, на эпителиальные клетки, ингибируя их рост и вызывая апоптоз (Story, 1996). Напротив,

TGF-P2 экспрессируется в основном в клетках эпителия (Story, 1996). Одним из ключевых этапов развития рака предстательной железы является появление устойчивости к действию TGF-p. Зачастую, развитие тяжелых форм рака предстательной железы сопровождается пониженным содержанием рецепторов TGF-р, прежде всего TpRJI, и повышенным содержанием самих факторов TGF-P (Guo, 1997; Lee, 1999; Zeng, 2004). Нарушение сигнального пути TGF-pi при раке предстательной железы провоцирует развитие метастаз (Ти, 2003). Так, при скрещивании трансгенных мышей, в предстательной железе которых экспрессировался ген большого Т-антигена опухолеобразующего SV40, с трансгенными мышами, в предстательной железе которых экспрессировался ген доминантно-негативного TpRII, были получены мыши, экспрессирующие оба трансгена. Предстательные железы, несущие двойные мутации, не были увеличены по сравнению с предстательными железами, в которых экспрессировался только большой Т антиген, однако в первом случае метастаз было значительно больше.

Лктивины и ингибины проявляют свое основное действие в эмбриогенезе и в репродуктивных процессах (de Kretser, 2004; Lambert-Messerlian, 2004). В предстательной железе человека субьединицы активинов синтезируются преимущественно эпителиальными клетками (Thomas, 1997). При этом основной ингибиторный связывающий активины белок, фоллистатин, синтезируется в клетках стромы и в базальных клетках эпителия. Активины присутствуют в эпителиальных клетках на всех стадиях рака предстательной железы, однако с развитием рака, злокачественные клетки начинают синтезировать фоллистатин, что приводит к колокализации активинов и фоллистатина и устойчивости к противоопухолевому действию активинов (Thomas, 1997). Также для поздних стадий рака предстательной железы характерна утрата субьединиц ингибинов (Mellor, 1998).

Морфогенетические белки кости (BMP) наиболее важны в ремоделировании костной ткани (Sykaras и Орреппап, 2003). В предстательной железе человека факторы BMP синтезируются в основном в эпителиальных клетках, преимущественно это ВМР-2/4 и ВМР-7 (Bobinac, 2005). При раке предстательной железы картина экспрессии генов BMP может быть различной. Чаще экспрессия генов ВМР-2/4 сохраняется на высоком уровне, а экспрессия гена ВМР-7 подавляется (Bobinac, 2005). BMP являются ключевыми стимуляторами метастаз в костную ткань (Dai, 2005; Feeley, 2005).

Плацентарный трансформирующий фактор роста (PTGF-fi) стоит особняком в суперсемействе TGF-P (Lawton, 1997), но иногда его относят к BMP.

PTGF-J3 известен также под названиями фактор, полученный из предстательной железы (PDF) (Paralkar, 1998), плацентарный морфогенетический белок кости (PLAB) (Hromas, 1997), ингибиторный цитокин-1 макрофагов (MIC-1) (Bootcov, 1997), фактор роста/дифференцировки-15 (GDF-15) (Bottner, 1999; Strelau, 2000) и ген 1, активируемый нестероидными противовоспалительными препаратами (NAG-1) (Ваек, 2001а). Экспрессия гена PTGF-p более тканеспецифична по сравнению с экспрессией генов других факторов суперсемейства. Наиболее высоким содержанием PTGF-P характеризуются плацента, предстательная железа и макрофаги (Lawton, 1997; Paralkar, 1998; Bottner, 1999). По результатам гибридизации in situ в нормальной предстательной железе человека PTGF-P синтезируется на высоком уровне преимущественно эпителиальными клетками под контролем андрогенов (Paralkar, 1998; Thomas, 2001; Uchida, 2003). PTGF-P присутствует и в культивируемых клетках предстательной железы человека различных линий. Наиболее высоким содержанием PTGF-P характеризуются клетки LNCaP и РС-3. Показано, что эти клетки синтезируют и секретируют в культуральную среду значительные количества биологически активного PTGF-P (Кагап, 2003; Liu, 2003; Uchida, 2003). Подобно другим факторам суперсемейства TGF-p, PTGF-p оказывает, действие по аутокриному или паракринному механизму. PTGF-P стимулирует апоптоз, дифференцировку и подавляет пролиферацию многих типов клеток (Li, 20006; Baek, 20016; Liu, 2003), однако его основная функция не ясна. Значение PTGF-Р в канцерогенезе не известно. В культуре PTGF-P подавляет рост клеток рака кишечника (Ваек, 2001а) и остеосаркомы (Tan, 2000), а также подавляет рост клеток глиобластомы, пересаженных в мышей линии nude (мыши "лишенные волосяного покрова", имеющие рудиментарный тимус) (Albertoni, 2002). Предполагается, что PTGF-P может быть вовлечен в развитие рака желудка (Lee, 2003). В раковых клетках различного происхождения, включая клетки рака предстательной железы, часто наблюдается сверхэкспрессия гена PTGF-P (Welsh, 2001; Nakamura, 2003; Welsh, 2003; Koopmarm, 2004). Однако по данным Томаса и коллег при развитии аденокарциномы происходит, напротив, значительное снижение уровня экспрессии PTGF-P в исходном сайте заболевания и реэкспрессия его гена в метастазах кости (Thomas, 2001). Также отмечено повышение синтеза PTGF-p при переходе клеток LNCaP от андроген-зависимого к андроген-независимому состоянию (Кагап, 2002; Кагап, 2003). Переход клеток LNCaP в фазу андроген-независимого роста рассматривается как модель перехода аденокарциномы в андроген-независимое состояние, которое характерно для более агрессивных поздних форм рака

предстательной железы. По-видимому, в этом отношении PDGF-p разделяет основные черты факторов роста суперсемейства TGF-Р, которые могут как подавлять, так и стимулировать развитие опухоли в зависимости от физиологических свойств среды и клеточного окружения.

Факторы роста TGF-Р действуют в составе гомодимеров. Большинство факторов суперсемейства секретируется в виде предшественников, содержащих большой просегмент и зрелый С-концевой пептид, связанные дисульфидными мостиками. После димеризации просегмент остается связанным с _ димером и поддерживает его в неактивном состоянии заякоренным на экстраклеточном матриксе через скрытый TGF-Р связывающий белок (LTBP) (Amies, 2003). Активация происходит путем протеолитического отщепления просегмента, приводящего к высвобождению димера. Доступность факторов TGF-Р регулируется многими как секретируемыми, так и заякоренными на матриксе белками, которые связывают ростовые факторы, и тем самым, выводят их из среды связывания с рецепторами (Annes, 2003).

Факторы суперсемейства TGF-Р связываются с двумя структурно родственными трансмембранными рецепторными комплексами семейства сериновых/треониновых протеинкиназ (Feng и Derynck, 2005). Характерной особенностью этих рецепторов является складка типа "tree - finger toxin" в лиганд-связывающем экстраклеточном домене (Greenwald, 1999), наличие единственного трансмембранного домена и внутриклеточного протеинкиназного домена. Рецепторы типа I отличаются от рецепторов типа II наличием богатого глицином и серином примембранного активирующего домена (GS домен). Несмотря на структурное сходство два типа рецепторов играют различную роль в проведении сигнала. В отсутствие л и ганда рецепторы обоих типов находятся в составе гомодимеров. После связывания лиганда с обоими типами рецепторов одновременно, конститутивно активный киназный домен рецептора типа II фосфорилирует рецептор типа I по множеству сайтов в составе GS домена (Wrana, 1994). Активированный таким образом рецептор типа I запускает каскад сигнальных реакций в цитоплазме (Massague, 2005).

Нити

экстраклеточного

матрикса

1 Г=

Связанная форма фактора роста суперсемейства TGF-B

TGF-R

Ras Daxx _D. ТАКІ МККЗ

Негеномные пути

Транскрипционный фактор

r\J\S\J\f\?x

Транскрипционная машина

і

. УъС\_к.Г:

Рис. 3. Обобщенная схема сигнальных путей факторов роста суперсемейства TGF-p. 1.

Фактор роста суперсемейства TGF-p (далее - TGF-P) связан с нитями экстраклеточного матрикса (ECL) через скрытый TGF-P - связывающий белок (LTBP); TGF-P высвобождается из комплекса с ECL в результате протеолитического расщепления; 2. Активация TGF-P на клеточной поверхности. Бетагликан (рецептор III типа) презентирует лиганд рецепторам типа I (RI) и II (RII); 3. Связывание активированного TGF-P со специфичными рецепторами на поверхности клетки приводит к димеризации RI и RII; R1I активирует RI путем фосфорилирования; 4. Рекрутирование R-SMAD к рецепторному комплексу и их активация путем фосфорилирования по SHS домену; 5. Сборка комплекса R-SMAD - Co-SMAD и его транслокация в ядро; 6. Активация транскрипции генов-мишеней с участием SMAD комплекса. Указаны известные взаимодействия между специфичными сигнальными белками и рецепторами TGF-p.

Для обоих типов рецепторов обнаружено по нескольку изоформ. Как правило, факторы роста суперсемейства TGF-p демонстрируют высокое сродство по отношению только к одному типу рецепторов. При этом связывание лиганда с высокоафинным рецептором является необходимым условием для связывания лиганда с низкоафинным рецептором (Greenwald, 2004; Keller, 2004). Такие белки клеточной поверхности как бетагликан (рецептор III типа) и эндоглин дополнительно регулируют эффективность связывания и специфичность лигандов по отношению к рецепторным комплексам (Lopez-Casillas, 1993; Lebrin, 2004). Многие рецепторы как типа I так и типа II имеют множественную специфичность. Например, ActRII характеризуется особенно широкой специфичностью, связываясь как с активинами, так и с BMP, и, таким образом, служит связующим звеном между подсемействами TGF-p. Широкой специфичностью обладает и ALK2, рецептор типа I, передающий сигналы от ВМР7 (Macias-Silva, 1998) и от низкородственной Mullerian inhibiting substance (MIS) (Clarke, 2001; Visser, 2001). Картина усложняется тем, что один и тот же лиганд зачастую активирует несколько комбинаций рецепторов I и II типов. Таким образом, сигнал от факторов роста суперсемейства TGF-p во многом определяется набором соответствующих клеточных рецепторов. Молекулярные . механизмы, отвечающие за кооперативную сборку рецепторного комплекса и природа множественной специфичности рецепторов суперсемейства TGF-Р мало изучены.

Белки SMAD (гомологи Mothers Against Decapentaplegic, Drosophila) являются центральным звеном сигнальной системы факторов роста суперсемейства TGF-p, передавая сигнал от лиганд-рецепторного комплекса на поверхности клетки к транскрипционной машине в ядре. Выделяют три группы белков SMAD: R-SMAD, лиганд-специфичные, активируемые рецепторами (SMAD1, 2, 3, 5 и 8 у млекопитающих), общие SMAD (SMAD4, common SMAD) и ингибиторные, I-SMAD (SMAD6 и 7). R-SMAD и SMAD4 содержат два консервативных полипептидных домена, МН1 (N-концевой) и МН2 (С-концевой), связанные менее консервативным линкерным' сегментом (Feng и Derynck, 2005). Домен МН2 обладает ДНК-связывающей активностью, а МН1 - белок-связывающей. Белки R-SMAD непосредственно взаимодействуют с активированными рецепторами I типа, которые фофорилируют их по сайту SXS. SMAD1, 5 и 8 являются специфичными субстратами рецепторов BMP (BMP-RIA, BMP-RIB, ALK-1 и ALK-2), в то время как рецепторы TGF-Р и активина (TpRI и ActRJB соответственно) активируют SMAD2 и SMAD3 (Itoh, 2000; Feng и Derynck, 2005). Фосфорилированные R-SMAD диссоциируют от

рецепторов и формируют гетеромерные комплексы со SMAD4, состоящие из двух молекул R-SMAD и одной молекулы SMAD4 (Chacko, 2004). Далее гетеротримеры SMAD переходят в ядро, где связываются со специфичными последовательностями ДНК и направляют сборку больших нуклеопротеиновых комплексов, обеспечивающих регуляцию транскрипции. Таким образом, белки SMAD являются индуцированными лигандом транскрипционными факторами. I-SMAD контролируют сигнальные пути SMAD путем предотвращения фосфорилирования и/или ядерной транслокации R-SMAD. Кроме того, I-SMAD рекрутируют убиквитин-лигазы, что приводит к протеосомной деградации рецепторного комплекса TGF-p. Выявлено несколько дополнительных белков, которые регулируют связывание SMAD с рецепторами I типа и их фосфорилирование, такие как SARA (Tsukazaki, 1998; Wu, 2000) и Disabled-2 (Dab-2) (Hocevar, 2001).

Белки SMAD обладают низкой ДНК-связывающсй активностью и, как правило, действуют кооперативно с высокоафинными сиквенс-специфичными ДНК-связывающими транскрипционными факторами, такими как TFE3, АР-1, Spl, CREB, Runx и др. С этой точки зрения белки SMAD являются кофакторами транскрипционными факторов. Как правило, комплексы SMAD рекрутируются связанными с ДНК транскрипционными факторами. SMAD3 и SMAD4 связываются в большой бороздке ДНК. Оптимальной последовательностью для их связывания является 5'-GTCTAGAC-3' (Shi, 1998). В регуляторной области гена c-myc SMAD3 связывается с последовательностью GGCGGG, что необходимо для транскрипционной репрессии этого гена фактором TGF-p (Frederick, 2004). SMAD2, в отличие от других R-SMAD, не связывается с ДНК (Shi, 1998). Считается, что комплекс SMAD2/SMAD4 связывается с ДНК через SMAD4. Белки SMAD могут взаимодействовать одновременно с несколькими ДНК-связывающими транскрипционными факторами, которые и определяют специфичность сигнала. R-SMAD, в свою очередь, рекрутируют к транскрипционной машине различные коактиваторы и корепрессоры (Feng и Derynck, 2005), а также взаимодействуют с базальной транскрипционной машиной через связывание с фактором СВР/рЗОО (Pouponnot, 1998). Таким образом, сигнальный путь TGF-p эффективно и тонко регулируется на уровне дифференциального взаимодействия рецепторов типов I и II, формирования SMAD комплекса, взаимодействия рецепторов и белков SMAD с дополнительными белками (SARA, Dab-2) и транскрипционными факторами.

Сигнальный путь с участием белков SMAD является основным, но не единственным в сигнальной системе факторов роста суперсемейства TGF-(3. Независимо от активации белков SMAD, эти факторы способны инициировать и другие внутриклеточные сигнальные реакции, например, каскады митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), включая ERK, JNK и р38, активировать Rho-подобные гуанозинтрифосфатазы, протеинфосфатазу 2А (РР2А) и фосфатидилинозитол-3-киназу (РІЗК) (Derynck и Zhang, 2003; Javelaud и Mauviel, 2005). Показано, что активация ингибиторов циклин-зависимых киназ р15 и р21 в кератиноцитах НаСаТ (Ни, 1999), а также индукция транскрипции гена фибронектина фактором TGF-pi (Hocevar, 1999) не требует белков SMAD. Факторы роста суперсемейства TGF-P могут вызывать как отсроченную во времени, так и быструю активацию МАРК. Отсроченная во времени активация МАРК, по-видимому, отражает SMAD-зависимый транскрипционный ответ. Быстрая активация МАРК (в течение 5-10 минут) является следствием прямой активации киназ киназ МАРК (МАРККК) (Derynck и Zhang, 2003). Показано, что в клетках, не содержащих SMAD4, и клетках, сверхэкспрессирующих доминантно-негативные SMAD, TGF-P 1 активирует JNK несмотря на дефект SMAD каскада (Engel, 1999). Также выявлено, что мутантный TpRI, не способный активировать SMAD, может активировать р38 в ответ на TGF-pi (Yu, 2002). Активация МАРК и других "альтернативных" сигнальных путей может также выступать в качестве дополнительных регуляторов сигналов SMAD (Yamaguchi, 1999; Yue и Mulder, 2000; Mazars, 2001). Активация R-SMAD регулируется различными цитоплазматическими киназами в зависимости от типа клеток. Среди них циклин-зависимые киназы (CDK), протеинкиназа С (РКС), Са-кальмодулинзависимая киназа (СаМКП), казеин киназа I и Akt (протеинкиназа В), которые фосфорилируют линкерный участок SMAD по различным сайтам. Дифференциальное фосфорилированиє значительно влияет на конечный ответ на белки SMAD. Сигнальные пути SMAD и МАРК, активированные факторами суперсемейства TGF-P, могут не только действовать кооперативно, но и противодействовать (Kimura, 2000). Таким образом, баланс между активацией SMAD и МАРК может определять физиологический ответ на TGF-p.

Регуляция сигнальных путей факторов роста суперсемейства TGF-p кальцитриолом зависит от типа клеток и мало изучена. Большинство проведенных исследований касается взаимодействия между сигнальными путями кальцитриола и факторов подсемейства TGF-P и только несколько сообщений посвящено факторам других подсемейств. Исследования по взаимодействию сигнальных путей

кальцитриола и его аналогов с факторами TGF-p, проведенные на остеобластах, кератиноцитах, клетках рака молочной железы, лейкемии и рака предстательной железы, выявили различные механизмы этого взаимодействия (таблица 1). Показано, что кальцитриол и его аналоги могут, как усиливать, так и ослаблять активность факторов TGF-P путем активации экспрессии генов TGF-p, их рецепторов или других связывающих белков, а также через независимые от транскрипции пути. Кроме того, обнаружено, что SMAD3 и SMAD7 могут выступать как кофакторы кальцитриола, обеспечивая взаимодействие кальцитриола и TGF-P в регуляции транскрипции генов-мишеней (Yanagi, 1999; Yanagisawa, 1999). Был описан синергичный эффект кальцитриола и TGF-p в регуляции экспрессии ряда генов (Liu, 1999; Kassem, 2000; Kveiborg, 2002; Pavasant, 2003).

Таблица 1. Этапы сигнальных путей TGF-р, регулируемые калыдитриолом и его аналогами

Коли и коллеги показали, что кальцитриол и некоторые его аналоги (ЕВ 1089, МС903 и КН1060), которые подавляют рост клеток рака молочной железы как in vitro, так и in vivo, значительно повышают содержание мРНК TGF-pi в клетках карциномы молочной железы линии ВТ-20 (Koli и Keski-Oja, 1995). Также эти исследования выявили координированную регуляцию скрытого TGF-P-связывающего белка и TGF-pi в клетках ВТ-20, инкубированных с кальцитриолом. А именно то, что повышение уровня мРНК, секреции и активности белка TGF-pi кальцитриолом сопровождается увеличением количества скрытого TGF-P-связывающегося белка в культуральной среде и, соответственно, переходом TGF-pi в неактивное состояние. Таким образом, кальцитриол и его аналоги повышают содержание как активной, так и неактивной латентной формы TGF-pi в клетках ВТ-20. Нагель и коллеги выяснили, что рост остеобластов человека, содержащих доминантно-негативный TpRlI, лишенный киназной активности, в культуре не подавляется кальцитриолом, а значит подавление роста остеобластов кальцитриолом опосредуется рецепторами TGF-p (Nagel и Kumar, 2002). Они показали, что

кальцитриол повышает содержание мРНК и количество TpRI и T[3RII на поверхности клеток и то, что эти явления не связаны с транскрипцией. Чен и коллеги обнаружили, что кальцитриол повышает чувствительность клеток рака кишечника человека линии Сасо-2 к антипролиферативному действию TGF-pi двумя независимыми путями: через индукцию экспрессии гена рецепторов инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF-2), которые облегчают активацию скрытого TGF-pi в клетках Сасо-2, и через индукцию эспрессии гена TpRI (Chen, 2002). Также они показали, что кальцитриол увеличивает количество активного TGF-pi в культуральной среде клеток Сасо-2. Мерфи и Уэйгель обнаружили, что в подавление роста клеток рака предстательной железы линии РС-3 кальцитриолом вовлечены два независимых сигнальных пути, TGF-pi и IGFBP-3, каждый из которых в отдельности недостаточен для проявления действия кальцитриола (Murthy и Weigel, 2004). Они показали, что в клетках РС-3 кальцитриол увеличивает синтез и активность TGF-pl. В свою очередь, TGF-pl индуцирует экспрессию гена VDR, как показано на клетках лейкемии человека линии HL-60, что также может объяснять синергичность действия TGF-pl и кальцитриола (Jung, 1999).

На клетках эритролейкемии мыши показано взаимодействие между кальцитриолом и активином A (Nagasaki, 1997; Waki, 2001). В этих клетках кальцитриол усиливает ингибиторный эффект активина А на пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, показано, что в клетках лейкемии человека HL-60 кальцитриол действует синергично с TGF-pl, TGF-P2 и активином А по подавлению пролиферации клеток и индукции дифференцировки моноцитов (Okabe-Kado, 1991).

2.7 Суперсемейство факторов роста PDGF/VEGF и рак

предстательной железы

Суперсемейство тромбоцитарного фактора роста/сосудисто-эндотелиального фактора роста (PDGF/VEGF) включает по крайней мере 10 близкородственных факторов роста. К настоящему времени идентифицировано 4 полипептида PDGF (PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C и PDGF-D). Подсемейство VEGF подразделяется на факторы VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E) и факторы роста плаценты (PIGF). Члены суперсемейства PDGF/VEGF синтезируются, как в нормальных, так и в раковых клетках различного происхождения, включая клетки глиобластомы, рака яичика и рака предстательной железы. Факторы роста суперсемейства PDGF/VEGF обладают митогенной активностью по отношению ко

многим типам клеток, включая клетки гиперплазии предстательной железы (Vlahos, 1993), стимулируют подвижность клеток, поддерживают их выживание и индуцируют ангиогенез. Основное действие этих факторов роста при раке проявляется в индукции неоваскуляризации (патологического роста новых сосудов). Селективная блокада рецепторов PDGF и VEGF приводит к ингибированию ангиогенеза опухоли (Haluska и Adjei, 2001; Lu, 2005). Однако если для факторов подсемейства VEGF показано их мощное митогенное действие по отношению к эндотелиальным клеткам (Asahara, 1999; Li и Keller, 2000), то действие факторов PDGF на ангиогенез изучено меньше.

В настоящее время появляется все больше данных о том, что факторы суперсемейства PDGF/VEGF вовлечены в канцерогенез. Факторы PDGF могут вызывать злокачественную трансформацию клеток и служат митогенами для раковых клеток. Часто наблюдается коэкспрессия генов PDGF и их рецепторов в раковых клетках или клетках, поддерживающих их пролиферацию и выживание. Таким образом, PDGF могут поддерживать рост опухоли, действуя по паракринному или по аутокринному механизму. Впервые указание на то, что аутокринная сигнальная петля PDGF может приводить к злокачественной трансформации, появилось при обнаружении гомологии между В-цепью PDGF и продуктом вирусного онкогена v-Sis. Дальнейшие исследования подтвердили трансформирующую активность кДНК человеческого PDGF-B (Johnsson, 1984), а также показали, что экспрессия генов PDGF-A, PDGF-C или PDGF-D в фибробластах линии NIH3T3 приводит к трансформации клеток (Fry, 1986; Greco, 1998). Показано, что возникновение злокачественных образований различного происхождения может быть связано с мутационной активацией PDGF или их рецепторов. Удалось продемонстрировать, что клетки, сверхэкспрессирующие ген PDGF-B, при трансплантации мышам линии nude индуцируют образование опухолей (Forsberg, 1993).

Характер экспрессии генов PDGF в предстательной железе, а также роль PDGF в регуляции роста клеток предстательной железы мало исследованы. Показано, что гены рецепторов PDGF часто сверхэкспрессируются как в первичном очаге рака предстательной железы, так и в метастазах в костную ткань (Fudge, 1994; Chott, 1999). Предполагается, что PDGF стимулирует костные метастазы рака предстательной железы. В клетках рака предстательной железы человека линии РС-ЗММ2, выращенных в костной ткани мышей линии nude, обнаружено высокое содержание активированных PDGF и их рецепторов (Uehara, 2003). Блокирование

действия PDGF ингибиторами их рецепторов приводит к уменьшению частоты возникновения и размеров опухолей, а также к уменьшению метастаз в лимфатические узлы, что сопровождается значительным уменьшением количества активированных рецепторов PDGF на поверхности клеток, подавлением пролиферации раковых клеток и усилением апоптоза. В исследованиях на животных, а также в клинических исследованиях на человеке показано, что селективные ингибиторы тирозинкиназ PDGFR замедляют развитие рака предстательной железы.

Предполагается, что важную роль в развитии рака предстательной железы играют изоформы PDGF-BB и PDGF-DD, действующие через рецептор PDGFR(3, который синтезируется на высоком уровне в клетках гиперплазии предстательной железы (Vlahos, 1993; Ustach, 2004). Показан митогенный эффект PDGF-BB на клетки гиперплазии предстательной железы в культуре, что свидетельствует о возможной роли PDGF в развитии гиперплазии (Vlahos, 1993). Кроме того, выдвинуто предположение о том, что PDGF-A, действующий через PDGFRa, стимулирует развитие гиперплазии предстательной железы (Fudge, 1994).

Факторы роста семейства PDGF в форме гомо- или гетеродимеров связываются с рецепторами - трансмембранными тирозинкиназами. Связывание лиганда индуцирует димеризацию и активацию рецептора. Детали активации рецепторов PDGF открыты не полностью, но основные этапы известны, они включают аутофосфорилирование рецептора, которое инициирует каскад сигнальных реакций, и подавление собственной фосфатазной активности рецептора, что служит, по-видимому, для амплификации сигнала (Shimizu, 2001).

К настоящему времени идентифицировано 5 димеров PDGF: PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC и PDGF-DD (Yu, 2003). PDGF секретируются в активной форме, за исключением PDGF-CC и PDGF-BB, которые активируются путем протеолитического расщепления (LaRochelle, 2001). PDGF действуют по паракринному или по аутокринному механизму через связывание с двумя структурно-родственными формами рецепторов, PDGFRa и PDGFR|3 (Matsui, 1989). При этом PDGFRaa активируется связыванием PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB и PDGF-CC, а PDGFRpp -связыванием PDGF-DD (Matsui, 1989; Gilbertson, 2001; LaRochelle, 2001). Гетеромерный комплекс PDGFa(3 активируется PDGF-AB, PDGF-BB и PDGF-CC. Доступность рецепторов, один из определяющих факторов в регуляции действия PDGF, находится под влиянием многих факторов, включая TGF-Р1, ретиноиды, эстрогены, TGF-a, и значительно изменяется в ходе таких патологических процессов как развитие рака, СПИДа и воспаления.

в с

С D

_{# W}

_{Р Р.}

SHP2 РТР10 PLC-/

А.

А А А

Рисунок 4. Схемы

взаимодействия между PDGF и> его рецепторами.

А. Указаны сочетания
различных изоформ PDGF и
их рецепторов; В.

Схематическое изображение
структуры рецептора PDGF.
Белыми кругами показаны
экстраклеточные
иммуноглобулин-подобные
домены. Черными кругами
показаны тирозинкиназные
домены (ТК.1 и ТК2).
Группы из нескольких
остатков тирозина, которые
аутофосфорилируются в
составе одного домена
показаны как Р в круге.
Указаны известные

взаимодействия между

сигнальными белками и
фосфотирозинами в составе
PDGFR (Схема построена на
основании данных

представленных Джонсом и Кроссом (Jones и Cross, 2004))

Различия сигнальных путей PDGFRa и PDGFRP не ясны. Исследования на тканевых культурах in vitro выявили, что клеточные события, вызванные PDGF в клетках, экспрессирующих гены PDGFRa или PDGFRp, мало> различаются (Rosenkranz и Kazlauskas, 1999). Напротив, фенотипы мышей, лишенных PDGFRa или PDGFRp (PDGFR knockout mice), различаются кардинально, что позволяет сделать вывод о том, что гены этих рецепторов экспрессируются в эмбриогенезе в различное время и в различных тканях, и в эмбриогенезе PDGFRa и PDGFRP задействованы в принципиально различных процессах (Soriano, 1994; Soriano, 1997). В течение минут после аутофосфорилирования рецепторы PDGF активируют множество различных сигнальных путей (Tallquist и Kazlauskas, 2004). Активированные рецепторы рекрутируют белки-передатчики сигнала, содержащие собственный 8Н2-домен, и активируют сигнальные белки, из которых наиболее изученными являются киназы семейства Src, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), фосфолипаза Cyl (PLCy) и Ras. В отличие от фосфорилирования по киназному домену, которое необходимо для активации тирозинкиназной активности рецептора, фосфорилирование PDGFR по определенным остаткам тирозина вне киназного

домена необходимо для создания высокоафинных сайтов для связывания с сигнальными белками. Кроме того, рекрутирование РГЗК и PLCy к плазматической мембране через SH2 домен увеличивает их доступ к мембранным субстратам. Показано, что PDGF не вызывает переход клеток в S фазу клеточного цикла, если киназы семейства Src, Ras, PI3K, PLCy и фосфатаза фосфотирозина SHP-2 блокированы (Claesson-Welsh, 1994; Kazlauskas, 1994; Roche, 1996). Полная картина внутриклеточных событий, обеспечивающих PDGF-зависимую пролиферацию клеток не ясна, как и роль различных сигнальных ферментов, активируемых PDGF, в регуляции клеточного цикла. Показано, что в течение минут после добавления PDGF в культуральную среду, сигнальные системы PI3K и PLCy/PKC вызывают миграцию клеток (Kundra, 1994). При более продолжительной инкубации те же самые сигнальные ферменты запускают каскады внутриклеточных реакций, управляющих клеточным циклом (Jones и Kazlauskas, 2000).

Различные факторы, включая некоторые пептидные факторы роста, регулируют чувствительность клеток к действию PDGF (Gronwald, 1989; Thommes, 1996; Не, 2001; Zhou, 2003; Novosyadlyy, 2006). Например, показано кооперативное действие рецепторов PDGF и рецепторов эпидермального фактора роста (EGF) в активации киназ семейства р21-активируемых киназ (РАК) и PDGF-зависимой стимуляции миграции фибробластов (Не, 2001). Более того, показано, что EGF необходим для проявления действия PDGF как на активацию РАК, так и на миграцию фибробластов. Механизмом взаимодействия между EGF и PDGF в данном случае, по-видимому, является PDGF-зависимая трансактивация рецепторов EGF (ErbBl) (Li, 2000а).

2.8 Заилю чение

За последние годы получены обнадеживающие результаты по исследованию противоопухолевой активности кальцитриола в пре-клинических и в первых клинических исследованиях пациентов с тяжелой формой карциномы предстательной железы. Поскольку сам кальцитриол не может быть использован в химиотерапии из-за риска гиперкальцемии, в качестве замены был предложен кальцидиол (Chen, 2000). Кальцитриол, синтезированный клетками предстательной железы из кальцидиола, оказывает свое действие внутри клетки, не переходя в циркуляторное русло, что значительно уменьшает риск гиперкальцемии. Второй путь, предложенный для решения проблемы гиперкальцемии, состоит в прерывистом введении высоких доз кальцитриола пациентам (Beer, 2003; Petrioli, 2007). Третий

путь связан с применением аналогов кальцитриола, обладающих свойством не вызывать гиперкальцемию. За последние 10 лет с этой целью было синтезировано более 2000 аналогов кальцитриола. Среди наиболее перспективных - ЕВ 1089 (Hansen и Маепраа, 1997; Chen, 2003; Crescioli, 2004) и BXL-628 (Marchiani, 2006) - аналоги, которые подавляют рост клеток рака предстательной железы в преклинических моделях и не вызывают значительной гиперкальцемии. Наконец, преклинические исследования выявили, что кальцитриол и его аналоги значительно повышают эффективность других противоопухолевых препаратов и цитотоксических веществ, таких как дсксаметазон (Trump, 2006), доцетаксель (docetaxel) (Tiffany, 2005), эстрамустин (estramustine) (Petrioli, 2007) и др. Такое комбинаторное лечение позволяет достигать высокой эффективности при существенном уменьшении доз отдельных препаратов.

Для разработки биомедицинских препаратов на основе кальцитриола и эффективного использования их в качестве противоопухолевых средств требуется дальнейшее развитие исследований по выявлению молекулярных механизмов действия кальцитриола в раковых клетках. В связи с этим цель нашей работы заключалась в выявлении генов, ответственных за подавление роста клеток рака предстательной железы кальцитриолом и изучение регуляции экспрессии этих генов.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Препараты, приготовление растворов

Стероиды. Кальцитриол (1а,25-дигидроксихолекальциферол) был любезно предоставлен фирмой Leo Pharmaceuticals (Дания) в виде исходного раствора с концентрацией 4 мМ в изопропаноле. Рабочие растворы приготавливали на 96% этаноле и хранили в темных пробирках при -20С в течение недели. С растворами кальцитриола работали при ограниченном освещении. 5а-дигидротестостерон (DHT) (Merck, Германия) получали в лиофилизованной форме. Исходный раствор с концентрацией 1 мМ и рабочие растворы приготавливали на 96% этаноле и хранили при 4С в течение 2 недель.

Факторы роста. Рекомбинантные факторы роста человека - PTGF-р и TGF-pM (R&D Systems, США), PDGF, ВВ-изоформа (Sigma-Aldrich, США) и EGF (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Германия) получали в лиофилизованной форме. Исходные растворы факторов роста с концентрацией 25 мкг/мл и рабочие растворы приготавливали на 10 мМ уксусной кислоте, содержащей 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Roche, Германия), в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей. Растворы факторов роста разделяли на аликвоты во избежание циклов замораживания-оттаивания и хранили при — 70С в течение месяца.

Касодекс (любезно предоставленный фирмой Astra Zeneca, Великобритания), пифитрин-а, актиномицин Д и циклогексимид (Sigma-Aldrich, США) получали в лиофилизованной форме. Касодекс и пифитрин-а растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до к.к. 10 мМ. Циклогексимид растворяли в DMSO до к.к. 80 мг/мл. Актиномицин Д растворяли в 96% этаноле до к.к. 10 мг/мл.

3.2 Методы плеточной биологии

3.2.1 Культивирование клеток

Культуры клеток саркомы предстательной железы линий LNCaP (клон FGC) и РС-3 получены из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, США). Линия клеток LNCaP (клон FGC) ведет происхождение от клеток, выделенных в 1977 году (Horoszewics) из левого надключичного лимфатического узла 50-летнего мужчины, принадлежащего популяции людей белой расы США и Европы (Caucasian) с подтвержденным диагнозом метастазирующеи карциномы предстательной железы

(Murphy, 1980). Клетки LNCaP характеризуются высокой чувствительностью к 5а-дигидротестостерону (Horoszewicz, 1983) и калыдитриолу (Skowronski, 1993). Клетки РС-3 ведут происхождение от клеток метастаз аденокарциномы IV степени предстательной железы в костную ткань 62-летнего Caucasian мужчины (Kaighn, 1979). Клетки первичной культуры стромы предстательной железы человека линий P29SN и P32S были любезно проедоставлены доктором Мерьей Блоер из лаборатории профессора Пентти Туохимаа (TAYS, Финляндия). Клетки линий P29SN и P32S были получены из предстательной железы прооперированных пациентов (Lou, 2003).

Для культивирования клеток использовали среды, инсулин и антибиотики компании Sigma-Aldrich (США), эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота (FBS) фирмы Gibco-BRL (Нидерланды) и посуду компании Nalge Nunc International. Клетки LNCaP и РС-3 культивировали в соответствии с рекомендациями АТСС. Клетки LNCaP выращивали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U/мл пенициллина. Клетки РС-3 выращивали в среде DMEM/F12, содержащей 5% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U/мл пенициллина. Клетки P29SN и P32S выращивали в среде DMEM/F12, содержащей 5 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2.5 мкг/мл амфотерицина В и 100 U/мл пенициллина. Клетки культивировали при 37С в атмосфере 5% С02. Культуральную среду обновляли через 48 ч. Разделение клеток проводили при плотности клеток 70-90%.

3.2.2 Обработка клеток гормонами и факторами роста

Клетки выращивали до субконфлюэнтного состояния. За 24 ч до обработки клеток стероидами культуральную среду заменяли средой с низким (1-5%) содержанием эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, обработанной декстраном (DCC-FBS). Клетки инкубировали в присутствии стероидов в диапазоне концентраций от 0.1 нМ до 100 нМ. Поскольку исходные растворы стероидов имели 96% этанол в качестве растворителя, во всех пробах концентрацию этанола доводили до 0.02%, если не оговорено особо. За 24 ч до обработки клеток факторами роста культуральную среду заменяли средой, содержащей 1% БСА вместо сыворотки. Клетки инкубировали в присутствии факторов роста в диапазоне концентраций от 25 до 250 нг/мл. Поскольку исходные растворы факторов роста имели 10 мкМ уксусную кислоту, содержащую 0.1 % БСА, в качестве растворителя, во всех пробах

концентрацию уксусной кислоты доводили до 10 нМ. Количеством БСА в пробах пренебрегали.

Для исследования фосфорилирования белков SMAD и киназ ERK замену полноценной культуральной среды на среду, содержащую 0.5% БСА вместо сыворотки, проводили за 2 ч до обработки клеток рекомбинантным PTGF-p. Клетки инкубировали в присутствии 1 мкг/мл PTGF-P в течение промежутков времени, увеличивающихся от 2 до 90 мин.

3.2.3 Анализ скорости роста клеток

3.2.3.1 Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Kueng, 1989)

Клетки высевали на 96-луночные планшеты в количестве 1500 клеток на лунку и инкубировали в течение 48 ч до полного прикрепления клеток к подложке. Культуральную среду заменяли средой, содержащей кальцитриол или другие действующие вещества, и инкубировали клетки в течение 4-6 дней, обновляя среду каждый второй день. На контрольных планшетах клетки выращивали в присутствии соответствующих концентраций растворителей. Каждый второй день клетки на одном из планшетов в эксперименте и в контроле фиксировали путем добавления глутаральдегида до к.к. 1.1%. Для освобождения от глутаральдегида планшеты трижды промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе в течение 2 ч. В лунки добавляли по 200 мкл 0.1% раствора кристаллического фиолетового и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре при энергичном покачивании. Планшеты промывали от остатков красителя и высушивали так же как и для освобождения от глутаральдегида. Для растворения связавшегося красителя в лунки добавляли по 100 мкл 10% уксусной кислоты и измеряли поглощение света при 590 нм на спектрофотометре Wallac Victor 1420 Multilabel counter (Wallac Oy, Финляндия). Поглощение света в контроле принимали за 1. Результат выражали как поглощение света при 590 нм пробами, полученными из клеток, обработанных действующими веществами, к поглощению в контроле. Данные получали по результатам двух-трех независимых экспериментов, в каждом из которых на одном планшете идентичные пробы анализировали в 12-ти лунках.

3.2.3.2 Оценка количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего (Tennant, 1964)

Клетки собирали трипсином и осаждали центрифугированием (150 g, 5 мин). В клеточную суспензию, приготовленную на культуральной среде, добавляли равный объем 0.4% трипанового синего. 10 мкл клеточной суспензии наносили под покровное стекло гемоцитометра (камеры Горяева) (Assistent, Германия). Количество живых клеток (не содержащих красителя) подсчитывали под микроскопом. Расчет проводили по результатам трех независимых экспериментов, в каждом из которых проводили троекратное измерение количества клеток в каждой пробе.

3.2.4 Анализ адгезивных свойств клеток (Monboisse, 1991)

Поверхность лунок 96-луночных планшетов покрывали ламинином или коллагеном I (Sigma-Aldrich, США). Для этого в каждую лунку планшета добавляли 50 мкл 15 мкг/мл ламинина или 15 мкг/мл коллагена 1 и инкубировали планшет в течение 2 ч при 37С. Лунки промывали буфером PBS (1.7 мМ КН2РО4, 5.2 мМ ЫагНРСм, 150 мМ NaCl, рН 7.4), содержащим 0.1% БСА. Сайты неспецифичного связывания блокировали инкубацией в растворе 0.5% БСА в PBS при 37С в течение 30 мин. Лунки промывали PBS, содержащим 0.1 % БСА. Планшеты использовали сразу или хранили при 4С в течение недели.

Клетки LNCaP собирали трипсином и ресуспендировали в культуральной среде. Количество жизнеспособных клеток оценивали методом исключения трипанового синего, как описано в предыдущей главе. Суспензию клеток, разведенную до плотности 4x10^s живых клеток/мл среды, высевали на планшеты (по 200 мкл суспензии на лунку), покрытые ламинином или коллагеном I, и инкубировали в течение 2 ч при 37С. Лунки осторожно промывали PBS и фиксировали клетки глутаральдегидом. Для оценки количества прикрепленных клеток применяли метод окраски кристаллическим фиолетовым как описано в главе 3.2.3.1.

3.3 Методы анализа нуклеиновых кислот 3.3.1 Выделение РНК

Суммарную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя для клеток, прикрепленных к подложке. Из культуральных колб удаляли среду и немедленно

добавляли реагент TRIzol из расчета 1 мл реагента на 25 см² поверхности культуры. Колбы покачивали до полного отделения клеток от подложки. Суспензию клеток интенсивно пипетировали до исчезновения вязкости, переносили в пластиковые пробирки и оставляли при комнатной температуре на 5 мин для полной экстракции клеточной РНК. На этой стадии пробы замораживали и хранили при -70С в течение месяца или сразу продолжали дальнейшую очистку РНК. К пробам добавляли 0.2 объема (от обьема реактива TRIzol) хлороформа, пробы интенсивно встряхивали в течение 15 с и инкубировали 3 мин при комнатной температуре. Органическую (содержащую ДНК и белки) и водную (содержащую РНК) фазы расслаивали центрифугированием (4С, 12000 g, 15 мин). Верхнюю (водную, РНК-содержащую) фазу собирали, переносили в чистую пробирку и осаждали РНК инкубацией в присутствии 0.5 обьемов (от количества реагента TRIzol) изопропанола в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок РНК собирали центрифугированием (4С, 12000 g, 10 мин), промывали 75% этанолом с последующим центрифугированием при 7500 g, 4С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли с помощью автоматической пипетки, осадок РНК высушивали под тягой в течение 5-10 мин и растворяли в 25 мкл стерильной деионизованной воды, свободной от РНКаз (обработанной диэтиленпирокарбонатом (DEPC)). Для более полного растворения РНК пробы инкубировали при 55-60С в течение 10 мин. Концентрацию РНК определяли по поглощению при 260 нм, считая, что 1 оптическая единица соответствует поглощению 40 мкг/мл РНК. Степень очистки полученных препаратов РНК от белков определяли по соотношению показателей поглощения света при 260 нм и 280 нм, считая допустимым варьирование величины этого соотношения в диапазоне от 1.8 до 2.1. Растворенную РНК хранили при -70С в течение 1 месяца.

3.3.2 Электрофорез РНК (Masek, 2005)

Качество выделенной из клеток суммарной РНК оценивали электрофоретически. 1.5% агарозный гель готовили на буфере ТАЕ (40 мМ Трис, 20 мМ ацетат Na, 2 мМ EDTA, рН 8.0), содержащем 6% формальдегид. Пробы для электрофореза, содержащие 3 мкг РНК (растворенной в минимальном объеме воды, свободной от РНКаз) в буфере 1 (6.5% формальдегид, 50% формамид, 10 мкг/мл бромистый этидий), инкубировали при 60С 15 мин и помещали на лед на 3 мин. Перед внесением в гель к каждой пробе добавляли 1/10 объема (от объема проб) буфера 2 (50% глицерол, 1 мМ ЭДТА, 0.2% бромфеноловый синий, 0.2% ксиленцианол). Конечный объем проб составлял 11-22 мкл. В качестве

электродного буфера использовали буфер 1. Префорез проводили при напряженности поля 5 В/см в течение 5-15 мин. Электрофорез - при тех же условиях в течение 45 - 60 мин. Гель фотографировали в ультрафиолетовом свете.

3.3.3 Скрининг генов на микрочипах кДНК

3.3.3.1 Получение меченой кДНК

Меченую кДНК получали в реакции обратной транскрипции на матрице суммарной клеточной РНК, с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих 12-18 дсзокситимидиновых остатков (dT)i2-i8 (Amersham Pharmacia Biotech, США). Обратную транскрипцию осуществляли с использованием набора High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя в циклере GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, США). Реакционная смесь содержала 20 мкг суммарной клеточной РНК, обратную транскриптазу, смесь олигонуклеотидных праймеров и реакционный буфер. Реакционная смесь для получения меченой кДНК клеток, обработанных кальцитриолом, содержала также 25 нМ CyTM5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech), а для получения меченой кДНК необработанных клеток (контроль) - 25 нМ СуТМЗ-

dUTP (Amersham Pharmacia Biotech). Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 100 мкл при 42С в течение 80 мин. После завершения обратной транскрипции в реакционную смесь добавляли 1-10 мкл 1М NaOH для отделения полученной кДНК от РНК-матрицы. Нейтрализацию щелочи проводили 1 М раствором Трис-HCl, рН 7.5. кДНК, помеченную СуЗ- и Су5-, собирали на одной колонке Microcon (Millipore, США) и промывали кратковременным микроцентрифугированием в буфере ТЕ (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ EDTA, рН 7.4). На последнем этапе отмывки в буфер добавляли ДНК СОТ-1, поли-А и тРНК дрожжей (Gibco BRL, США) и центрифугировали при 1000g до получения кДНК в конечном обьеме < 10 мкл.

3.3.3.2 Гибридизация кДНК с микрочипами Анализ количества специфичных РНК в составе суммарной РНК клеток с помощью микрочипов кДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей микрочипов. Для гибридизации использовали 2 типа кДНК-микрочипов: микрочипы Human 2-1, содержащие 3000 зондов (Turku Centre for Biotechnology, Финляндия) и микрочипы, содержащие 12000 зондов (Helsinki Biomedicum Biochip Center, Финляндия). Микрочипы промывали последовательно 0.1% SDS, дистиллированной водой и 95% этанолом и высушивали на воздухе.

Смесь меченых кДНК гибридизовали с микрочипами во влажной камере при 65С в течение ночи. После гибридизации микрочипы четырежды промывали дистиллированной водой путем легкого покачивания с последующим центрифугированием.

3.3.3.3 Обработка данных Микрочипы сканировали на установке ScanArray 4000 Series (Packard Bioscience, США) и анализировали с помощью программы QuantArray Microarray Analysis Software (Packard Bioscience). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Excel Date Normalization Macro (Microsoft, США). Каждую пробу кДНК анализировали независимо на двух микрочипах. Данные представлены как результат двух независимых экспериментов.

3.3.4 Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени

Содержание специфичных мРНК в составе суммарной РНК клетки определяли количественным методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. На первом этапе проводили .реакцию обратной транскрипции на матрице суммарной РНК с участием статистического набора праймеров. На втором этапе полученную кДНК амплифицировали с участием специфичных праймеров методом количественной ПЦР. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием набора High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя в циклере GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, США). Реакционная смесь содержала: 8 мкг суммарной РНК, буфер для обратной транскрипции, статистический набор олигонуклеотидных праймеров, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и 250 Е обратной транскриптазы MultiScribe Reverse Transcriptase. Реакция осуществлялась в три этапа: активация обратной транскриптазы и отжиг праймеров с РНК-матрицей при 25С в течение 10 мин; реакция синтеза кДНК на РНК-матрице при 37С в течение 2 ч и инактивация фермента при 95С в течение 5 мин. Пробы кДНК делили на аликвоты и хранили при —20 С.

Количественную ПЦР проводили на установке ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) с использованием реактивов SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Последовательности геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров конструировали с помощью программы Primer Express 2.0 (Applied Biosystems) в соответствии с рекомендациями фирмы-

изготовителя. При дизайне праймеров учитывали требование к тому, чтобы прямой и обратный праймер находились в разных экзонах, для предотвращения амплификации геномной ДНК. Последовательности РНК были взяты из базы данных GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI, США), доступной on-line на сайте NCBI (). Специфичность последовательностей праймеров проверяли on-line с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), также доступной on-line на сайте NCBI. Праймеры заказывали в фирме TAG Copenhagen (Дания). Таблица 2. Список праймеров

Реакцию проводили в объеме ЗО мкл. Реакционная смесь содержала: кДНК-матрицу, прямой и обратный праймеры и SYBR Green PCR Master Mix (Applied

Biosystems), в состав которого входят флуоресцентный краситель SYBR Green I, ДНК-полимераза AmpliTaq Gold, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и буфер для ПЦР. Условия ПЦР были следующими: активация полимеразы AmpliTaq Gold при 95С в течение 10 мин, 40 циклов амплификации — денатурация 15 с при 95С и отжиг с праймерами и элонгация 1 мин при 60С. Результаты ПЦР анализировали с помощью пакета программ ABI Prism 7000 SDS Software Version 1.0 (Applied Biosystems). Кривая диссоциации продектов ПЦР строилась как зависимость отрицательной величины скорости изменения флуоресценции SYBR Green I (-dF/dT, где F - интенсивность флуоресценции, Т - температура) от температуры в интервале температур от 63 до 92С. По кривым амплификации (кривым зависимости интенсивности флуоресценции от цикла амплификации) определяли пороговый цикл (Сг, цикл амплификации, при котором в пробе впервые детектируется статистически значимое повышение уровня флуоресценции относительно фона) для каждой пробы. Стандартные кривые (кривые зависимости Ст от десятичного логарифма количества внесенной кДНК) соответствовали линейной регрессионной модели (коэффициент детерминации R >0,95). По стандартным кривым определяли эффективность амплификации для каждого гена по формуле: Е = 10"^{( tga)}, где a - угол наклона линии регрессии стандартной кривой к оси абсцисс. Соотношения уровней содержания мРНК гена интереса в контроле (интактные клетки) и в эксперименте (клетки, обработанные кальцитриолом и другими действующими веществами) рассчитывали но формуле: г = Е^лс₇', где АСт- разница значений СУ в контроле и в эксперименте и соотносили с аналогичным соотношением по гену внутреннего контроля (ген большой Р0 субьединицы кислого рибосомного фосфорилированного белка, RPLP0) (Pfaffl, 2001). В расчеты брали среднюю величину Ст по троекратному измерению каждой пробы. Представленные значения являются результатом трех независимых экспериментов. Данные представлены как средние значения с указанием стандартных отклонений. Уровень значимости рассчитывали с помощью критерия Стьюдента.

3.3.5 Анализ стабильности РНК (Leclerc, 2002)

Клетки выращивали до субкофлюэнтного состояния. За 24 ч до эксперимента культурапьную среду меняли на среду с низким (1%) содержанием DCC-FBS. Клетки инкубировали в среде, содержащей 10 нМ кальцитриол (эксперимент) или 0.02% этанол (контроль) в течение 24 ч, после чего в культуральную среду добавляли актиномицин Д (Sigma-Aldrich, США) до к.к. 5 мкг/мл. Через промежутки времени,

увеличивающиеся от 1 до 6 ч, клетки собирали для выделения суммарной РНК и анализа методом количественной ОТ-ПЦР. По результатам ПЦР строили диаграммы содержания мРНК PTGF-p в клетках, обработанных кальцитриолом и в контроле. Количество мРНК в клетках до добавления актиномицина Д принимали за 1. Статистическую обработку данных проводиликак указано в главе 3.3.4.

3.4 Методы белковой химии

3.4.1 Выделение белков из культуры клеток

Экстракцию клеточных белков проводили с помощью реагента M-PER (реагент для экстракции белков млекопитающих) (Pierce, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. M-PER модифицировали добавлением ингибиторов протеаз (Complete Mini Protease inhibitor cocktail (Roche, Германия), 1 таблетка/10 мл) и ортованадата натрия (Sigma-Aldrich, США) до к.к. 1 мМ. Культуральную среду удаляли из культуральных флаконов и промывали клетки охлажденным на льду буфером PBS. К клеткам немедленно добавляли модифицированный M-PER, 400 мкл на 25 см² поверхности культуры и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин осторожно покачивая.. Клеточный лизат собирали в пробирку и продолжали инкубацию на льду в течение 5-10 мин. Остатки клеточных стенок и органелл осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин. Супернатант собирали и хранили при -70С в течение 1 месяца. Концентрацию белка в клеточном экстракте измеряли с помощью бицинхониновой кислоты, используя набор ВСА protein assay kit (Pierce).

3.4.2 Аналитический электрофорез белков в присутствии SDS

(Laemmli, 1970)

Пробы для электрофореза белков содержали клеточный экстракт (10 - 30 мкг белка), разведенный на буфере, содержащем 2% SDS, 10% глицерол, 5% 2-меркаптоэтанол, 0.001% бромфеноловый синий, 25 мМ Трис НС1, рН 6.8 в соотношении 1:1. Перед нанесением на гель пробы инкубировали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Концентрирующий гель содержал 5% акриламид (акриламид:бисакриламид = 37.5:1), 0.125 М Трис-HCl (рН 6.8), 0.1% SDS, 0.1% персульфата аммония и 0.08% TEMED. Разделяющий гель содержал 5 — 12% акриламид (акриламид:бисакриламид = 29:1), 375 мМ Трис-HCl (рЫ 8.8), 0.1% SDS, 0.1% персульфата аммония и 0.08% TEMED. Концентрирование проб в геле проводили при напряженности поля 10 В/см. Разделение проб в геле проводили при

напряженности поля 12 В/см. Электродный буфер (рН 8.3), содержал 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 0.1 % SDS. Все растворы готовили на воде качества mQ. В качестве белков - стандартов молекулярных масс использовали набор белков с широкого спектра молекулярных масс (от 8.6 до 205 кДа) (BioRad, США).

Основные положения, выносимые на защиту

Ядерный рецептор витамина Д (VDR) принадлежит суперсемейству ядерных рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов (NR). VDR человека - это 48 кДа фосфопротеин, обладающий характерной для белков суперсемейства NR модульной организацией (Vegeto, 1993). В геноме человека VDR кодируется единственным геном в составе 12 хромосомы и, в отличие от других NR, представлен единственной изоформой (Szpirer, 1991). Несмотря на то, что при транскрипции образуется несколько вариантов мРНК VDR, различающихся по последовательности 5 -конца, все они транслируются в один и тот же белок, состоящий из 427 аминокислотных остатков (Miyamoto, 1997).

Ядерная локализация

В молекуле VDR выделяют несколько функциональных доменов. Домен А/В большинства ядерных рецепторов несет мотив,- выполняющий функцию автономной активации транскрипции, так называемую Функцию активации-1 (AF-1). А/В-домен VDR (1-20 а.к.) укорочен по сравнению с другими NR и, по-видимому, не функционален, т.к. удаление этого домена не отражается на функционировании VDR (Pike, Shevde, 2005). Домен С или ДНК-связывающий домен (DBD) NR представлен высококонсервативной последовательностью «и содержит два цинковых пальца типа С2-С2 (Berg, 1989): DBD VDR связывается с так называемыми витамин Д-чувствительными«последовательностями (VDRE) в большой бороздке ДНК. Также он участвует в димеризации; рецептора и блокирует связывание с неправильно расположенными полусайтами VDRE (Umesonon Evans, 1989). Предполагается,, что С-домен VDR (21 - 92 а.к.) важен также для накопления-VDR в ядре (Luo, 1994). Вариабельный- домен D представляет собой очень гибкий линкерный- участок, состоящий из протяженной спирали, которая связывает ДНК-связывающий и лиганд-связывающий участки, и обеспечивает пластичность структуры рецептора (McDonnell, 1989; Shaffer,. 2005). Домен E/F умеренно вариабелен по последовательности, но высококонсервативен по третичной структуре. Он содержит лиганд-связывающий домен (LBD), состоящий из 12 а-спиралей и Р-поворота, собранных в антипараллельный сэндвич (McDonnell, 1989). На С-конце домена-находится участок под названием Функция- трансактивации-2 (AF-2), представленный короткой амфипатической а-спиралью. Этот участок молекулы рецептора служит платформой для многочисленных кофакторов, необходимых для проявления активности рецептора (MacDonald, 1995; Jin и Pike, 1996), а также участвует в димеризации с рецептором цис-ретиноевой кислоты (RXR). Уникальной особенностью молекулы VDR, по сравнению с другими NR; является обширная вставка между доменами.D и E/F, которая кодируется-отдельным экзоном. Роль этого участка в функционировании.VDR не ясна и его относят иногда к D-домену (Pike, Shevde, 2005), а иногда к E/F-домену (Shaffer, 2005). Описано множество аллельных вариантов гена VDR человека, значительно различающихся среди рас и этнических групп (Morrison, 1994; Koshiyama, 1995; Nelson, 2000; Ojwang, 2001; Uitterlinden, 2004a). Выявлена взаимосвязь аллельных вариантов гена VDR с такими фенотипическими проявлениями как пониженная плотность костей (Eisman, 1999), гиперпаратироидизм (Carling, 1995), устойчивость к действию витамина Д (Kontula, 1997), а также восприимчивость к инфекциям; аутоиммунным заболеваниям и раку (Uitterlinden, 20046). Также был охарактеризован ряд функциональных полиморфизмов VDR, влияющих на стабильность его мРНК и эффективность трансактивации (Morrison, 1994).

Кальцитриол связывается с VDR с высоким сродством (Kd=10"10 - 10"ИМ) (Mellon, Deluca, 1979). Критическое значение для связывания с VDR имеют ОН-группы в молекуле кальцитриола (Okano, 1998), поэтому кальцидиол и 24,250H2D3 связываются с VDR гораздо слабее, чем кальцитриол (Mellon, Deluca, 1979). На основании данных кристаллографических исследований (Rochel, 2000) было показано, что в зависимости от связывания лиганда лигапд-связывающий домен VDR может принимать три различные конформации: apoVDR, holoVDR с агонистом, holoVDR с антагонистом (Moras и Gronemeyer, 1998; Nayeri и Carlberg, 1997). При этом основные коиформационные перестройки связаны с положением спирали AF-2 (Norman, 1999; Vaisanen, 2002). При связывании лиганда спираль AF-2 закрывает LBD и запирает агонист в лиганд-связывающем кармане (Swamy, 2000). Эта перестройка сопровождается изменением положения спиралей 3, 6, 11 и 12, приводящим к освобождению корепрессоров и рекрутированию коактиваторов (Herdick и Carlberg, 2000; Murayama, 2004; Hashimoto и Miyachi, 2005). Этап активации необходим также для рекрутирования моторных белков, обеспечивающих, быструю транслокацию VDR из цитоплазмы в ядро вдоль микротрубочек (Barsony, МсКоу, 1992; Racz и Barsony, 1999). При связывании, антагониста AF-2 занимает неправильное положение, препятствующее связыванию коактиваторов, тем самым, блокируя функцию рецептора.

Связывание с лигандом индуцирует гиперфосфорилирование VDR по нескольким остаткам серина (рис. 2). Фосфорилирование в положении S208 осуществляет казеин киназа II (Jurutka, 1993), S51 - протеинкиназа С и S182 -протеинкиназа A (Hsieh, 1991). Фосфорилирование VDR по различным сайтам по-разному отражается на транскрипционной активности VDR и обеспечивает ее тонкую регуляцию. Поскольку активность протеинкиназ находится под контролем различных гормонов, цитокинов и факторов роста, включая сам кальцитриол, регуляция VDR через фосфорилирование служит точкой пересечения многочисленных сигнальных путей (обсуждается также в главе 2.3.2).

Молекулярные механизмы действия кальцитриола

В молекуле VDR выделяют несколько функциональных доменов. Домен А/В большинства ядерных рецепторов несет мотив,- выполняющий функцию автономной активации транскрипции, так называемую Функцию активации-1 (AF-1). А/В-домен VDR (1-20 а.к.) укорочен по сравнению с другими NR и, по-видимому, не функционален, т.к. удаление этого домена не отражается на функционировании VDR (Pike, Shevde, 2005). Домен С или ДНК-связывающий домен (DBD) NR представлен высококонсервативной последовательностью «и содержит два цинковых пальца типа С2-С2 (Berg, 1989): DBD VDR связывается с так называемыми витамин Д-чувствительными«последовательностями (VDRE) в большой бороздке ДНК. Также он участвует в димеризации; рецептора и блокирует связывание с неправильно расположенными полусайтами VDRE (Umesonon Evans, 1989). Предполагается,, что С-домен VDR (21 - 92 а.к.) важен также для накопления-VDR в ядре (Luo, 1994). Вариабельный- домен D представляет собой очень гибкий линкерный- участок, состоящий из протяженной спирали, которая связывает ДНК-связывающий и лиганд-связывающий участки, и обеспечивает пластичность структуры рецептора (McDonnell, 1989; Shaffer,. 2005). Домен E/F умеренно вариабелен по последовательности, но высококонсервативен по третичной структуре. Он содержит лиганд-связывающий домен (LBD), состоящий из 12 а-спиралей и Р-поворота, собранных в антипараллельный сэндвич (McDonnell, 1989). На С-конце домена-находится участок под названием Функция- трансактивации-2 (AF-2), представленный короткой амфипатической а-спиралью. Этот участок молекулы рецептора служит платформой для многочисленных кофакторов, необходимых для проявления активности рецептора (MacDonald, 1995; Jin и Pike, 1996), а также участвует в димеризации с рецептором цис-ретиноевой кислоты (RXR). Уникальной особенностью молекулы VDR, по сравнению с другими NR; является обширная вставка между доменами.D и E/F, которая кодируется-отдельным экзоном. Роль этого участка в функционировании.VDR не ясна и его относят иногда к D-домену (Pike, Shevde, 2005), а иногда к E/F-домену (Shaffer, 2005). Описано множество аллельных вариантов гена VDR человека, значительно различающихся среди рас и этнических групп (Morrison, 1994; Koshiyama, 1995; Nelson, 2000; Ojwang, 2001; Uitterlinden, 2004a). Выявлена взаимосвязь аллельных вариантов гена VDR с такими фенотипическими проявлениями как пониженная плотность костей (Eisman, 1999), гиперпаратироидизм (Carling, 1995), устойчивость к действию витамина Д (Kontula, 1997), а также восприимчивость к инфекциям; аутоиммунным заболеваниям и раку (Uitterlinden, 20046). Также был охарактеризован ряд функциональных полиморфизмов VDR, влияющих на стабильность его мРНК и эффективность трансактивации (Morrison, 1994).

Кальцитриол связывается с VDR с высоким сродством (Kd=10"10 - 10"ИМ) (Mellon, Deluca, 1979). Критическое значение для связывания с VDR имеют ОН-группы в молекуле кальцитриола (Okano, 1998), поэтому кальцидиол и 24,250H2D3 связываются с VDR гораздо слабее, чем кальцитриол (Mellon, Deluca, 1979). На основании данных кристаллографических исследований (Rochel, 2000) было показано, что в зависимости от связывания лиганда лигапд-связывающий домен VDR может принимать три различные конформации: apoVDR, holoVDR с агонистом, holoVDR с антагонистом (Moras и Gronemeyer, 1998; Nayeri и Carlberg, 1997). При этом основные коиформационные перестройки связаны с положением спирали AF-2 (Norman, 1999; Vaisanen, 2002). При связывании лиганда спираль AF-2 закрывает LBD и запирает агонист в лиганд-связывающем кармане (Swamy, 2000). Эта перестройка сопровождается изменением положения спиралей 3, 6, 11 и 12, приводящим к освобождению корепрессоров и рекрутированию коактиваторов (Herdick и Carlberg, 2000; Murayama, 2004; Hashimoto и Miyachi, 2005). Этап активации необходим также для рекрутирования моторных белков, обеспечивающих, быструю транслокацию VDR из цитоплазмы в ядро вдоль микротрубочек (Barsony, МсКоу, 1992; Racz и Barsony, 1999). При связывании, антагониста AF-2 занимает неправильное положение, препятствующее связыванию коактиваторов, тем самым, блокируя функцию рецептора.

Связывание с лигандом индуцирует гиперфосфорилирование VDR по нескольким остаткам серина (рис. 2). Фосфорилирование в положении S208 осуществляет казеин киназа II (Jurutka, 1993), S51 - протеинкиназа С и S182 -протеинкиназа A (Hsieh, 1991). Фосфорилирование VDR по различным сайтам по-разному отражается на транскрипционной активности VDR и обеспечивает ее тонкую регуляцию. Поскольку активность протеинкиназ находится под контролем различных гормонов, цитокинов и факторов роста, включая сам кальцитриол, регуляция VDR через фосфорилирование служит точкой пересечения многочисленных сигнальных путей (обсуждается также в главе 2.3.2).

Димер VDR-RXR распознает последовательности ДНК под названием витамин Д-чувствительные последовательности (VDRE) в регуляторных областях генов. Усредненный VDRE представляет собой прямой повтор двух гексамерных последовательностей A/GGG/TTCA, разделенных спейсером в 3 нуклеотида (DR3) (Noda, 1990). При взаимодействии с этой последовательностью гетеродимер VDR RXR ориентируется таким образом, что RXR занимает 5 -полусайт, a VDR — З полусайт (Jin и Pike, 1996). VDRE различаются по длине спейсера и направлению повторов. Помимо DR3 встречаются DR4 (прямой повтор, разделенный спенсером в 4 нуклеотида), DR6 (прямой повтор, разделенный спейсером в 6 нуклеотидов), ER6 (обращенный повтор, разделенный спейсером в 6 нуклеотидов) и некоторые другие. Как правило, в регуляторных областях генов-мишеней витамина Д присутствует несколько VDRE. Так, например, в регуляторных областях гена, кодирующего 24-гидроксилазу кальцитриола (CYP24), и гена циклина С выявлено по четыре VDRE (Vaisanen, 2005; Sinkkonen, 2005). В регуляторных областях генов, кодирующих белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста (IGFBP1, IGFBP3 и IGFBP5) выявлено по три VDRE (Matilainen, 2005) и не менее трех VDRE - в регуляторной области гена, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ р21 (Saramaki, 2006). По крайней мере, два VDRE присутствуют в регуляторной области гена, кодирующего эпителиальный кальциевый канал, ответственный за всасывание кальция в кишечнике (TRPV6) (Meyer, 2006). Показано, что каждый VDRE способен обеспечивать трансактивацию сам по себе, поэтому считается, что наличие множественных VDRE служит для увеличения эффективности и точности трансактивации. Степень индукции транскрипции кальцитриолом часто не превышает трех раз, поскольку большинство, генов-мишеней кальцитриола транскрибируется под контролем нескольких транскрипционных факторов. Среди редких исключений ген CYP24, уровень транскрипции которого под действием кальцитриола может увеличиваться в тысячи раз (Lou, 2005; Sinkkonen, 2005). Высочайшую эффективность трансактивации этого гена кальцитриолом связывают с двумя причинами. Во-первых, гетеродимер VDR-RXR является основным, регулятором транскрипции гена CYP24, кодирующего 24-гидроксилазу, которая катализирует ключевую стадию инактивации кальцитриола. Во-вторых, базальный уровень транскрипции этого гена очень низок по сравнению с другими генами-мишенями витамина Д (Dunlop, 2005), где уровень транскрипции поддерживается другими транскрипционными факторами.

Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Kueng, 1989)

Клетки высевали на 96-луночные планшеты в количестве 1500 клеток на лунку и инкубировали в течение 48 ч до полного прикрепления клеток к подложке. Культуральную среду заменяли средой, содержащей кальцитриол или другие действующие вещества, и инкубировали клетки в течение 4-6 дней, обновляя среду каждый второй день. На контрольных планшетах клетки выращивали в присутствии соответствующих концентраций растворителей. Каждый второй день клетки на одном из планшетов в эксперименте и в контроле фиксировали путем добавления глутаральдегида до к.к. 1.1%. Для освобождения от глутаральдегида планшеты трижды промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе в течение 2 ч. В лунки добавляли по 200 мкл 0.1% раствора кристаллического фиолетового и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре при энергичном покачивании. Планшеты промывали от остатков красителя и высушивали так же как и для освобождения от глутаральдегида. Для растворения связавшегося красителя в лунки добавляли по 100 мкл 10% уксусной кислоты и измеряли поглощение света при 590 нм на спектрофотометре Wallac Victor 1420 Multilabel counter (Wallac Oy, Финляндия). Поглощение света в контроле принимали за 1. Результат выражали как поглощение света при 590 нм пробами, полученными из клеток, обработанных действующими веществами, к поглощению в контроле. Данные получали по результатам двух-трех независимых экспериментов, в каждом из которых на одном планшете идентичные пробы анализировали в 12-ти лунках.

Клетки собирали трипсином и осаждали центрифугированием (150 g, 5 мин). В клеточную суспензию, приготовленную на культуральной среде, добавляли равный объем 0.4% трипанового синего. 10 мкл клеточной суспензии наносили под покровное стекло гемоцитометра (камеры Горяева) (Assistent, Германия). Количество живых клеток (не содержащих красителя) подсчитывали под микроскопом. Расчет проводили по результатам трех независимых экспериментов, в каждом из которых проводили троекратное измерение количества клеток в каждой пробе.

Поверхность лунок 96-луночных планшетов покрывали ламинином или коллагеном I (Sigma-Aldrich, США). Для этого в каждую лунку планшета добавляли 50 мкл 15 мкг/мл ламинина или 15 мкг/мл коллагена 1 и инкубировали планшет в течение 2 ч при 37С. Лунки промывали буфером PBS (1.7 мМ КН2РО4, 5.2 мМ ЫагНРСм, 150 мМ NaCl, рН 7.4), содержащим 0.1% БСА. Сайты неспецифичного связывания блокировали инкубацией в растворе 0.5% БСА в PBS при 37С в течение 30 мин. Лунки промывали PBS, содержащим 0.1 % БСА. Планшеты использовали сразу или хранили при 4С в течение недели.

Клетки LNCaP собирали трипсином и ресуспендировали в культуральной среде. Количество жизнеспособных клеток оценивали методом исключения трипанового синего, как описано в предыдущей главе. Суспензию клеток, разведенную до плотности 4x10s живых клеток/мл среды, высевали на планшеты (по 200 мкл суспензии на лунку), покрытые ламинином или коллагеном I, и инкубировали в течение 2 ч при 37С. Лунки осторожно промывали PBS и фиксировали клетки глутаральдегидом. Для оценки количества прикрепленных клеток применяли метод окраски кристаллическим фиолетовым как описано в главе 3.2.3.1.

Суммарную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя для клеток, прикрепленных к подложке. Из культуральных колб удаляли среду и немедленно добавляли реагент TRIzol из расчета 1 мл реагента на 25 см2 поверхности культуры. Колбы покачивали до полного отделения клеток от подложки. Суспензию клеток интенсивно пипетировали до исчезновения вязкости, переносили в пластиковые пробирки и оставляли при комнатной температуре на 5 мин для полной экстракции клеточной РНК. На этой стадии пробы замораживали и хранили при -70С в течение месяца или сразу продолжали дальнейшую очистку РНК. К пробам добавляли 0.2 объема (от обьема реактива TRIzol) хлороформа, пробы интенсивно встряхивали в течение 15 с и инкубировали 3 мин при комнатной температуре. Органическую (содержащую ДНК и белки) и водную (содержащую РНК) фазы расслаивали центрифугированием (4С, 12000 g, 15 мин). Верхнюю (водную, РНК-содержащую) фазу собирали, переносили в чистую пробирку и осаждали РНК инкубацией в присутствии 0.5 обьемов (от количества реагента TRIzol) изопропанола в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок РНК собирали центрифугированием (4С, 12000 g, 10 мин), промывали 75% этанолом с последующим центрифугированием при 7500 g, 4С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли с помощью автоматической пипетки, осадок РНК высушивали под тягой в течение 5-10 мин и растворяли в 25 мкл стерильной деионизованной воды, свободной от РНКаз (обработанной диэтиленпирокарбонатом (DEPC)). Для более полного растворения РНК пробы инкубировали при 55-60С в течение 10 мин. Концентрацию РНК определяли по поглощению при 260 нм, считая, что 1 оптическая единица соответствует поглощению 40 мкг/мл РНК. Степень очистки полученных препаратов РНК от белков определяли по соотношению показателей поглощения света при 260 нм и 280 нм, считая допустимым варьирование величины этого соотношения в диапазоне от 1.8 до 2.1. Растворенную РНК хранили при -70С в течение 1 месяца.

Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP

Проведенный в рамках представленного исследования скрининг генов, регулируемых активным метаболитом витамина Д, кальцитриолом, в гормон-зависимых клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP, выявил ряд новых потенциальных мишеней витамина Д. Среди генов, регулируемых кальцитриолом, впервые обнаружены гены таких ферментов метаболизма как синтаза жирных кислот (FAS), фосфорибозилглицинамид-формилтрансфераза (GART), стеароил-КоА-десатураза (SCD), гистидин-аммиак-лиаза (HAL), дофахром таутомераза, гены компонентов сигнальных систем цитокинов, таких как плацентарный трансформирующий фактор роста-Р (PTGF-P), р - рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRp), фактор некроза опухоли-а (TNF-а) и другие гены (Qiao, 2003; Nazarova, 2004; Golovko, 2005; Nazarova, 2005). В свете изучения феномена противоопухолевой активности витамина Д регуляция сигнальных путей факторов роста представляет особый интерес, поскольку служит вероятным механизмом подавления роста раковых клеток кальцитриолом. Данные скрининга о регуляции количества специфичных мРНК в клетке являются предварительными. Дальнейшее исследование проводилось с использованием более точных методов - обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени и иммуноблоттинга.

По результатам скрининга на микрочипах кДНК для дальнейшего исследования был выбран ген PTGF-p, количество мРНК которого в клетках LNCaP увеличивалось в 2.5 раза при инкубации клеток в присутствии 10 нМ кальцитриола в течение 24 ч. Фактор роста PTGF-P суперсемейства TGF-р, известен как фактор, стимулирующий апоптоз и дифференцировку, и подавляющий пролиферацию клеток различного происхождения, что указывает на его вероятное противоопухолевое действие. Ген PTGF-p клонирован (Lawton, 1997; Paralkar, 1998), но регуляция его экспрессии мало изучена. О регуляции экспрессии гена PTGF-P метаболитами витамина Д или их аналогами ранее не сообщалось. Однако известно, что синтез этого фактора роста индуцируют различные противоопухолевые вещества, применяемые в лечении рака предстательной железы, включая ретиноиды (Newman, 2003), геништейн (genistein) (Wilson, 2003) и нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs) (Baek, 20016; Bottone, 2002). Кроме того, показано, что ген PTGF-P является прямой мишенью для супрессора опухоли р53 (Li, 20006; Tan, 2000; Bottone, 2002). Биологическое значение PTGF-P в предстательной железе мало изучено. Индукция экспрессии гена этого фактора роста может представлять собой не известный ранее механизм противоопухолевого действия витамина Д при раке предстательной железы.

Результаты исследования методами количественной ОТ-ПЦР и иммуноблоттинга подтвердили индукцию экспрессии гена PTGF-P кальцитриолом и показали, что уровень экспрессии гена PTGF-P находится в прямой зависимости от концентрации и времени обработки клеток кальцитриолом (Nazarova, 2004; Назарова, 2008). При более подробном исследовании механизмов действия кальцитриола на экспрессиию гена PTGF-p, показано, что кальцитриол не влияет на стабильность мРНК PTGF-P и регулирует транскрипцию этого гена независимо от синтеза белка. Полученные данные, в совокупности с достаточно ранним характером индукции, позволяют говорить о том, что действие кальцитриола, в данном случае, осуществляется на уровне транскрипции. В перспективе представляется интересным исследование действия кальцитриола на транскрипцию генов-репортеров, іранскрибирующихся под контролем регуляторной области гена PTGF-P in vitro, а также поиск витамин Д-чувствительных последовательностей ДНК (VDRE) в регуляторной области этого гена.

На основании данных литературы о том, что супрессор опухоли р53 является прямым индуктором транскрипции гена PTGF-p, а кальцитриол индуцирует активность р53 в клетках LNCaP, было выдвинуто предположение о том, что кальцитриол активирует транскрипцию гена PTGF-p не прямо, а через индукцию активности р53. В поддержку этого предположения послужили данные, полученные на клетках рака предстательной железы линии РС-3. В клетках РС-3, не содержащих р53 (p53-null), кальцитриол не индуцировал экспрессию гена PTGF-P (Nazarova, 2004), несмотря на то, что клетки этой линии восприимчивы к его антипролиферативному действию, хотя и в меньшей степени, чем клетки линии LNCaP. Для того, чтобы заблокировать действие р53 в клетках LNCaP был взят химический селективный низкомолекулярный ингибитор р53, пифитрин-а. Из данных литературы известно, что пифитрин-а связывается с молекулой р53 и ингибирует его геномное действие (Komarov, 1999; Jiang, 2004; Mohapatra, 2005). Как и ожидалось, в присутствии пифитрина-а кальцитриол не вызывал существенного повышения содержания мРНК PTGF-P в клетках LNCaP (по сравнению с клетками, инкубированными в присутствии пифитрина-а без кальцитриола) (Nazarova, 2004). Однако пифитрин-а сам по себе вызывал значительное повышение содержания мРНК PTGF-P, что затрудняет трактовку этих данных. Вскоре после публикации результатов нашего исследования по индукции экспрессии гена PTGF-P кальцитриолом в клетках LNCaP, Ламберт и коллеги опубликовали результаты исследования, в котором ясно демонстрируют, что индукция транскрипции гена PTGF-P кальцитриолом в клетках девяти линий рака предстательной железы человека, включая LNCaP, зависит от наличия функционального р53 (Lambert, 2006). Они также продемонстрировали, что трансфекция плазмиды, экспрессирующей р53, в клетках рака предстательной железы линии ALVA-31 (p53-null), обеспечивает способность VDR индуцировать транскрипцию гена PTGF-P, и напротив, трансфекция клеток LNCaP плазмидой, экспрессирующей доминантно-негативный р53, устраняет способность VDR индуцировать транскрипцию этого гена. Выявление механизма повышения содержания мРНК PTGF-P под действием пифитрина-а в клетках требует дополнительного исследования. Из данных литературы известно, что в некоторых случях, пифитрин-а, может, например, усиливать действие р53 (Kaji, 2003).

Похожие диссертации на Регуляция экспрессии генов плацентарного трансформирующего фактора роста-Z и Z-рецептора тромбоцитарного фактора роста кальцитриолом в клетках LNCaP рака предстательной железы

Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы Гюлиханданова Наталия Евгеньевна

Регуляция экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы человекаМостович, Людмила Андреевна

Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфаМогиленко, Денис Александрович

Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора ростаГорин, Андрей Олегович

Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птицПолешко Андрей Сергеевич

Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвичаМаланин, Сергей Юрьевич

Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L.Селиванова, Наталия Владимировна

Сигнальная регуляция экспрессии генов защитных белков растений при холодовом стрессеГималов Фуат Рамазанович

Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышейМихайлова Ольга Николаевна

Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменяПогульская Елена Николаевна