Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы Гюлиханданова Наталия Евгеньевна

Содержание к диссертации

ЧАСТЬ 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3;1. Содержание ЦП и меди в молоке человека и крыс в течение 65

лактации
3.1.1: Изменение концентрации ЦП и ионов меди в грудном 65

молоке в первые дни лактации

1. Содержание несвязанных с ЦП ионов меди в грудном 66 молоке

2. Содержание ЦП и связанной с ним меди в молоке 69 лабораторных крыс

3. Изменение активности гена ЦП у новорожденных крыс, 71 вскармливаемых молочными смесями

3-2. Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в. 76

клетках молочной железы на разных стадиях ее развития

1. Содержание мРНК-транскриптов генов ЦП, Ctrl, АТФазы 76 Менкеса и АТФазы Вильсона в молочной железе в разные периоды развития

2. Содержание иммунореактивных белков ЦП, АТФаз 79 Вильсона и Менкеса во фракциях плазматических мембран; молочной железы крысы во время беременности и лактации

3. Сопоставление уровня ЦП-мРНК hCTRI-mPHK в клетках 81 молочной железы с концентрацией ЦП и меди в молоке

4. Исследование экспрессии генов метаболизма меди на 82 культивируемых клетках молочной железы

3.3. Выявление потенциальных регуляторных 87

последовательностей в гене ЦП крысы и человека

5. Поиск г/мс-элементов в 5'-регионе гена ЦП 90

6. Экспериментальный анализ 5'-региона гена ЦП крысы 95 3.3.3; Поиск потенциальных сайтов регуляции активности гена ЦП 97

крысы во внутригенной области хромосомного гена
3.3.4 Анализ 5'-региона гена ЦП человека 108

3.3.5. Сопоставление содержания ЦП в молоке с выявленными при 113
анализе ПЦР-продуктов изменениями в структуре
промоторного: участка гена ЦП

ВЫВОДЫ 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Введение к работе

Актуальность исследования. Для полного развития

интеллектуальных качеств, каждого- индивидуума необходимы, различные условия, среди которых важнейшее место занимает сбалансированное питание. Медь входит в-группу микроэлементов и является^обязательным: компонентом пищи, так как является частью активных центров купроэнзимов, участвующих в жизненно важных процессах (Karlin, 1993; Репа et ah, 1999): Одновременно, ионы меди- могут индуцировать образование гидроксильных радикалов, которые повреждают, все типы биомолекул (hinder, 2001). Безопасный: круговорот меди в клетках обеспечивает система белков; (метаболическая система меди, МСМ), некоторые гены которой клонированы (Huffman& О 'Halloran, 2001)і При этом в клетке ионьь меди всегда остаются координационно-связанными (Rae et al, 1999). Свободных ионов- меди нет и в межклеточных пространствах. У млекопитающих почти 95% неклеточной меди связано с церулоплазмином (ЦП),. полифункциональным; медьсодержащим гликопротеином позвоночных,. который;, в частности, переносит ионы меди к клеткам негепатоцитарных рядов (Under et al, 1998). Получены бесспорные доказательства, что экологическое и врожденное нарушение баланса меди оказывает негативное плейотропное действие на весь организм и является причиной многих заболеваний ЛЩ.С (Prohaska, 2000; Lee et al, 2001; HamzaetaL, 2001; Qian et al, 199 7; Rao et al, 2002; Miyajima, 2003).

У млекопитающих оптимальный уровень ионов меди для тканей: эмбрионов и новорожденных обеспечивает МЄМ' самок с помощью внеклеточных переносчиков меди. На: это указывает то, что ее экспериментальный дефицит в диете беременных самок или генетические дефекты МСМ матери неизбежно ведут к развитию у плодов и новорожденных фатальных, симптомов медьзависимых микроэлементозов (Prohaska&Bailey, 1994; Shavlovski et al, 1995; Lee et al, 2001; Hamza et.al,

2001). Нарушение баланса меди в период молочного вскармливания приводит к развитию: различных заболеваний (Mason, 1979; Muller&Muller, 1998; Coronado et al., 2001). Эти факты указывают на существование практически не изученного природного механизма, контролирующего уровень меди в диете новорожденных.

Известно, что в: клетках л актирующей молочной железы ионы меди включаются в синтезируемый ими церулоплазмин (ЦП), и сегрегируются в молоко (Пучкова и др., 1994; Jenkins&Hidiroglou, 1989; McArdle&Danks, 1991). Показано, что in vitro ионы меди, ассоциированные с ЦП крови; лучше усваиваются тканями эмбриона, чем ионы меди неорганических солей или комплекса с гистидином (Wooten et al:, 1996). У новорожденных крыс при эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного тракта переносится в кровоток без модификаций (Мокшина, 1998). Показано, что в первый месяц, лактации, когда> объем потребляемого молока растет прогрессивно, содержание ЦП в нем снижается (Kiyosawa etal., 1995; Wooten, et al., 1996; Пучкова и др., 1997а). Можно думать, что контроль, над содержанием; меди в пище новорожденных в; первые дни жизни осуществляется путем¹ регуляции активности гена ЦП: в клетках молочной железы {Пучкова др., 1997а). От признания ЦП грудного молока как важного высоко специфического источника пищевой меди, к которому адаптирован метаболизм новорожденных и с которым, возможно, связано оптимальное развитие индивидуума, зависит стратегия вскармливания новорожденных, так как вскармливание молочными смесями, содержащими,свободные ионы м ед и {Пучкова и др., 199 7а; Lonnerdal, 1998), может влиять на оптимальное развитие индивидуума.

Цель исследования состояла в изучении экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы в разные периоды ее развития.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Измерить содержание ЦП и ассоциированных с ним ионов меди в молоке разных сроков лактации у лабораторных крыс и человека.

2. In vivo и in vitro в клетках молочной железы методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа определить относительное содержание ЦП-мРНК для секреторной формы ЦП и ЦП; связанного с плазматической мембранной. через гликозилфосфатидилинозитоловый я корь (GPI-ЦП); Методом высокочувствительного иммуноблоттинга проверить экспрессию гена, ЦП на уровне образования белковых продуктов. Параллельно изучить экспрессию генов, участвующих в метаболическом: включении ионов меди в растворимый ЦП (АТФаза Вильсона, АТР7В) и GPI-ЦП, (АТФаза Менкеса, АТР7А), а также гена Ctrl, высоко аффинного импортера меди.

У.. G помощью компьютерных методов; сравнить промоторные участки гена ЦП крысы и человека и выявить в них последовательности (цис-элементы) для связывания - с транскрипционными факторами (ТФ), которые потенциально могут участвовать в регуляции экспрессии гена ЦП.

4. Осуществить экспериментальную проверку биологической роли некоторых выявленных г/нс-элементов в регуляции активности гена ЦТТ в, клетках молочной железы.

5. Сопоставить уровень изменения активности гена ЦП в клетках молочной железы человека с вариабельностью промоторной области гена ЦП

Научная новизна полученных результатов.

В работе показано, что в первые дни лактации ЦП молока является основным' источником меди для новорожденных. Замена ЦП свободными ионами меди в диете новорожденных крыс вызывает в печени преждевременную смену эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип.

Установлено, что между беременностью и лактацией в клетках молочной железы происходит смена: профиля экспрессии генов, участвующих в переносе меди: во время беременности экспрессируется АТР7А и GPI-ЦП; к началу периода лактации активируется ген АТР7В и индуцируется образование секреторной изоформы ЦП.

Сравнительный анализ промоторных областей гена ЦП крысы и человека выявил высокую степень гомологии исследуемых участков и сохранение числа, набора и взаимного расположения потенциальных сайтов связывания для специфических, в том числе гормон-зависимых и ткане специфических, транскрипционных факторов (ТФ). Выявлена возможная связь между уровнем экспрессии гена, ЦП в клетках молочной железы человека и нарушение сайта связывания растворимого ядерного рецептора эстрогенов и сайта связывания ТФ C-EBPbeta, расположенных соответственно в положении - 1966 п.н. и -2260 п.н. отточки начала транскрипции.

Научно-практическая значимость результатов исследования

Полученные данные, свидетельствующие о пищевой ценности ионов меди, связанных с ЦП, могут служить основой; при разработке состава молочньгх смесей, соответствующих по меди грудному молоку.

Изучение экспрессии ряда генов, продукты которых являются участниками метаболизма меди, на: целой ткани и индивидуальных культурах клеток, открывает возможность углубленного исследования механизмов поступления и распределения меди в молочной железе на всех этапах ее развития.

Данные об участии сайта связывания растворимого»ядерного рецептора: эстрогенов и сайта связывания транскрипционного фактора C-EBPbeta в регуляции активности гена ЦП, потенциально могут служить тестами для выявления риска повышенного содержания меди в грудном молоке:

Основные положения, выносимые на защиту

ЦП молока в период первых дней жизни является основным, регулируемым
на генетическом уровне, источником пищевых ионов меди для
новорожденных.

Преимущественной молекулярной формой ЦП в течение беременности
является GPI-ЦП, а в период лактации — секреторный ЦП. В течение
беременности перенос ионов меди в клетках молочной железы крысы
преимущественно осуществляют АТФаза Менкеса, во время лактации; -
АТФаза Вильсона;

і 5 -регуляторные области гена ЦП! крысы и; человека содержат практически одинаковые сайты связывания для ТФ. Эксперименты, базирующиеся на этих данных, выявили сайты гормон-зависимой тканеспецифической регуляции экспрессии гена ЦП.

Тканеспецнфическая регуляция экспрессии гена ЦП может осуществляться посредством регуляторных взаимодействий "внутренних" последовательностей природного гена со специфическими ТФ YY1.

Существует потенциальная связь между нарушением сайтов; связывания
рецептора эстрогена (-2260 п.н.) и транскрипционного фактора;C-EBPbeta и<
активностью гена ЦП в клетках молочной железы.

An роба ция резул ьтатов работы

Результаты были доложены в форме устных и стендовых сообщений наг Второй Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов, 8 декабря; 1997 г.; Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, 24-26 апреля 1998 г.; II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000; 11-ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин, Германия, 22-24 ноября, 2000 г.; 10-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Вена, Австрия, 15-19 мая 2001 г.; III Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г; 6-ой

Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века, Пущино, 20-24 мая 2002 г.; Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г.

Работа поддержана грантами РФФИ № 98-04-49846, № 03-04-48748, ФЦП «Интеграция» И0064, АО 137, "Университеты России» 991149, грантом РФФИ MAC № 02-04-07612, персональными грантами для студентов, аспирантов и молодых ученых Администрации Санкт-Петербурга 1998, 1999, 2001 гг.

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В 1948 году шведские ученые Холмберг и Лоурелл выделили из сыворотки крови человека, голубой, белок, обладающий оксидазной активностью по отношению к ароматическим диаминам и катехоламинам. Он; был назван церулоплазмином (ЦП), что буквально означает «голубая субстанция ^ плазмы». Этот голубой белок стал предметом исследований, направленных на изучение его функций и;молекулярной структуры, а:также : физических свойств связанных с ним ионов меди. Число выявленных функций^; этого белка постоянно увеличивалось: роль в транспорте меди, гомеостазе железа, метаболизме: биогенных аминов, в реакции' на оксидативный стресс. В 1952 г. было обнаружено снижение концентрации ЦП; при і болезни Вильсона. Было обнаружено, что содержание: ЦП* изменяется при некоторых заболеваниях, а наследственное отсутствие ЦП, ацерулоплазминемия, ведет к нарушению метаболизма железа. Оказалось, что с этим- заболеванием близко ассоциированы; сахарный: диабет, дегенерация сетчатки и нейродегенерация. Однако биологическая роль ЦП до сих пор полностью не выяснена.

1Л. Структура мол екул ы ЦП

Церулоплазмин (ЦП, феррогОг-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1) - это гликопротеин аг-глобулиновой фракции плазмы крови позвоночных, который содержит до 95 % всей неклеточной меди (Holmberg, 1944; Holmberg&Laurell, 1948; Cousin, 1985). Полная аминокислотная последовательность ЦП человека определена и подтверждена клонированием кДНК ЦП (Takahashi et al., 1984; Koschinsky et ah, 1986). Поданным клонирования установлены структуры ЦП, принадлежащих различным классам позвоночных (база данных GeneBank). Анализ структур этих ЦП обнаруживает их высокую консервативность. Так, ЦП млекопитающих почти идентичны (гомология составляет почти 90%) (Olivares& Uauy, 1996). ЦП всех позвоночных состоят

из единственной полипептидной цепи, длина которой колеблется от 1046 (Homo sapience) до 1087 (Danio rario) аминокислотных остатков (а. о.). Количество углеводных цепей, структурно-функциональная организация и спектрофотометрические характеристики активных центров этого белка у ЦП разных видов идентичны с ЦП человека, который изучен наиболее полно.

Зрелая молекула ЦП человека содержит 1046 аминокислотных остатков и 3 N-связанные ол иго сахар идные цепи. Общая молекулярная масса ЦП составляет 132 кДа. Этот белок состоит из единственной полипептидной цепи, в которой выделяют 3 гомологичные единицы по —350 аминокислотных остатков каждая (Koschinsky et ah, 1986). Пространственная организация молекулы ЦП крови < человека была установлена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 0.32 нм (Рис. 1.1) (Zaitsevaet at, 1996). Выяснилось, что структура ЦП намного сложнее, чем типичная трехдоменная структура других мультимедных ферроксидаз.

Молекула ЦП состоит из шести компактных доменов и содержит 6 атомов меди, которые образуют активные центры, обусловливающие его ферментативные свойства (Ryden, 1972; Васильев и др. 1979; Takahashi et ah, 1984, Zaitseva et aL, 1996). Атомы меди в активных центрах ЦП представлены тремя типами, отличающимися Друг от друга по спектральным характеристикам (Messerschmidt&Huber, 1990): тип I - интенсивно голубой, обнаруживаемый электронно-парамагнитным; резонансом (ЭПР), тип II -неголубой, обнаруживаемый ЭПР, и тип III - неголубой, не обнаруживаемый ЭПР. Эти атомы, хотя ив разной степени, но прочно связаны с молекулой ЦП и не удаляются из нее твердым хелатирующим агентом Хелекс-100.

Рис. 1.1. Доменная организация молекулы ЦП и положение атомов меди в глобуле ЦП на основе рентгеноструктурного анализа (Zaitseva et al., 1996). Атомы меди типа I, расположенные в доменах 2, 4 и 6, образуют мононуклеарные центры, атом меди типа II и атомы меди типа III на границе доменов 1 и 6 образуют тринуклеарный центр.

Три атома меди типа I в доменах 2, 4, 6 создают три мононуклеарных центра. Другие три атома образуют единственный тринуклеарный кластер, в состав которого входит один ион меди типа II и два атома меди типа III. Тринуклеарный центр образован доменами 1 и 6 (Zaitseva et al., 1996). (Рис. 1.1). Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что помимо 6-ти атомов меди, входящих в 3 активных центрах, с остатком His домена 3 зрелой молекулы ЦП связан лабильный 7-ой атом меди (Mukhopadyay et al, 1997). Еще два лабильных атома меди связаны с доменами 4 и 6 (Zaitseva et al, 1996). Эти три атома меди удаляются из молекулы ЦП при обработке Хелексом-100, что свидетельствует об их расположении на поверхности глобулы ЦП. Возможно, именно они передаются от ЦП во внепеченочные клетки.

1.2. Структура и экспрессия гена ЦП

Природный ген ЦП имеет длину около 50 т.п.н. и содержит 19 экзонов длиной от 107 до 263 п.н. и 18 интронов от 0.44 до 10.0 т.п.н. (Рис. 1.2.) (Daimon et ah, 1995). В гаплоидном наборе человека и крысы (Fleming&Gitlin, J990) обнаружена единственная копия гена ЦП. Методами гибридизации соматических клеток и гибридизации in situ хромосом с ЦП-кДНК зондом (Yang et at, 1986) показано, что ген ЦП человека локализован на хромосоме 3q25 и сцеплен с геном трансферрина.

В геноме человека обнаружен также псевдоген ЦП, возникший в результате встраивания в хромосому 8 в районе q21.13-23.1 ДНК-транс крипта ЦП-мРНК с З'-конца до 563-го аминокислотного остатка (Wang, 1988).

Met"¹⁹ Lys¹

COOH

Уа1^Ш фШ50

A'

B'

A"

B"

50 AA
і 1

J і

І1696 1502 '1713

;ii08

1037, 1208

616
_H 7S1

\ \

\ V

_f\

їм iduo i?u^ ;i

I I I t

I ! ) і

j і < і і j і і

I J і

_Ы-н\

і \ I

218S 2235

і 2719

! 3210

Itga

2662, 2S7S 3194/>345(

і, і і—і ^l

_t-I-HH

Екоп t

Рисі.2. Доменная структура молекулы ЦП и экзон/интронная структура хромосомного гена ЦП человека (Daimon et al 1995).

В верхней части - линейное расположение доменов в молекуле ЦП. Показаны гомологичные домены двух разных видов (А и В). В средней части - структура кДНК. Показаны экзоны, кодирующие границы доменов. Затененная область -нетранслируемый 3 '-регион гена. В нижней части- структура гена ЦП

Установлено, что в полирибосомах клеток, синтезирующих ЦП (печень, мозг, матка, плацента и другие), присутствует ЦП-мРНК, состоящая из 3.4^3.7 т.н. (Yang etal, 1986). Молекула ЦП-мРНК транслируется одновременно примерно 16-20 рибосомами, транзитное время синтеза; полной полипептидной цепи* составляет около 3.5 мин. Еще одна молекулярная^ форма ЦП-мРНК, имеющая длину 4.5 т.н., обнаружена в лимфоцитах и* гепатоцитах взрослой печени, в раковых клетках иммунной системы, матки и печени. (Yang et al, 1990). Показано> также; что из; первичного продукта транскрипции гена ЦП в результате альтернативного сплайсинга могут образоваться две формы ЦП-мРНК. к ДНК одной из этих форм кодирует ЦПі крови, а другая содержит дополнительно 12 нуклеотидов, находящихся внутри интрона на 3'-конце гена и кодирующих 4 аминокислоты.Gly-Glu-Try-Pro вблизи С-конца молекулы ЦП (Yang et al., 1990). Эта форма ЦП-мРНК присутствует, наряду с основной формой, в плаценте и хондроцитах человека' и преобладает в лимфоидных клетках различных линий.

1.3. Биосинтез ЦП, встраивание меди; и посттрансляционные модификации

Си нтез!. ЦП крови про исходит в гепатоцитах. Также ЦП синтезируют клетки некоторых других неклеточных полостных жидкостей. Первичный продукт трансляции ЦП-мРНК человека и крысы на N-конце содержит сигнальную последовательность из 19 аминокислотных остатков (Yang et al;, 1990; Fleming&Gitlin, 1990)і которая- отщепляется = котрансляционно после проникновения насцентного полипептида в межмембранное пространство шероховатого ретикулума. После отщепления сигнального пептида происходит котрансляционное коровое N-гликозилирование молекулы ПГР в мембранах шероховатого ретикулума (Puchkova et ah, 1984).

ЦП имеет две двухантенные и одну трехантенную олигосахаридные цепи, присоединенные к белку через аспарагиновые остатки: N119, N339 и

N378. В зрелой молекуле ЦП углеводные цепи содержат остатки сиаловых кислот. Суммарная доля олигосахаридной части составляет —12%.

Медь встраивается в молекулу ЦП метаболически в мембранах шероховатого ретикулума и выполняет важную роль в пространственной организации молекулы ЦП (Sato&Gitlin, 1991). Точный механизм встраивания меди в насцентный белок неизвестен; Было обнаружено, что превращение апо-формы ЦП в холо-форму происходит перед секрецией и даже сильные хелатирующие агенты не удаляют полностью м едь из зрелой мол екулы ЦП. Это указывает на то, что сывороточ ный ЦП си нтезируется в гепатоцитах и секретируется в кровь как холо-белок, с шестью встроенными в процессе биосинтеза атомами меди (ВЫН& Calabrese, 2002).

Характерной особенностью ЦП является способность к спонтанному специфическому протеолизу, в результате которого глобула, передвигающаяся при нативном электрофорезе как гомогенная зона, при электрофорезе в денатурирующих условиях распределяется как набор фрагментов с молекулярной массой 110, 90, 80, 65, 48, 24 и 19 Kjfy(Calabrese&Muski, 1977; Ryan et al., 1992). Все фрагменты ЦП человека и; крысы выявляются при иммуноблоттинге с моновалентными поликлональными антителами. Природа этого явления; не известна. Предполагают, что оно связано с доменной структурой ЦП. Неустойчивость ЦП к действию протеаз явилась основным препятствием для установления его аминокислотной последовательности. Фактически аминокислотная последовательность ЦП человека: определена на основе последовательностей его «натуральных» фрагментов.

Способностью к спонтанной протеолитической деградации характеризуются ЦП всех видов, однако, ее степень у разных видов существенно отличается; Так, ЦП человека является наиболее чувствительным к спонтанному протеолизу, а ЦП дельфина - наиболее устойчивым (Ryan et ah, 1992).

1.4. Тканеспецифнческие молекулярные формы ЦП и ЦП-подобные белки

В настоящее время известно несколько самостоятельных тканеспецифических растворимых внеклеточных форм ЦП, которые синтезируются в клетках органов, создающих автономные полостные жидкости: ЦП крови, ЦП желчи, ЦП ликвора, ЦПамниотической жидкости и другие, а также несколько ЦП-подобных белков. Данные о свойствах изоформ ЦП приведены в таблице 1.1. Они показывают, что тканеспецифнческие растворимые ЦП отличаются друг от друга, а мембранные изоформы ЦП отличаются внутриклеточной локализацией. Наиболее подробно изучен ЦП крови (Takahashi et aL, 1984; Zaitseva et aL, 1996). Именно для него показаны ферроксидазная, антиоксидантная, оксидазная и прооксидантная активности ЦП-и именно он транспортирует медь к непеченочным клеткам.

У крысы и человека обнаружена единственная копия гена ЦП на гаплоидный набор {Fleming&Gitlin, 1990; Schwartsman et aL, 1980). В ходе альтернативного сплайсинга из; первичного продукта транскрипции этого гена образуются мРНК секреторной формы ЦП и мРНК изоформы ЦП, связанной с мембраной; через гликозилфо сфатидилинозитоловый якорь (Patel et aL, 2000). Помимо этого, в препаратах полирибосомношРНК из печени и: желточного^ мешка крысы методом Northern-блот гибриридизации идентифицирована РНК длиной примерно Г.8 т.н. (Пучкова и др., 2001). ЦП-мРНК такой же дл ин ы найдена в печени овцы (Lockhart&Mercer, 1999) ив желточном мешке крысы {Пучкова и др., 2001).. Кроме ЦП-мРНК длиной 3:7 т.н., в некоторых органах и опухолях крысы и человека обнаружена ЦП-мРНК длиной 4Л т.н., отличающаяся от 3.7-мРНК З'-нетранслируемой последовательностью.

Таким образом, количество идентифицированных самостоятельных молекулярных форм ЦП-мРНК гораздо меньше, чем известных изоформ ЦП.

К тому же не для всех идентифицированных ЦП-мРНК найдены соответствующие формы ЦП (например, ЦП-мРНК длиной 1.8 т.н.). Механизмы образования большинства молекулярных форм ЦП, как и их тканевая и онтогенетическая принадлежности остаются неизвестными.

Таблица 1.1.

ЦП и ЦП-подобные белки млекопитающих

L 4.1. Тканеспецифические молекулярные формы ЦП

Помимо ЦП крови, в печени синтезируется еще 2 молекулярные формы ЦП: ЦП-подобный-несекреторный растворимый белок цитозоля (Пучкова, Сасина и др, 1994), который, возможно, участвует в переносе ионов меди по < цитозолю к различным компартментам клетки, и ЦП желчи (Пучкова и др., 1993). На крысе с катетеризированными: желчным протоком; и сонной артерией в5 опытах с импульсным мечением [ SJ-метионином; было; продемонстрировано, что; в гепатоцитах синтезируется и секретируется в. желчь, самостоятельная молекулярная форма ЦП (Пучкова и др., 1993). Динамика секреции ЦП желчи полностью совпадает с динамикой выведения меди через желчь (Bremner, 1980). В дальнейшем был получен, высокоочищенныи препарат ЦП желчи.. Оказалось, что он, по физико-химическим, иммунологическим и энзим атическим свойствам сходен с ЦП-подобным белкомj циркулирующим в^ кровотоке- у больных болезнью Вшьсош (Verbina et al, .1992).

Эти данные позволили предположить, что медь из печени выводится в составе ЦП, синтез которого программируется специфической 4.5 т.н. ЦП-мРНК (Пучкова и др., 1999), обнаруживаемой в гепатоцитах только при взрослом; типе метаболизма меди; Таким образом, ЦП: желчи выполняет функцию транспорта меди, предназначенной для экскреции.

В клетках сосудистого сплетения мозга синтезируется другая * тканеспецифическая форма ЦП - ЦП; спинномозговой жидкости, участвующий в гомеостазе меди в мозгу (Klomp et al., 1996). В клетках мозга взрослых крыс обнаружено 2 молекулярные формы ЦПгтканеспецифический ЦП ли квора и мембрано связанная форма ЦП (Patel&David; 1997), которая будет описана в разделе 1.4.2:

У грызунов ЦП синтезируется в клетках желточного мешка в течение всего постим плантационного периода: и является источником меди для эмбриона (Баранов и др., 1986). Тканеспецифический ЦП синтезируют

клетки матки, молочной железы* и других органов (Janger et al, 1977; Захарова; 1985; Пучкова и др., 1994а). Показано, что ЦП, выделенный из женского молока, отличается от ЦП крови по составу углеводных цепей и чувствительности к ЭДТА. Препарат ЦП молока микрогетерогенен_; и устойчив к спонтанной протеолитической деградации (Мокшина, 1998).

По-видимому, все молекулярные формы растворимого внеклеточного ЦП являются продуктами одного гена. Однако, они отличаются по количеству атомов- меди, приходящихся на 1 молекулу, составу углеводных цепей, физико-химическим; энзиматическим и антигенным свойствам (Табл. 1.1).

1.4.2. Мембрапосвязтшые формы ЦП

Как было сказано ранее, в клетках мозга взрослых, крыс обнаружено 2 молекулярные- формы ЦП: тканеспецифическиш ЦП ликвора и мембраносвязанная форма ЦП^! (Patel&David, 1997). Последняя связана с клеточными мембранами и мембранами- аппарата Гольджи с помощью гликозилфосфатидилинозитолового (GPI) якоря. ЦП крови и GPI-ЦП отличаются между собой только наличием СР1-«якоря». Мембраносвязанный ЦП обладает оксидазной и ферроксидазной активностями, он обнаруживается на плазматической; мембране астроцитов и в і л ептоменингиальных клетках,. выстилающих по верхности желудочков мозга (Mittal et al, 2 003) и: является основной формой ЦП в ЦНС. Отсутствие GPI-ЦП в ЦНС может приводить к образованию высокотоксичных; свободньгх радикалов, которые; возможно, провоцируют нейроде генеративные нарушения, например, болезнь Паркинсона. GPI-ЦП обнаружен также в семенниках на поверхности: клеток Сертоли (Fortrta et al, 1999).

В клетках почек, сердца; мозга, плаценты, а также печени взрослых млекопитающих синтезируется внутриклеточный мембраносвязанный ЦП-подобный белок, активирующий освобождение железа из клеток (Гайцхоки и др., 1990; Reilly&Aust, 1998). Так как мутации в гене ЦП приводят к

накоплению железа в клетках, можно считать, что внутриклеточная мембранная ферроксидаза также является продуктом гена ЦП.

У млекопитающих обнаружено еще два мембранных ЦП-подобных белка. Это гефестин и. рецептор ЦП., Гефестин идентифицирован методом позиционного клонирования: в геномемыши и. человека (Vulpe et al.,. 1999; Frazer et al., 2001). Белок получил название по имени мифологического бога-кузнеца Гефеста за то, что на апикальной поверхности энтероцитов экстрацеллюлярно катализирует окисление ферро-иона в ферри-ион; способствуя всасыванию железа в безопасной форме из желудочно-кишечного тракта. Мутации в гене гефестина приводят к формированию железодефицитного фенотипа. Молекула: гефестина: состоит из одной полипептидной цепи, которую^ можно рассматривать как полноразмерную молекулу ЦП с «прикрепленной» к G-концу последовательностью, содержащей трансмембранный домен И' короткий цитозольный домен. «Церулоплазминовая» часть гефестина: сохраняет все лиганды. для связывания меди в активных центрах: и сайты гликозилирования. Ген гефестина и у мыши, и у человека картирован на Х-хромосоме. Структурная идентичность между ЦП и гефестином.у обоих видов составляет более 50%, а в «церулоплазминовой» части гефестин еще: больше похож на ЦП, медьсодержащие активные центры ЦП и гефестина практически идентичны. Сходны между собой также и гефестины мыши и человека:

Специфический мембранный рецептор ЦП впервые был обнаружен в 1984 п во фракции плазматических мембран, изолированных из клеток аорты и сердца эмбрионов кур, по высоко аффинному и насыщающему связыванию [¹²⁵1]-ЦП (Stevens etal., 1984). Затем он бьш найден в различных клетках негепатоцитарных рядов. Ген рецептора ЦП. не экспрессируется в энтероцитах и гепатоцитах-взрослой печени (Harris, 1991; Пучкова и др., 1999). Показано, что он связывает ЦП на клеточной поверхности, и это связывание, необходимо для попадания меди в цитоплазму. Освобождение

слабоассоциированных с молекулой ЦП ионов меди происходит экстрацеллюлярно. Оно сопряжено с транслокацией ионов меди через клеточную мембрану, подавляется батрокупреинсульфонатом и протекает эффективнее в присутствии аскорбата. Ионы меди попадают в цитоплазму, а пептидная часть молекулы ЦП обнаруживается во фракции мембранных пузырьков. В них ЦП подвергается десиалированию, затем освобождается в кровоток, откуда поглощается гепатоцитами, с помощью группоспецифического- рецептора асиалогликопротеинов (Tavassoli et at, 1986; Olivares&Uauy, 1996; Пучкова и dp:, 19976). После эндоцитоза молекула ЦП фрагментируется, но не расщепляется, и в виде глобулы экскретируется в желчь. Приведенные данные позволяют считать, что рецептор ЦП участвует в; транспорте ионов меди, слабоассоциированных с молекулой ЦП, в клетки и способствует выведению из организма ионов меди; которые даже при длительном диализе в присутствии цианистого калия не освобождаются из ЦП. Молекулярная масса рецептора ЦП человека по данным лигандно го с вязывания соответствует при мерно 130 кДа (Пучкова и др., 7P9Q), а крысы, по данным: гель-фильтрации, 150 кДа (Omoto, Tavassoli, 1990).. Молекула состоит из одной полипептидной: цепи, содержит — 3% разветвленных углеводных цепей и фрагментируется:в результате связывания с ЦП (Пучкова и др: 1991а; Harris KD, 1991).

Сравнение пептидных карт электрофоретически чистых препаратов ЦП и его рецептора выявило значительное структурное сходство, которое подтверждается v способностью антител к рецептору ЦП перекрестно взаимодействовать с ЦП (Пучкова и др., 1990).

Из экспрессионной библиотеки. кДНК плаценты человека в векторе Xgtll методом иммуно скрининга изолирован клон, несущий вставку фрагмента кДНК предполагаемого рецептора ЦП (Сасина и др. 2000). Анализ последовательности секвенированнои вставки показал, что рецептор ЦП содержит протяженный фрагмент практически идентичный ЦП и

сохраняющий лиганды ферроксидазного центра ЦП. На противоположенном конце клонированной, вставки установлена последовательность, которая транслируется в той же рамке считывания в аминокислотную последовательность, не имеющую гомологии ни с одной из последовательностей, содержащихся в базе данных. Участок включает мотив со свойствами трансмембранного домена и проявляет гомологию с С-концевым доменом гефестина мыши и крысы. Последовательности идентичные фрагментам: этого: участка рецептора ЦП найдены в геноме человека в области, прилегающей- к 3'-району, и в комплементарной нити в области- экзона 16 гена^: ЦП. Это позволяет допустить две возможности. Первая состоит в том, что мРНК, программирующая синтез рецептора ЦП, является продуктом транс-сплайсинга — участок идентичный ЦП происходит из транскрипта гена ЦП, а участок, содержащий трансмембранный: домен является продуктом транскрипции комплементарной нити гена ЦП. Вторая — допускает, что мРНК рецептора ЦП формируется в і результате альтернативного сплайсинга, при котором происходит замещение экзонов¹1б - 19 гена ЦП, кодирующих домен 6 ЦП, на выявленный регион в З'-области-{Vasin;etal, 2002).

1.5.Изменения тканеспецифической активности гена ЦП в онтогенезе

Данные, представленные в предыдущих разделах показывают, что существует тканеспецифическая регуляция активности гена ЦП: Известно также, что содержание ЦП и. меди в различных органах меняется в зависимости от периода онтогенеза; ЦП является, частью; большой: взаимосвязанной системы,, объединяющей белки,, которые способны связывать ионы; меди; и: специфическим образом «упаковывать» их и передавать друг другу — так называемой метаболической системы меди (МСМ). МСМ млекопитающих образована двумя полуавтономными типами систем: МСМ гепатоцитов и тканеспецифическими МСМ клеток

негепатоцитарных рядов. Особенностью последних является то, что источником ионов меди для них является ЦП, который синтезируется в клетках печени. МСМ включает несколько типов белков (Табл.. 1.2):

1) белки-переносчики, растворимые белки, транспортирующие медь по
гидрофильным компартментам организма и клеток;

2. белки-транспортеры, интегральные белки мембран (насосы и рецепторы), передающие медь через мембраны;

3. белки-регуляторы, факторы, контролирующие экспрессию генов МСМ.

Таблица 1.2.

Известные белки, пептиды и аминокислоты МСМ человека

Кроме белков, в МСМ входят пептид — глутатион, связывающий медь в цитозоле, и гистидин, образующий с медью комплекс Cu(His)2, который у млекопитающих транспортирует ионы меди от кишечника к печени (Harris, 1991). У млекопитающих клеточные МСМ включают медьтранспортные АТФазы Р1 типа, осуществляющие перенос Си¹⁺ через мембраны (АТФаза Менкеса, АТР7А, и АТФаза Вильсона, АТР7В), растворимые цитозольные

Cu-шапероны, доставляющие медь к месту образования медьпротеинов, и предположительно .транскрипционные факторы, регулирующие активность генов МСМ. \

В течение онтогенеза распределение меди по органам заметно изменяется. У млекопитающих, в том числе и у человека, в зависимости от периода развития различают два типа систем (Табл. 1.3), которые соответствуют эмбриональному и взрослому типам метаболизма меди (Hurley, 1980).

1.5.1. Эмбриональный тип метаболизма меди у млекопитающих

Эмбриональный тип МСМ сохраняется до конца молочного вскармливания. В этот период не происходит выведения меди через желчь. В течение эмбрионального развития медь накапливается в теле зародыша преимущественно в печени и в селезенке. У новорожденных концентрация меди в печени в 10 раз выше, чем у взрослых (Hurley et al, 1980; Пучкова и др., 19946).

Для эмбрионального типа метаболизма меди характерным является низкий уровень экспрессии гена ЦП в печени, незначительное содержание этого белка в кровотоке и накопление меди в печени из-за отсутствия механизма выведения его через желчь (Hurley et al., 1980).

В период эмбрионального и раннего постнатального развития источником меди для тканей организма является ЦП, синтезируемый, в зависимости от периода развития, соответственно клетками желточного¹ мешка, плаценты или молочной железы (Баранов и др., 1986; Aldred et al., 1987; Пучкова и др., 19946; Cerveza et al, 2000; Пучкова и др., 2001). Таким образом, источником меди для зародыша на всех этапах эмбрионального развития является ЦП, циркулирующий в организме матери (Schilsky et al, 1992; Mas&Sarkar, 1992; Shavlovski et al, 1995).

Таблица 1.3.

Распределение меди в организме млекопитающих при эмбриональном и взрослом типах метаболизма меди

На ранних этапах органогенеза, несмотря на поступление экзогенного ЦП, в клетках печени активируется ген ЦП^ экспрессия которого остается на относительно низком уровне вплоть до окончания: периода МОЛОЧНОГО; вскармливания (Баранов и др., 1986; Пучкова и др., 19946). Роль фетального ЦП при эмбриональном типе метаболизма меди остается не известной.

После поступления в организм экзогенно синтезированного ЦП, часть ионов меди,, связанных с ним, поглощается клетками печени (Cerveza et al.\. 2000) и не выводится через желчь, накапливаясь в ядрах и лизосомах клеток печени (Puchkova -. et aL, 2002). При этом из-за низкой акти вности гена ЦП содержание меди в крови в несколько раз ниже, чем у взрослых.

Интересно, что профиль распределения меди і в. организме в период
эмбрионального типа; метаболизма меди соответствует таковому у больных
гепатолентикулярной дегенерацией (ГЛД или болезнь Вильсона). Это
тяжелое аутосомно-рецессивное наследственное заболевание,

проявляющееся в нарушении экскреции меди через желчь (Owen, 1981). При болезни Вильсона повреждается ген АТФазы Вильсона (АТР7В),

контролирующий переключение метаболизма меди, характерного для плода, на метаболизм меди, специфичный для взрослого организма. Увеличение содержания ЦП в сыворотке крови при взрослении происходит вследствие повышения скорости транскрипции этого гена (Bingle etah, 1991). У больных болезнью Вильсона низкое содержание ЦП в сыворотке крови является > следствием нарушения экспрессии гена АТР7В, который- находится на хромосоме 13 (Frydtnan et ah, 1985). Сходство; болезни Вильсонаї с эмбриональным типом метаболизма меди объясняется тем, что при нем в печени экспрессируется ген АТР7А, а не ген АТР7В (см. ниже).

К концу молочного вскармливания происходит перераспределение меди в организме: содержание меди в: крови повышается одновременно с ее: снижением в печени (Keen&Hurley, 1979) и увеличивается в мозгу. При этом также формируется система выведения меди через желчь, то есть происходит смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый.тип.

1.5.2. Взрослый тип метаболизма меди

Переключение МСМ на взрослый тип происходит к концу лактационного периода и совпадает с началом синтеза в печени самостоятельной молекулярной формы ЦП — ЦП желчи, обеспечивающей экскрецию меди; через желчь (Пучкова и др., 1993; Пучкова и др., 19946; Цымбаленко и др., 1997). Одним из основных признаков- смены; типа метаболизма меди является повышение активности; гена ЦП в печени и резкое увеличение содержания ЦП и, соответственно, меди в крови. Смена типов метаболизма меди^ сопровождается также существенными изменениями- в; механизме адсорбции меди; в кишечнике. Так, на, изолированных фрагментах различных отделов желудочно-кишечного тракта с помощью радиоактивных. изотопов меди убедительно показано, что при эмбриональном типе свободные ионы меди беспрепятственно диффундируют через стенки. желудочно-кишечного тракта по всей его длине. Напротив, у

взрослых млекопитающих происходит строго регулируемое поглощение меди в тонком отделе желудочно-кишечного тракта (Crampton et ah, 1965). Это означает, что? эмбриональный^ тип- метаболизма меди не адаптирован к использованию свободных ионов меди в качестве компонента пищи.

Онтогенетические изменения происходят также в легких и мозге. В клетках легких крыс к концу эмбрионального развития уровень экспрессии гена ЦП в несколько раз превосходит таковой в эмбриональной = печени (Fleming&Gitlin,. 1990): После рождения активность гена ЦП в легких постепенно снижается: и примерно к 10 дню жизни полностью^ исчезает. Предполагают, что интенсивный синтез ЦП в легких как антиоксиданта является частью механизма, обеспечивающего переход на дыхание атмосферным кислородом;

Таким образом, уровень экспрессии генов, МСМ поддерживает гомеостазе меди в: разные периоды онтогенеза у млекопитающих. Приведенные литературные данные убедительно демонстрируют существование специфической регуляции активности генов МСМ:. Видно также, что уровень экспрессии гена ЦП отражает потребность клеток в ионах: меди и находится' в непосредственной- связи с активностью других генов МСМ; Механизм, регулирующий тканеспецифическую экспрессию генов; МСМ при различных типах ее метаболизма^ и механизм, ответственный за смену этих типов в онтогенезе, остаются неизвестными.

116. Роль ЦП молока как источника ионов меди для новорожденных

При генетических дефектах ком понентов МСМ нарушается вы веден ие или поступление ионов меди. Их дефицит или избыток может наступать и как следствие недостаточного или избыточного содержания в пищевом рационе (Авцын и Жаворонков, 1994; Lonnerdal, 1998), Дефицит меди в период эмбрионального развития и грудного вскармливания вызывает нарушение развития у зародышей и оказывает отдаленное влияние на деятельность ЦНС

(Shavlovski et ah, 1995; Prohaska, 2000). Избыток меди в пище новорожденных может привести к развитию смертельных заболеваний (Muller&Muller, 1998). Благодаря согласованному взаимодействию систем, поддерживающих гомеостаз меди матери и плода, экологическое влияние на баланс меди у эмбрионов сведено к минимуму и выявляется только в экспериментальных условиях (Shavlovski etaL, 1995; Prohaska, 2000), или при врожденных дефектах обмена меди (Muller& Muller„ 1998; Сох, 1995).

В естественных условиях^ новорожденных единственным источником ионов меди является молоко. Давно отмечено,.что ни внутривенное введение меди, ни увеличение содержания меди в диете матерей не влияют на ее количество в молоке (Mason, 1979). Известно, что концентрация- и распределение ионов меди во фракциях молока существенно отличаются у представителей разных семейств млекопитающих (Lonnerdal; 1998). Однако, у всех изученных; видов, кроме домашних кошек (Adkins et al, 1997), их: концентрация снижается в течение лактации и не зависит от концентрации меди в крови (Mason, 1979; Jenkins, Hidiroglou, 1989). Радиоактивные ионы меди, введенные в кровоток, поглощаются клетками лактирующей молочной железы и включаются в синтезируемый и секретируемыи ими і в молоко ЦП (McArdle&Danks, 1991; Пучкова и др., 1994а; Donley et al, 2002). Показано, что в клетках как дифференцирующейся (danger at al, 1991), так и лактирующей молочной железы (Пучкова и др., 1994а) присутствует ЦП-мРНК.

В работе японских исследователей впервые было* показано, что в молоке при созревании содержание ЦП снижается примерно в два раза ив переходном молоке составляет примерно 4-5 мг/100 мл (Kiyosawa- et al, 1995). Авторы, используя данные литературы (600-800 мкг Cu/л молока), пришли к заключению, что при содержании 6-8 атомов меди на 1 молекулу ЦП только треть ионов меди молока связана с ним. В другой работе (Wooten et al, 1996) было показано, что в; снятом грудном мол оке на третий день

после родов концентрация ЦП и меди¹ составляют 0.47+0.13 мг/100 мл и 600+241 мкг/л, соответственно. В течение первой недели после родов их концентрация не меняется, но оба показателя снижаются к концу первого месяца лактации примерно в два раза. По этим данным не более 10% ионов меди, содержащихся в молоке, связаны с ЦП^ и, следовательно, он не может являться основным источником пищевой меди для новорожденных. В наших предыдущих исследованиях было продемонстрировано (Пучкова и др., 19976), что через три дня после родов концентрация ЦП в снятом грудном молоке составляет 10.9+4.8 мг/100' мл и в течение первого месяца лактации онаснижается почти в 6 раз: Эти данные позволили нам предположить, что контроль над содержанием меди в пище новорожденных в первые дни жизни может осуществляться путем регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы (Пучкова и др., 1997а).

Существующие в литературе противоречия , мешают прийти к определенному заключению о роли ЦП молока. В то же время, от признания ЦП грудного молока как важного высоко специфического источника пищевой меди; к которому адаптирован метаболизм новорожденных w с которым, возможно, связано оптимальное развитие индивидуума, зависит стратегия вскармливания новорожденных. Это особенно важно в первые дни жизни, когда объем пищи прогрессивно увеличивается (ежедневно: (60 мл)-л, где п — день: жизни). Если новорожденные адаптированы к получению пищевых ионов меди в составе ЦП, нельзя исключить, что вскармливание молочными смесями, содержащими свободные ионы меди (Пучкова и др., 1997а; Lonnerdal; 1998), может влиять на оптимальное развитие индивидуума.

1.7. Церулоплазмин как многофункциональный белок

Выяснение биологических функций этого белка оказалось трудной задачей. ЦП— белок с большой молекулярной массой, представленный одной полипептидной цепью, но имеющий несколько изоформ и

характеризующийся сложной картиной распределения в тканях, а также многообразием кооперативных форм участия в метаболизме меди и железа в организме. Полифункциональность ЦП, внутримолекулярная гомология его молекулы и повышенная чувствительность к протеолитической обработке, по-видимому, отражают возникновение его гена путем трипликации предкового гена, кодировавшего медьсодержащую голубую оксидазу (Takahashi et ah, 1984).

Медыпранспортная функция

Известно, что радиоактивная медь, метаболически включенная в ЦП, эффективно переносится из: кровотока в клетки непеченочных органов; и включается в медьсодержащие ферменты (McArdle&Dcmks, 1991; Donley et ah, 2002). В настоящее время накопился обширный экспериментальный материал, полученный на целом организме, изолированных клетках, культивируемых клеточных линиях, фрагментах плазматической мембраны и препаратах чистых белков» показывающий, что в клетки непеченочных рядов ионы меди доставляются ЦП крови (Harris, 1991). Сначала пищевая медь из кишечника в комплексе с альбумином (Linder&Moor, 1977) и/или гистидином (Ettinger et ah, 1986) и/или транскупреином (Weiss&Linder, 1985) по кровотоку доставляется в печень.. Там часть, ионов встраивается в новосинтезированный ЦП и секретируется в кровоток, другая часть связывается с медьсодержащими ферментами или металл отионеи ном ив таком виде остается в гепатоцитах, а ее избыток выводится через желчь. Ионы меди, связанные с ЦП, поступают в клетки непеченочных органов (Cousin, 1985; Gitlin; 1988; Harris, 1991). Показано, что атомы меди типа 1 мононуклеарных активных центров, как и атом меди, связанный с His, являются лабильными и могут передаваться к медьсвязывающим центрам других белков (Musci et ah, 1999). Таким образом, ЦП может рассматриваться как медьтрансфераза.

Оксидазная функция

ЦП катализирует перенос 4-х е" от субстрата к молекуле Ог- ЦП'имеет несколько* оксидазных функций, при этом он может катализировать окисление как биогенных, так и абиогенных веществ. Ферроксидазная функция

In vitro ЦП специфически катализирует, реакцию окисления Fe⁺²—>Fe⁺³ в молекуле трансферрина и, таким образом, участвует в образовании гемоглобина (Frieden, 1980). На основании этой способности ЦП включен в: каталог ферментов^ как ферроксидаза (К.Ф. 1.16.3 Л)... В экспериментах на кристаллах ЦП было выяснено, что в сайтах связывания лабильных ионов меди в доменах 6 и 4 ЦП могут происходить структурные перестройки, которые приводят к появлению тривалентных металл-связывающих сайтов, подходящих для связывания Fe⁺³. В этих сайтах ионы железа ориентированы таким образом, что могут быть перенесены на трансферрин: Этот механизм позволяет либо активизировать экспорт железа, сопряженного с трансферрином, либо ингибировать его путем передачи ионов железа трансферрин-независимой системе выделения железа. Нарушения этих процессов при дисфункции или отсутствии ЦП и/или трансферрина могут приводить к избирательному накоплению или дефициту железа; в тканях и органах (Bielli&Calabrese, 2002). Прямые доказательства участия ЦП в метаболизме железа были получены при установлении наследственных мутаций в гене ЦП. Оказалось, что при различных мутациях, затрагивающих С-концевой участок ЦП (домен 6), развивается тяжелое аутосомно-рецессивное нарушение метаболизма железа — ацерулоплазминемия-(гемосидероз) (Harris Z.L. et al, 1995; Okamoto et ah, 1996). Заболевание характеризуется низким уровнем железа в крови, сопровождающимся его накоплением в мозге и паренхиматозных тканях вследствие нарушения окисления Fe⁺²->Fe⁺³. Это приводит к гибели клеток в базальных ганглиях мозга и сетчатке.

Кроме этого, на гомополимерах ферритина (белок, который запасает ионы железа в клетках) печени крысы показано, что ЦП in vitro участвует во включении ионов < железа в этот белок, при этом ЦП проявляет ферроксидазную активность (Juan et at, 1997; Reilly&Aust, 1998). Участие ЦП в метаболизме железа состоит в одновременном, обеспечении двунаправленного транспорта железа через мембраны и предотвращении участия ферро-ионов в образовании свободных радикалов. Аминооксидазная функция

Аминооксидазная функция ЦП заключается в окислении in vitro как абиогенных субстратов (например, пора-фенилендиамина, орто-дианизидина), так и некоторых биологически активных веществ (например, серотонина, норадреналина). В связи с этим ему приписывается прямое участие в регуляции деятельности. ЦНС. Вероятно, ЦП участвует в регулировании уровней биогенных аминов в крови путем ЦП-катализируемого окисления таких субстратов как катехоламиновые и 5-гидрокистриптами новые нейротрансмиттеры. Предполагается также, что ЦП in vitro окисляет 6-гидроксидопамин; нейротоксин, образующийся при болезни Паркннсона (Bielli&Calabrese, 2002). Субстрат-связывающие сайты с аминооксидазной активностью, специфичные для ароматических диаминов и биогенных аминов, располагаются в доменах 4 и 6 соответственно. В домене 1 ЦП локализован сайт для диэтиламид л изергиновой кислоты (ЛСД) (Zaitsev etah, 1999), которая является известным модулятором оксидазной активности ЦП в отношении биогенных аминов.

Участие в метаболизме N0

Показано, что in vitro ЦП регулирует уровень N0. Так, N0 является субстратом для ЦП. При прямом, хотя и низко аффинном, связывании с медными сайтами (голубыми) типа 1 NO восстанавливается до NO2 (Muski et ai, 1991). С другой стороны, ионы меди, входящие в состав GPI-ЦП,

катализируют образование N0 во внеклеточном пространстве из углеводных цепей протеогаиканов (Qiao et al, 2003; Mani et al, 2004).

Антиоксидантная функция

Антиоксидантная функция ЦП, подобно супероксиддисмутазе, проявляется в защите in vitro эритроцитов от лизиса, вызываемого тяжелыми металлами (Barnes&Frieden, 1984). В частности, железо-связывающая способность ЦП является важным антиоксид антным механизмом в понижении уровня свободных ионов Fe²⁺. ЦП эффективен в разложении супероксид-радикалов (ион-радикал О'г), хотя активность ЦП в 1000 раз ниже, чему Си²⁺п²⁺-супероксиддисмутазы (Нейфах и др., І988).

Пероксидазная функция

ЦП проявляет пероксидазную активность, в частности, катализирует перекисное окисление липидов в присутствии ионов железа и тиолов (Calabrese&Muski, 1997).

Молекула ЦП содержит отдельный каталитический сайт, обладающий медь-независимой глутатион-пероксидазной активностью в отношении как гидрогенных так и органических пероксидов. Взаимодействие с органическими пероксидами может иметь значение в метаболизме гидропероксидов липидов во внеклеточном пространстве (Bielli&Calabrese, 2002).

Участие в окислении липопротеиное

При термальных травмах ЦП содействует окислению липопротеинов сыворотки крови, печени и мозга (L'vovskaia et аі, 1996). Он также может ингибировать перекисное окисление липидов, вызванное ферритином, или индуцировать его в условиях воспаления (Mukhopadyay et al., 1997; Hilton et аі, 1997; Mukhopadyay et al, 1998).

Участие в острофтиом ответе

ЦП является белком острой фазы. Увеличение экспрессии гена ЦП, а, следовательно, и его концентрации в крови сопровождает различные патологические состояния, инфекции, травмы, хирургические вмешательства, инфаркты тканей, а также злокачественные перерождения, в частности метастатическую стадию рака. Исследования, основанные на различных экспериментальных подходах, подтверждают тот факт, что ген ЦП — это один из нескольких генов, экспрессия которых в опухолевых клетках строго отличается от нормальной уже на очень ранних стадиях перерождения при определенных типах рака, как правило наиболее агрессивных (Kunapuli et al, 1987).

Роль ЦП в апгиогенезе

Процессы ангиогенеза, возможно, поддерживаются высоким уровнем ЦП, который свойственен ангиогенным сайтам. Это свойство показано на растущих опухолях, где требуется высокий уровень меди для образования новых сосудов (Raju et al, 1982). Оверэкспрессия ЦП в наиболее агрессивных опухолях может быть объяснена его разнообразными функциональными активностями, которые поддерживают рост и жизнеспособность опухоли (ВІЄІІІ& Calabrese, 2002).

Участие ЦП в мемсклеточных взаимодействиях

GPI-ЦП участвует в межклеточных взаимодействиях клеток нервной ткани. Эта изоформа ЦП экспрессируется в шванновских клетках и астроцитах и играет роль в аксонально—глиальных взаимодействиях (Salzer etal, 1998).

1.8. Церулоплазмин - "moonlighting" белок

Существование большого числа белковых форм ЦП и многообразие его функций позволяет отнести изучаемый белок к интереснейшей группе белков - "moonlighting proteins".

Термин "moonlighting proteins" был введен C.J. Jeffery (Jeffery, 1999).
"Moonlighting" переводится с английского языка как "работающий по
совместительству". Концепция молекулярной биологии «один ген. — один
белок - одна функция» перестает соответствовать накопленным данным. Так,
обнаруживается все больше и больше белков обладающих более чем одной
« функцией; которые к тому же тканеспецифически меняются в течение

онтогенеза. Для того чтобы каждая из функций проявлялась "в нужное время в нужном месте" клетки должны вырабатывать сложные механизмы тканеспецифической регуляции экспрессии этих генов. Для некоторых белков примеры таких механизмов приведены в таблице Л'A". (Jeffery, 1999)

Многообразие функций, продуцируемых уникальным геном, достигается с помощью многочисленных белковых продуктов этого гена, которые могут образоваться, в ходе альтернативных альтернативных путей экспрессии гена, на разных уровнях. Именно с таких позиций, по-видимому, следует рассматривать многообразие функций ЦП.

ЦП является типичным примером "moonlighting" белка. В основе
изменений концентрации¹ и тканевой локализации этого белка в различных
условиях, как и у других многофункциональных белков, лежат регуляторные
механизмы на уровне экспрессии гена ЦП в клетках. И путь к выяснению

механизмов, контролирующих активность этого гена, лежит через изучение регуляции его экспрессии в рамках известных представлений о способах подавления и активации активности генов.

Таблица 1.4.

Примеры "moonlighting" белков (Jeffery, 1999)

Механизм

Различная локализация внутри клетки

Белок

PutA (из Е. coli)

Одна функция

Пролин дегидрогеназа на плазматической мембране

Дополнительные функции

Траскрипционный репрессор в цитоплазме

Одна функция в клетке и другая вне клетки

Фосфоглкжоза изомераза

Катализирует вторую стадию гликолиза

Секретируясь из клетки выполняет 4

дополнительные функции: нейролейкин, фактор аутокринной подвижности (AMF), медиатор дифференцирования и созревания (DMM)

Дифференциальная экспрессия

Нейропилин

В эндотелиальных клетках - это поверхностный рецептор для везикулярного эндотелиального фактора роста

В аксонах это тоже поверхностный рецептор, но для семафорина III

Ол игомеризация

Глицеральдеги

д-3-фосфат

дегидрогеназа

человека

В мономерной форме это ядерная урацил_ДНК гликозилаза

В тетрамерной форме превращает глицеральдегид-3-фосфат в 1,3-дифосфоглицерат

Лиганд/субстрат концентрация

PutA

Связывается с мембраной при высоких концентрациях субстрата (пролина)

Связывается с ДНК при низких концентрациях пролина

Сайты связывания - белки

могут выполнять разные

функции, используя разные

сайты связывания

Рецептор

аспартата из Е.

coli

Рецептор аспартата

Рецептор МВР (maltose-binding protein)

2 і»

Образование комплексов -

некоторые полипептиды

могут входить в состав

мультисубъединичных

комплексов, выполняющих

разные функции

Карбиноламин

дегидратаза

Играет важную роль в метаболизме фенилаланина в печени

Идентичен кофактору димеризации DcoH, который регулирует ДНК-связывающую активность гепатоцитарного ядерного фактора la(HNF-la),

1.9. Потенциальные механизмы регуляции экспрессии генов,
* кодирующих "moonlighting" белки

Обилие механизмов регуляции эукариотических генов обеспечивает все разнообразие функций и форм их белковых продуктов. У эукариотов в ходе эволюции сформировались различные механизмы,, позволяющие подавлять или. повышать уровень транскрипции,, образовывать более чем один транскрипт на основе единственной последовательности цепи ДНК, а затем осуществлять трансляцию более чем одной полипептидной последовательности с каждого транскрипта. К тому же, завершенные полипептиды могут посттрансляционно подвергаться в разных органах альтернативным модификациям (Саминский; 2000); В этой части обзора будут рассмотрены потенциально возможные способы регуляции активности генов. Эти знания послужили основой при изучении реализации регуляторных механизмов экспрессии гена ЦП. Основными уровнями регуляции экспрессии генов у эукариотов являются:

1. время и характер транскрипции данного гена (контроль на уровне транскрипции);

2. характер проце сси нга первичного РНК - транскрипта (контроль на уровне процессинга);

3) отбор в ядре зрелых мРНК, предназначенных для экспорта в
цитоплазму (контроль на уровне транспорта);

4) отбор в цитоплазме мРНК для' трансляции на рибосомах (контроль
у на уровне трансляции);

5. избирательная дестабилизация определенных типов мРНК в цитоплазме (контроль на уровне деградации мРНК);

6. селективная активация^ инактивация или компартментализация молекул белка после их синтеза (контроль на уровне активности белка).

В последующей части обзора эти механизмы будут рассмотрены на примере гена ЦП или генов, наиболее близко относящихся к гену ЦП — генов,

продукты которых участвуют в метаболизме меди и железа у разных организмов.

1,9.1, Регуляция на уровне транскрипции

Регуляция экспрессии генов эукариот в значительной мере осуществляется на стадии транскрипции, затрагивая отдельные гены, группы или множества генов, обуславливающих жизнедеятельность клеток на разных стадиях клеточного цикла, в процессе клеточноШ дифференцировки, морфогенеза и физиологической; активности организма. Согласно современным представлениям, одним из наиболее значимых уровней регуляции транскрипции генов является инициация транскрипции.

Основным механизмом регуляции инициации транскрипции является взаимодействие факторов белковой природы. (т/*знс-действующих факторов, ТФ) со специфическими последовательностями ДНК (г/«схэлементами) в составе регуляторных районов генов, изменение степени метилирования ДНК, в особенности промоторных областей, а также изменения структуры хроматина, связанные с модификацией гистонов (Mitchell&Tjian, 1989). В контроле дифференциальной экспрессии генов важную роль играет сложная система специализированных транскрипционных факторов (ТФ), передающих внеклеточные и внутриклеточные сигналы к специфическим; мишенным генам (Калинин, 2001). Это многочисленный класс ядерных белков, которые, как правило, не обладают ферментативной активностью и классифицируются на основе структурно-функциональных мотивов, обеспечивающих специфическое связывание с определенными участками ДНК (ї/мс-злементами).

Промотор структурных генов, транскрибируемых Pol II, обычно состоит из двух участков. Один из них, консервативный, играет роль минимального (корового) промотора, с которым взаимодействует инициационный комплекс Pol II. Этот участок является началом

транскрипции. Он представляет собой композицию последовательностей, состоящую из ТАТА-бокса, локализованного -25 - -30- п.н. от начала транскрипции, и инициаторного элемента, расположенного так, что его 5 '-концевой аденин находится в позиции +1 начала транскрипции (Paparassioliou, 1997). Дистальнее по отношению к коровому промотору расположен участок, характеризующийся¹ высокой степенью вариабильности. Он содержит сайты для связывания различных транскрипционных факторов.

Специфические. ТФ, взаимодействуя с ^wc-элементами, активируют, либо репрессируют транскрипцию. Результат воздействия (активация или репрессия) может зависеть. от свойств самого фактора, последовательности сайта связывания, от расположения і сайта связывания по отношению к другим регуляторным; последовательностям, а также от типа тканин и физиологического состояния; клетки. С одним и тем; же ї/ме-действующим элементом может связываться как активатор, так и репрессор транскрипции, причем часто они могут являться родственными белками. Более того, один и тот же белковый фактор может иметь как активаторный; так ирепрессорный домен ив различных ситуациях выступать либо=в роли активатора, л ибо в роли репрессора. Подобную структуру имеют белки YY1, WT1, Egrl (Mitchell&Tjian, 1989; Paparassioliou, 1997; Калинин, 2001).

ТФ содержат, по меньшей мере, два типа доменов: ДНК-связывающий и активаторный домен, несущий ответственность за; стимулирование (или репрессию) транскрипции непосредственно или косвенно, через белок-белковые взаимодействия (Paparassioliou, 1997).

Классификация ТФ по типу ДНК-связывающего домена

Большинство идентифицированных к настоящему времени транскрипционных факторов можно классифицировать по нескольким типам белковых структурных мотивов, участвующих в специфическом связывании с цис-элементами ДНК.

РОССИЙСКАЯ ІГОСУДАРСТПЕННЛЛ

БИБЛИОТЕКА

Наиболее распространенными являются мотивы:

1) «спираль-поворот-спираль», который включает два а-спиральных
участка, разделенных коротким а-поворотом (Вгеппап; 1989).

2. «гомеодомен», содержащий три а-спирали, из которых спирали осі и а2 антипараллельны, а спираль аЗ перпендикулярна к ним. Эта третья а-спираль играет роль узнающей и контактирует с основаниями ДНК в большой канавке (Rayan, 1997).

3. «цинковые пальцы» с первичной; последовательностью цис-Х₂-5-Цис-Х₁₂-гис-Х2.5-гис, где X - любой остаток (Klug&Schwabe, 1995). В этой структуре инвариантны- два остатка цистеина и два остатка гистидина, которые образуют тетраэдрический координационный центр связывания иона Zn V Аминокислотные остатки, расположенные в промежутках между остатками цис или тис, образуют выступы, похожие на пальцы (Рис. 1.3), Самый длинный средний выступ контактирует с основаниями і ДНК'. в сайте связывания белка. Различные белки этого класса содержат от 2 до 10 таких мотивов. К этому типу относятся,. например, YY1 и ядерные рецепторы гормонов, о которых пойдет речь в главе «Результаты и обсуждение».

4) «лейциновая- застежка» представляет собой; последовательность, в.
которой 4-6 остатков лейцина находятся друг от друга на расстоянии 7
остатков. Эти а -спирали с повторяющимися остатками Leu используются
белками для димеризации, так: как они могут образовывать структуру
переплетенных а-спиралей. С N- и С-стороны от центральной; богатой
лейцином области расположены участки, богатые основными, положительно
заряженными аминокислотными, остатками, которые и используются для,
связывания с ДНК (Paparassioliou, 1997; Калинин 2001).

5) «спираль-петля-спираль». Такой мотив; имеют около 90
эукариотических белков, участвующих в регуляции развития и
дифферецировке клеток у разных организмов. Мотив состоит из набора
основных, аминокислотных остатков и области, содержащей 2

амфипатические ot-спирали, разделенные петлей длиной от 3 до 25 аминокислотных остатков. С С-стороны от мотива часто расположен мотив лейциновой застежки (Paparassioliou, 1997; Калинин 2001).

Важную роль в определении специфичности ДНК связывающего белка также играют кофакторы, в роли которых часто выступают ионы металлов и дополнительные белки, входящие в ДНК-белковые комплексы (Mitchell&Tjian, 1989).

II.

а.

Ь.

Рецепторы:

Глюкокортикоиды/прогестерон CCTACANNNGTTCT

Эстроген AGCTCANNNGACCT

I нроидный гормон/ретиноеваї кислота TCAGGTCA TGACCTGA

Рис. 1.3. Схема мотивов цинкового пальца (Калинин, 2001).

I. Цинковый палец типа С2Н2 (а) и взаимодействие цинковых пальцев с ДНК (Ъ)

П. Цинковый палец типа С₄ (а) и последовательности, узнаваемые в ДНК

рецепторами тироидных-стероидных гормонов, имеющими такие мотивы (Ь).

Медь-индуцибелъная регуляция транскрипции генов у дрожжей

У дрожжей выявлено существование нескольких медьзависимых транскрипционных факторов, таких как, например АСЕ1 и МАСІ.

МАСІ является репрессором генов, кодирующих белки-транспортеры меди через клеточную мембрану, например мембранных транспортеров меди Ctrl и Ctr3 и мембранную Ре³⁺/Си?⁺-металлоредуктазу Frel. Гены, кодирующие эти молекулы, полностью экспрессируются! только в условиях низкой концентрации > Cu(II) в окружающей среде (Jungmann et ah, 1993; Hesset&Kosman, 1995). Клетки,, несущие доминантную Масі мутацию, Масі^up , не способны репрессировать гены поглощения меди. Такие клетки гиперчувствительны к солям меди в среде для роста. Масі функционально является транскрипционным фактором главным для экспрессии CTR1 и FRE1 (Jungmann et ah, 1993). Медьзависимая репрессия состоит в инактивации медью транскрипционного домена Масі.

У одноклеточных эукариотов различают также. подмножество генов, транскрипция которых активируется; при повышенной внеклеточной концентрации меди. Это гены CUP1, CSR5 и SOD1 (Culotta, 1994). CUP1 и CSR5 кодируют цистеин-богатые белки семейства металлотионеинов, универсальных, детоксицирующих внутриклеточных белков, a: SOD1' — дрожжевую супероксиддисмутазу. Активатором транскрипции этих белков является фактор Acel: (Thiele, 1988). Оба фактора контактируют сДНК доменами типа цинковых пальцев.

Все эти гены имеют промоторный цис-действующий элемент (UAScu^ Cu-responstve upstream activation sequence) элемент необходимый для медь-опосредованной активации транскрипции. Он специфически^ регулируется ионами меди и серебра. UAS _Си обычно содержит 16 пар нуклеотидов, с общей для всех генов коровой последовательностью GCTG (Winge, 1998).

Таким образом, транскрипционные факторы обладают огромным разнообразием механизмов взаимодействия с ДНК, посредством которых они

могут подавлять или увеличивать экспрессию генов. Очевидно, что пути понимания регуляции экспрессии конкретного, интересующего нас гена, лежат через понимание общих механизмов контроля над активностью многофункциональных генов.

1.9.2, Альтернативная транскрипция

Эффективность промотора определяется его структурой и присутствием специфических транскрипционных факторов., В одном гене может содержаться несколько > промоторных последовательностей, которые могут использоваться: тканеспецифично. Таким образом, транскрипция одного гена может осуществляться в различных органах с разных промоторов, расположенных в разных областях гена. В результате будут образовываться разные по длине транскрипты.

Примером гена с альтернативными промоторами является ген АТФазы Вильсона (АТР7В). АТФаза Вильсона, также как и ЦП; является важным звеном в метаболической системе меди. АТР7В, белковый продукт- гена болезни Вильсона, относится к субсемейству Р1-АТРаз - белков, ответственных за активный транспорт ионов тяжелых металлов через клеточную мембрану. Предполагается, что Atp7b является транспортером ионов меди из клетки (Bull et al., 1993; Сох, 1995). В эпифизе крысы были обнаружены две тканеспецифические укороченные формы АТФазы Вильсона - PINA5.1 и PINA5.2 (Borjigin et al, 1999) (Рис. 1.4).

Как показано на рисунке, транскрипты PIN А 5.1 (3.5 т.п.н.) и PINA5.2 (4.3 т.п.н.) содержат кодирующую область С-концевой половины АТФазы Вильсона крысы. Эти изоформы АТР7В содержат все функциональные сайты (АТР — сайт связывания АТФ, Td — трансдуцирующий домен, Ch/Ph - канал и домен фос формирования) за исключением медь-связывающих сайтов, однако, в них найден медьсвязывающий мотив НХХМ.

Td ChJPh ATP

п п п п п п

щ ^п іг

500 п.н. Jrq ЛТР7В крысы

PINA 5.1

] І =

PINA

^'11'

L PINA 5.2

] ' =

Рис. 1.4. Структура PINA-кДНК в сравнении с АТР7В-мРНК (Borjigin et al, 1999).

В отличие от АТР7В-мРНК, PINA-мРНК содержит другие 5' и З'-UTR. Видимо, PINA образуется из гена АТР7В в результате альтернативной инициации транскрипции с промотора, расположенного в интроне 9. Разница в длине транскриптов PINA 5.1 и PINA 5.2 связана с наличием альтернативных сайтов полиаденилирования.

1.9.3. Альтернативный сплайсинг

Сплайсинг - процесс удаления интронов из пре-мРНК и формирования непрерывной белок-кодирующей последовательности нуклеотидов. Процесс сплайсинга может регулироваться на многих уровнях, и эта регуляция может быть различной в разных типах клеток и тканей. Примером такой регуляции является альтернативный сплайсинг, который состоит в том, что некоторые из экзонов не распознаются и включаются в состав интронов. В результате эти экзоны не попадают в состав зрелых мРНК. Таким образом, один и тот же ген может кодировать несколько форм зрелых мРНК, что приводит к синтезу нескольких разных белковых продуктов. У млекопитающих в разных типах клеток на разных стадиях роста и развития альтернативному сплайсингу подвергаются транскрипты 5-10% структурных генов, в том числе и ЦП.

церулоплазмин

экзон 19 і экзон 20

GPI-ЦП секреторный ЦП

TKTVLPNQftSSCSYRMTWNILKTLLISMTTLFQISTKE 1065аа
TKTVLPNq ETKSG 1040аа

Рис. 1.5. Альтернативный сплайсинг ЦП-мРНК (Patel, 2000). Сплошной линией подчеркнут сигнал добавления GPI -якоря.

Именно с помощью альтернативного сплайсинга образуются две известные формы ЦП (Patel&David, 1997). На рисунке 1.5 показан механизм образования GPI-ЦП. В результате альтернативного сплайсинга пять С-концевых аминокислот секреторной формы ЦП заменены на 30 аминокислот, кодируемых экзоном 20.

1.9.4. Транс-сплайсинг

При т/?янс-сплайсинге происходит лигирование двух экзонов,
находящихся в разных молекулах РНК, с одновременным удалением
фланкирующих их интронов. Принципиальная возможность

межмолекулярного сплайсинга была продемонстрирована в опытах in vitro со специально сконструированными РНК-субстратами. В дальнейшем оказалось, что транс-сплайсинг является важным этапом внутриклеточного образования всех мРНК у Trypanosoma, С. Elegans, Euglenoid (Blumenthal, 1995) и некоторых продуктов транскрипции, образующихся у эмбрионов мышей. В каждом случае сайты сочленений относятся к каноническому типу: GU в 5'-сочленении и AG в 3'-сочленении. В качестве продукта образуется разветвленная структура.

1.9.5. Ал ыперпативное полиаденилироваиие

З'-процессинг мРНК состоит из эндонуклеотического расщепления-'3'-концевого некодирующего фрагмента: и последующего приобретения поли-(А) последовательности в результате нематричной полимеризации АТФ (Калинин, 2001). Эти: процессы зависят от присутствия- в пре-мРНК специальных сигналов расщепления-полиаденилирования расположенных на расстоянии- 10-30 н. и 20-40 н. с 5'-стороны от сайта расщепления, соответственно, и U-богатый участок на расстоянии 100-200 н. с 5*-стороны от сайта расщепления. В: 3-нетранслируемой; зоне могут присутствовать несколько сайтов полиаденилирования, поэтому из общего транскрипта; могут образовываться мРНК разной длины. Наличие альтернативного полиаденилирования было показано выше у эпифизарной изоформы АТФазы Вильсона (Рис. 1,4). Удлинение З'-нетранслируемых областей (З'-UTR) может приводить к появлению участков РНК, способных принимать участие в регуляции трансляции,

1.9.6. Регуляция па уровне трансляции

Трансляционный контроль синтеза белка имеет определенные преимущества по сравнению с транскрипционной регуляцией. Так можно осуществлять более быстрый и эффективный контроль над синтезом белка в присутствии постоянного числа: копий = мРНК. В большинстве случаев регуляции на уровне трансляции, регуляторные. цитозольные белки высокоаффинно связываются>. с цис-элемеятаии- мРНК и регулируют ин ициацию трансляции, стабильно сть и локализацию мРНК. При этом цис-элементы могут находитьсяне только в 5'-UTR; Такая регуляция характерна для мРНК, программирующих синтез белков, участвующих в круговороте железа (Рис. 1.6).

Тот.факт, что длина З'-UTR, как правило, заметно превышает длину 5'-UTR; позволяет предположить наличие большого потенциала для регуляции в

З'-UTR. Кроме того, сравнение средних длин 5' и 3' нетранслируемых областей мРНК различных организмов показало, что длина 5'-UTR в процессе эволюции оставалась примерно одинаковой (около 100 нуклеотидов), в то время как длина З'-UTR увеличивалась от 200 нуклеотидов у грибов до 600 у человека. По мере усложнения организации требовалось все больше возможностей тонкой регуляции тканеспецифической экспрессии генов.

Высокий уровень железа

^*\ кодирую ш,а я областьЦ -

Трансляция активирована

Ферритин

Низкий уровень железа IRP-1

кодирующая область]

Трансляция инактивирована

Рецептор трансферрина

^^-] кодирующая я область [> ,

g. ^^*\ кодирую uija я область

мРНК стабильна

мРНК нестабильна

Рис. 1.6. Роль белка IRP1 (iron regulatory protein) в регуляции трансляции мРНК ферритина и стабильности мРНК рецептора трансферрина.

В регуляции обеих мРНК участвует один и тот же белок и идентичные последовательности нуклеотидов в мРНК.

В литературе также описан случай роли З'-UTR ЦП-мРНК в регуляции трансляции для ЦП (Mazumder, 2003).

Показано, что гамма интерферон (IFN-y) индуцирует экспрессию гена ЦП и синтез белка в моноцитах, однако через 8 часов этот процесс прекращается, и уровень синтеза белка становится низким даже при избыточном количестве ЦП-мРНК. Это связано с наличием IFN-y-индуцированного РНК-связывающегося белка, который взаимодействует с

29-нуклеотидной петлей, расположенной в З'-UTR ЦП-мРНК, и блокирует связывание транскрипта ЦП с рибосомами.

1.9.7. Альтернативные сайты инициации трансляции

Главным сигналом начала сборки комплекса инициации трансляции служит «кэп» на 5'-конце мРНК. Рост полипептидной цепи у эукариотов в подавляющем большинстве случаев начинается с первого от начала мРНК AUG-кодона. Однако инициация: может проходить и не на первом инициаторном кодоне, в результате чего с одной и той же мРНК может транслироваться несколько аминокислотных последовательностей. Различают случаи альтернативной инициации, наличия нескольких открытых рамок считывания на одной мРНК и посадки рибосомы, не требующей кэпа.

Таким образом, известные данные о механизмах регуляции экспрессии многофункциональных генов и об экспрессии гена ЦП, хотя они и фрагментарны, убеждают, что изучение роли ЦП в метаболизме меди должно проводиться с учетом тканеспецифической экспрессии, внутриклеточной локализации и онтогенетической изменчивости. Остаются нерешенными вопросы, связанные с выявлением всех участников системы регуляции активности гена ЦП, регуляторних факторов, прямо или опосредованно связанных с регуляцией активности гена в разных органах и тканях в процессе онтогенеза. Роль этого moonlighting белка в обеспечении новорожденных безопасными ионами меди представляется обоснованной предпосылкой для изучения регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы, что и явилось целью данного исследования.

ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы, использованные в работе

В работе были использованы:

Образцы крови женщин, а также грудного молока разного срока лактации, предоставленные Отделением недоношенных детей НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта и городской больницей г. Кандалакша Мурманской области;

культуры клеток молочной железы НС11, LA7, 106, любезно предоставленные проф. Дж. Мерло, Университет Телетон, Милан;

беспородные белые крысы и кролики породы Шиншилла, полученные из питомника «Рапполово»;

праймеры, соответствующие последовательностям 5'-фланкирующего региона гена ЦП крысы, синтезированные фирмой «ARK SCIENTIFI», peqlab Biotechnologie GmbH;

праймеры, последовательно перекрывающие первые 3000 н. промоторной области гена ЦП человека, синтезированные фирмой«Литех», Москва;

праймеры для ОТ-ПЦР на различные участки генов АТР7А и АТР7В, ЦП, GPI-ЦП и Ctrl, синтезированные фирмой «Syntol», Москва;

полноразмерная кДНК-ЦП крысы, любезно предоставленная проф. Gitlin J.D. из Edward Mallinckrodt Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, Gildren's Hospital, клонированная в плазмидах pCplg4 ирСР9В;

антитела к транскрипционным факторам Spl и YY1— фирмы «Santa Cruz Biotechnology»;

олигонуклеотиды (прописным жирным шрифтом выделен сайт для связывания соответствующего ТФ):

1) ggctccgcggCCATCTTggcggct - консенсусный сайт для связывания белка YY1 - SYC (SYM);

2) atcacctgAGGTCAggagttcgag - участок из консенсуса Alu-повтора AUB
(NYC) для связывания с ядерными рецепторами;

3. aagattcAGGTCATGACCTgaggaga - IR-0, для связывания рецептора тиреоидного гормона (TR);

4. agcttcAGGTCAcaggAGGTCAgagag - DR-4, для связывания TR;

5. agcttcAGGGTCAgAGGTCAgagagct - DR-1, для связывания с рецептором 9-цис-ретиноевои кислоты (RXR);

6>agggtagGGTTCAccgaaAGTTCActc - DR-5, ДЛЯ: связывания с рецептором транс-ретиноевой кислоты (RAR); Все олигонуклеотиды, использованные в работе, были синтезированы фирмой- «BioTeZ, Berlin-Buch» (ФРГ), их последовательности взяты из каталога фирмы Santa Cruz Biotechnology.

препарат ЦП крови человека (А₆юд80 ⁼ 0.046), произведенный в Институте
микробиологии им. Пастера МЗМП РФ по технологии, разработанной в
Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН д.м.н. М.М. Шавловским;

антитела к ЦП крови человека и крысы получены к электрофоретически чистым препаратам этих белков по технологии, разработанной М.М. Шавловским (Gaitshkoki et ah, 1981);

антитела к специфическим участкам белков АТР7А и АТР7В;

антитела к лактоферрину человека, предоставленные профессором Кокряковым В.Н., НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург;

моноклональные антитела к факторам YY1S и SP1 предоставлены член-корр. РАН, проф., Н.В; Томилиным; руководителем Лаборатории стабильности хромосом И' клеточной инженерии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург;

вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, фирмы «Amersham"», Великобритания, а также вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, полученные в Отделе Молекулярной генетики НИИЭМ РАМН;

штамм Е. coli DH5- а_у плазмидный вектор pTZl9;

рестрикционные эндонуклеазы EcoRl и HindHI, панкреатическая РНКаза А, ДНКаза, ДНК-лигаза фага Т4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1, а также набор «Multiprime DNA labeling system» - фирмы «Amersham», Великобритания;

агароза типа V, легкоплавкая агароза, агар, компоненты для среды культивирования бактериальных штаммов, реактивы для электрофорезов - фирм «Sigma», США, «ISN Flow», Швеция, «Serva», ФРГ;

адьювант Фройнда - фирмы «Difco», США;

все неорганические соли - фирмы «Merck», ФРГ;

детекционная система «ECL western blotting detection reagent» фирмы «Amersham», Великобритания;

рентгеновская пленка Hyperfilm ECL фирмы «Amersham», Великобритания;

радиоактивные изотопы [ог-³²Р]^АТР - АО «Изотоп», Санкт-Петербург;

ДНК-полимераза, Taq-полимеразы (5.0 ед/мкл) фирмы «Хеликон», Россия, реактивы для проведения ПЦР и ДНК-маркеры фирмы «АмплиСенс», Россия;

белковые маркеры для электрофореза фирмы «BioRad», США.

2.2. Методы, использованные в работе

2.2.1. Методы выделения препаратов белков и нуклеиновых кислот

Выделение ядерных экстрактов из органов крысы. Ядерные экстракты выделяли из печени, мозга и молочной і железы крыс на разных стадиях развития по методу (Extact Preparation, 1986). Органы крысы гомогенизировали в 10-кратном объеме буфере А, содержащем 10 мМ трис-С1, рН 8.0; 10 мМ NaCl; 8 мМ MgCl₂; 10 мМ ДТТ; Ю^М смеси ингибиторов протеаз и центрифугировали при 5000 об/мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»),

Содержащий ядра осадок гомогенизировали в том же буфере, наслаивали на сахарозную подушку из 1.5 М сахарозы, приготовленной- на буфере 20 мМ; трис-С1, рН 8.0, содержащем ингибиторы протеаз, и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 1ч (центрифуга К-24 «Yanetsky»). Осадок ядер ресуспендировали; Для экстракции белков в буфере В, содержащем 20 мМ трис-С1, рН 8.0; 10 мМ ДТТ; 10"⁴ М ингибиторов протеаз, 100 мМ' NaCl, инкубировали 30 мин при температуре тающего льда при встряхивании и центрифугировали в. течение 20мин при 6000 об/мин (центрифуга К-24 «Yanetsky»); Супернатант диализовали против 100-кратного объема буфера С, содержащего 20 мМ трис-С1, рН 8.0; 1 мМ DTT; 0,1 мМ ЭДТА; 5% глицеринДО MPMSF в течение 24 ч при 4 С с одной сменой диализного буфера; вновь центрифугировали в течение 30 мин? при 6000 об/мин. (центрифуга К-24 «Yanetsky»), Супернатант замораживали валиквотах по 100 мкл, хранили при: 70С. Фракции ядерных экстрактов.использовали в качестве источника ядерных факторов (ЯФ) транскрипции.

Получение специфических антител. Для получения антител к ЦП использовали высокоочищенный препарат ЦП из крови крысы и^; человека (Аб 10/280=0.045). Для получения антител к АТР7А был использован синтетический пептид из 16 аминокислотных остатков, Р16: ⁹⁶⁸ETYFPGYNRSISRTET⁹⁸³, для получения антител к АТР7В - пептид из 13 аминокислотных остатков, Р13:⁹⁵¹QKYFPNPNKHISQ⁹⁶³. Выбранные участки согласно предполагаемой модели этих бел ков расположены в нецитозольной петле, прилегающей к медь-трансдуцирующему каналу. Пептиды были синтезированы твердофазным с использованием 5ос-стратегии > (синтез осуществлен в рамках совместной работы в Лаборатории синтеза физиологически активных полимеров ИВС РАН, Санкт-Петербург). Пептиды конъюгировали с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба и полученным конъюгатом иммунизировали кроликов по общепринятой схеме. Конъюгаты Р16 и Р13 с бычьим сывороточным альбумином использовали как

J&5&S0

P13P16

Рис. 2.1. Структурно-функциональная организация медьтранспортных

АТФаз PI типа млекопитающих (Пучкова и Платонова, 2004), и проверка

специфических антител к ним.

Модель Си-АТФазы:

а - медъсвязывающие домены, б - фосфатазный домен,

в - домен фосфоргтирования, г - домен, вовлеченный в транслокацию металла

через мембрану, д - АТФ-связывающий домен, е - Си-транслоцирующий мотив, 1-8

- трансмембранные домены.

РІЗ, Р16 - синтетические пептиды.

В таблице: оценка специфичности антител к АТР7А иАТР7В.

специфические антигены для тестирования антител к Р16 и Р13 соответственно.

Иммунизацию кроликов и: получение, лиофилизированных- иммуно
глобулинов проводили по стандартной: схеме. Наличие антител: к ЦП в.
кроличьей сыворотке устанавливали методом ракетного

иммуноэлектрофореза в 1% агарозном геле, для обнаружения специфических антител к пептидам Си-АТФаз использовали дот-иммуноблоттинг с ВСА-Р16 и BGA-P13 в каче стве антигенов.

Выделение фракции плазматических мембран. Плазматические мембраны получали с помощью низко скоростной седиментации и последующей очистки ресуспендированного осадка через подушку сахарозы. Для этого замороженную при -70G ткань растирали в ступке, добавляли 10-кратный по отношению к весу объем буфера А (0.25 М сахароза; 10 мМ/грис-НС1 буфер, ptL7.4; 5 мМ MgCl₂; 100 мМ КС1; 5 мМ ДТТ; 100 мкг/мл гепарин и смесь ингибиторов протеаз, 1:1000. Гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин- в, течение 10 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»). Осадок ре суспендировали в буфере Б (буфер Абез гепарина и сахарозы); наслаивали на ступенчатый (50-30%) градиент, сахарозы, приготовленной на буфере Б, и центрифугировали в течение 1 ч при 5000 об/мин (К-23 «Yanetsky»). Фракцию;- расположенную на границе. 50% и- 30%. сахарозы, собирали,, разбавляли буфером;Б в соотношении 1:3 и центрифугировали-в течение 10 мин при 5000 об/мин. Все процедуры проводили при 4С. Препараты мембран содержали примерно 80% общей клеточной уабаин-чувствительной На"7К⁺-активируемой, Mg-зависимой^ АТФазы, специфического- маркера плазматической > мембраны. АТФазную активность измеряли по приросту P_rt (неорганического фосфора) в 0.1 мл инкубационной смеси, содержащей 5 мМ MgCl₂; 100 MMNaCl; 3 мМАТФ; 100 мМтрис-HCl буфера, рН 7.0; 0,5 мМ уабаина и 0.2 мг белка испытуемой субклеточной фракции, после 30 мин инкубации при 30С.

Выделение геномной ДНК из печени крысы. Свежевыделен кую печень гомогенизировали в буфере А, содержащем 10 мМ трис-Gl, рН 8.0; 0.1 М ЭДТА; 0.25 М сахарозу и центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»), Полученный осадок ре суспендировали в буфере А, наслаивали на 1.5 М-сахарозную подушку, содержащую 20 мМ трис-С1, рН 8.0 и центрифугировали в течение 1 ч при 15000 об/мин: (центрифуга К-24 «Yanetsky»), Осадок ядер ресуспендировали в буфере В, содержащем 10 мМ^;трис-С1, рН 8.0; 0.1 М ЭДТА; панкреатическую РНКазу 20 мкг/мл, к лизату добавляли протеи назу К до конечной концентрации 100 ^і мкг/мл и инкубировали при_; 37С в течение ночь. Инкубационную смесь обрабатывали равным объемом свежеперегнанного насыщенного раствора фенола, рН 8.0, встряхивали Юмин при 37G, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»); к супернатанту добавляли смесь фенола и хлороформа, взятых в соотношении 1:1, и-центрифугировали при 5000 об/мин ,15 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»). Процедуру экстракции ДНК из полученного супернатанта повторяли равным: объемом смеси хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении' 24:1. Высокополимерную ДНК осаждали двумя объемами охлажденного 96% этанола- в: присутствии 0.1 объема ЗМ NaAc. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали до отсутствия запаха этанола, который определяли; органолептически, и растворяли в минимальном количестве ТЕ-буфера; состоящего из 10 мМ трис-С1, рН 7.4 и 0.1 мМ ЭДТА. Концентрацию ДНК определяли по данным спектрофотометрического измерения;

Выделение геномной; ДНК из крови человека. Кровь отбирали в цитратньш буфер, содержащий 0.48 г лимонной кислоты; 1.32 г цитрата натрия и 1.47 г глюкозы на 100 мл дистиллированной воды. Полученные пробы крови центрифугировали при 3.5 об/мин в течение 15 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»), Затем отбирали полученную сыворотку и пленку, обогащенную лейкоцитами. К пробам добавляли экстракционный буфер,

содержащий 10 мМ трис-С1 рН 8.0; 0.1М ЭДТА, рН 8.0; 20 мг/мл РНКазы панкреатической и 0.5% SDS, и инкубировали при 37С в течение 1 часа. К лизату добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали при 37 С в течение ночи. Инкубационную смесь обрабатывали равным объемом свежеперегнанного насыщенного раствора фенола, рН 8,0, встряхивали Юмин при 37С, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky») процедуру повторяли несколько раз. К супернатанту добавляли смесь фенола и хлороформа, взятых в соотношении 1:1, и центрифугировали при 5000 об/мин 15 мин (центрифуга Т-23 «Yanetsky»). Процедуру экстракции ДНК из полученного супернатанта повторяли равным объемом смеси хлороформ :изоамиловый спирт в соотношении 24:1. Высокополимерную ДНК осаждали двумя объемами охлажденного 96%. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали до отсутствия запаха этанола, который определяли органолептикески, и растворяли в минимальном количестве ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.

Выделение тотальной РНК '. из органов

крысы. Выделение РНК осуществляли с использованием RNAqueous Kit (Small scale phenol-free total RNA isolation kit), Ambion Inc., США в полном соответствии с прописью производителя.

Выделение РНК из культивируемых клеток, РНК из

культивируемых клеток НС11, LA7 и 106 изолировали с использованием реагента TRIZOL (TriPure Isolation Reagent, фирмы Boehringer Mannhaim, Германия) в полном соответствии с инструкцией производителя.

2Л.2. Методы исследования нуклеиновых кислот (НК)

Электрофоретический анализ НК в агарознам геле. Гель-электрофорез ДНК и РНК проводили в агарозе типа V на ТВЕ-буфере рН8.0, содержащем 0.089 М трис, 0.089 М. борную кислоту и 0.002 М ЭДТА, с 0.5 мкг/мл бромистого этидия по стандартной методике (Sambrook et ah, 1991),

Перенос ДНК на нитроцежюлозный фильтр (НЦФ) по методу Саузерна. Перенос ДНК на мембрану осуществляли согласно стандартной методике (Sambrook et al., 1991).

Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля. Разделение фрагментов ДНК осуществляли с помощью гель-электрофореза в 0.7% легкоплавкой агарозе. Затем проводили элюирование фрагментов ДНК из зоны геля по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Электрофоретический анализ ДНК в ПААГ. Электрофорез ДНК проводили в 8% ПААГ на ТВЕ-буфере. Гель содержал 8% акриламид, 1/10 часть от объема 10х ТВЕ-буфера; 0.25% TEMED; 0.075% ПСА. После прохождения электрофореза гель инкубировали в 10% уксусной кислоте в течение 20 минут, а затем отмывали в воде 2 раза по 2 минуты. Затем 30 минут инкубировали в 0:1% AgN03 и помещали в проявляющий раствор, содержащий 3% Na₂C0₃, 11% формальдегид и 0.0004% тиосульфат натрия, до проявления окрашенных зон ДНК и фиксировали в 10% уксусной кислоте.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР. Для ПЦР в качестве матрицы использовали геномную ДНК печени крысы или геномную ДНК крови человека. ПЦР проводили в стандартных условиях (Sambrook et al, 1991) в 30 мкл смеси, содержащей 10х буфер для ПЦР: 500 мМ КС1, 10 мМтрис-С1, рН 8.3, 15 мМ MgC12; 0.1% (в/о) желатина; 10х смесь dNTP по 2мМ dATP, dTTP, dGTP, dCTP; ДНК-полимеразу 0.3 мкл, 5000 Ед/мл); 300 нг геномной ДНК,, по 100 пМ

праймеров и минеральное масло. Параметры проведения реакции для каждого отдельно взятого случая; подбирали индивидуально с помощью компьютерной программы. Полученные продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза в агарозе или в ПААГ.

Обратная транскрипция, сопряженная с полгшеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез к ДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей I^і мкг полирибосомной РНК, 200; ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы (M-Mlv обратная, транскриптаза, 200 ед/мкл, «Хеликон», Россия), 1 мкМ олиго-дТ-праймера длиной 18 нуклеотидов («Литех», Россия), эквимолярную смесь четырех dNTP по 500 мкМ: каждого («Promega», США), 50 мМтрис-HCl буфера, рН 8.3, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCl₂, 50 мМ ДТТ. Перед добавлением; в инкубационную смесь РНК с праймерами отжигали; в течение 5 мин при 70С. Реакцию проводили в течение 1 ч при 37^СС. Затем общий объем смеси доводили до 60 мкл деионизованной водой; ПЦР проводили в 50 мкл смеси, содержащей 5 мкл синтезированной кДНК, 2.5 ед. Taq-полимеразы, 1.5 мМ MgClj, эквимолярную смесь четырех dNTP по 200 мкмолей каждого, 10 мкл 5-кратного ПЦР-буфер («АмплиСенс», Россия) и по 0.5 мкМ специфических праймеров. Параметры реакции в каждом; отдельном, случае подбирали с помощью компьютерной программы. Электрофоретический анализ ПЦР продуктов проводили в 1% агарозном геле.

Определение steady state уровня мРНК. Уровень синтеза изучаемых мРНК определяли согласно описанному в литературе методу (Marone et al., 2001). Для каждой ПЦР реакции определяли количество циклов, при котором синтез продукта: не достигает насыщения. В каждом образце определяли уровень мРНК р-актипа, который служил показателем прохождения ОТ-ПЦР и был использован в качестве примерно постоянной величины, к которой относили соответствующие величины для каждой мРНК. ПЦР-продукты подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым

этидием, сканировали, денситометрировали и обрабатывали с помощью программы Scion image. Данные денситометрии относили к таким же данным для р-актина, полученным на этих же препаратах РНК в этих же опытах. Каждое определение проводили 2-3 раза в независимых экспериментах.

2.2.4.Методы исследования белков

Денатурирующий электрофорез белков в ПААГ. Электрофоретическое разделение белков и: их: молекулярно-весовой анализ проводили в полиакриламидном геле (ITAAF) в присутствии; додецилсульфата натрия (0.1% SDS) по методу Laemmli (Laemmli, 1970). После окончания электрофореза белки, находящиеся в геле, выявляли с помощью неспецифического окрашивания Кумасси R-250, либо переносили на НЦФ;

Иммуноблотинг. Белки, разделенные электрофоретическим методом в-ПААГ, переносили на НЦФ методом полусухого электропереноса с помощью перпендикулярно направленного тока в прерывистой системе рН и концентраций трис-С1 буфера (Sambrook et al., 1991).

Выявление иммунореактивных ответов на НЦФ:

1 способ: НЦФ отмывали в PBS (8 г NaCl, 0.2 г КС1- 1.44 г Na₂HP0₄, 0.24 г
КН2РО4 в 1л НгО, рН 7.4) и блокировали незанятые места связывания для
белка на мембране в 3% растворе нейтральных белков обезжиренного молока
(BLOTTO)^! в РВ S. 3 атем мембраны инкуб ировали в BLOTTO, содержащем
соответствующие антитела, в течение 1ч при 37С и отмывали в 1% растворе
BLOTTO. Затем^ НЦФ инкубировали с, [ 1]антителами барана к
иммуноглобулинам кролика, в течение 1 ч при 37С. Иммунореактивные
ответы выявляли с помощью авторадиографирования.

2 способ: НЦФ с перенесенными из геля белками отмывали PBS ,
блокировали 5% раствором BLOTTO в PBS и промывали раствором PBS,
содержащим 0.1% Tween-20. Затем фильтры инкубировали в растворе 0.5%

BLOTTO, содержащем 0.02% Tween-20 и антитела к YY1 или Spl, в течение 1 ч при комнатной температуре. От не связавшихся антител фильтры отмывали в PBS, содержащем 0.1% Tween-20, и инкубировали с антителами осла к антителам кролика в растворе 0.5% BLOTTO, содержащем 0.02% Tween-20, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем фильтры снова промывали в: PBS. Иммунные комплексы выявляли с помощью хемилюминесцентного метода. Для этого раствор, содержащий 250 мМ люминала, растворенного в DMSO, 90 мМ р-кумаровой кислоты и 1 М трис-CI буфера, рН 8:5, и I мл 30 % Н2О2, помещали на НЦФ и выдерживали 1 мин. Для выявления иммунореактивных ответов проводили авторадиографирование в экспериментально подобранном интервале времени от 20 мин до 1 ч: В большинстве опытов для визуализацию комплексов антиген-антитело хемилюминесцентным методом использовали набор «Amersham»; Великобритания.

Определение содержания ЦП методам количественного иммуноэлектрофореза. Содержание ЦП определяли методом количественного ракетного иммуноэлектрофореза в 1% агарозном геле по стандартной методике (Krolt, 1973). В качестве количественного-стандарта использовали коммерческий препарат ЦП; После электрофореза: гели отжимали, высушивали, окрашивали на общий белок Кумасси R-250. Площадь каждого преципитационного пика определяли как площадь равнобедренного треугольника.. В каждом геле справа, слева ив центре размещали лунки, содержащие разные концентрации. стандартного раствора ЦП. Количество ЦП в каждом случае определяли по кривой, построенной на средних знач єн иях стандартов данного опыта. В; каждом образце измерение проводилось дважды. В качестве количественного стандарта использовали препарат ЦП крови. Относительное содержание лактоферрина измеряли по методу Манчини.

2.2.5, Клонирование фрагмента хромосомного гена ЦП крысы

Получение [ PJДНК-зондов. [ Р]ДНК-зонды получали с помощью реакции статистического праймирования- с. использованием, набора «Multiprime DNA labeling system» на матрице ЦП-кДНК' (Sambrook et ah, 1991).

Блот-гибридизация [ Р]ДНК-зонда с ДНК. Блот-гибридизацию ДНК-ДНК на НЦФ проводили по стандартной методике (Sambrook et al:, 1991)..

Клонирование, фрагмента хромосомного гена ЦП крысы, идентифицированного с помощью блот-гибридизации с кДНК-ЦП, в плазмидном векторе pTZ 19. Ясой/-гидролизат хромосомной ДНК печен крысы разделяли с помощью электрофореза в геле из легкоплавкой агарозы и проводили элюцию фрагментов, соответствующих по длинам зонам, гибридизующимся с [ Р]кДНК ЦП. ДНК. плазмиды pTZ 19 обрабатывали рестрикционной: эндонуклеазой EcoRI при.37С 1 ч. Реакцию лигирования проводили в смеси, содержащей элюированый EcoRl-фрагмеіп хромосомного гена ЦП, ДНК pTZ19/EcoRI, .1 мМ ATP, 5мМ ДТТ, ДНК-лигазу фага Т4, при. 14С 16 ч. Соотношение количества ДНК вектора к клонированной ДНК составляло 1:10. После проведения реакции осуществляли трансформацию компетентных клеток штамма DH5-a: E.coli лигазной смесью по методике, описанной в (Маниатис и др., 1984). Селекцию трансформированных бактериальных клонов вели по устойчивости к ампицилину и по цвету колоний в присутствии субстрата X-Gal и индуктора IPTG.

Выделение плазмидной ДНК. Выделение ДНК плазмиды pTZ19, а также рекомбинантной плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса по стандартной методике (Маниатис и др., 1984): Полученную ДНК анализировали с помощью гель-электрофореза в 0.8% агарозе.

2.2.6. Методы анализа взаимодействия ДНК и белков

Идентификация специфических комплексов ДНК с ЯФ методом выявления изменения зпектрофоретической подвижности, в геле, (гель-шифт). Для проведения реакции связывания ДНК с ЯФ использовали 5 мкг экстракта ядерных белков и 2-5 нг двунитевого ол игонуклеотида, меченного [ PJ-ATP. Реакцию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре в 12 мМ HEPES-буфере, рН .7.9, содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl₂, 0.2 мМ DTT, 10%фикол, 1 мкг неспецифической ДНК (использовалась обработанная ультразвуком ДНК эритроцитов цыпленка). В качестве конкурентов использовали немеченные двунитевые олигонуклеотиды. Образовавшиеся комплексы разделяли в 4% полиакриламидном геле в буфере, содержащем 23 мМ трис-СІ, рН 8.2,23 мМ борной кислоты, 0.5 мМ ЭДТА. Гели высушивали; под вакуумом и авторадиографировали..

2.2.7. Аналитические методы,

Спектрофотометрическое определение концентрации НК. Спектрофотометрическое: определение концентрации нуклеиновых кислот осуществляли согласно методике (Маниатис Т. и др., 1984).

Определение концентрации белка по методу Лоури. Концентрацию белков определяли по методу Лоури, описанному в (Кочетов; 1980).

Измерение кон центрации меди: Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической:атомизацией и Зеемановской коррекцией: неселективного поглощения на спектрометре модели 4100ZL фирмы «Perkin-EI тег», США. Измерение в образцах снятого молока, сыворотки, крови и СМЖ проводили без предварительной подготовки. Флотирующую и нерастворимую фракции, молока предварительно лизировали В:смеси 2% Тритона Х-100 и 5% ДДС. Органы взвешивали, высушивали до постоянного веса в вакууме над пятиокисью фосфора, сжигали в смеси хлорной и серной кислот с деионизованной водой

в соотношениях 100:25:125 соответственно, остаток растворяли в деионизованной воде.

Измерение оксидазной активности. Оксидазную активность определяли по методу Рэвина (Ravin, 1961).

Определение содержания лактоферрина в сыворотке молока. Относительное содержание лактоферрина измеряли методом Манчини. Для этого случайным образом объединяли 50 мкл аликвоты пяти образцов молока одного дня лактации, смесь разводили в 16 раз физиологическим раствором и брали 10 мкл на иммунодиффузию по Манчини. Площадь преципитационной зоны, образующейся в 1% агарозном геле толщиной 2 мм, содержащем в 1 мл 300 мкг поликлональных антител к лактоферрину человека. Содержание лактоферрина в снятом молоке первого дня лактации принимали за 100%,

Измерение концентрации карбонильных групп белков. Содержание модифицированных аминокислот в белках сыворотки крови и цитозоле определяли с 2,4-динитрофенилгидразином (Тїап et ah, 1995).

ЧАСТЬ З: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Задача первой части работы состояла в определении количества меди, связанной с ЦП молока в первые дни лактации, и изучении влияния «упаковки» пищевых ионов меди на их распределение у новорожденных.

Похожие диссертации на Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы

Регуляция экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы человекаМостович, Людмила Андреевна

Регуляция экспрессии генов плацентарного трансформирующего фактора роста-Z и Z-рецептора тромбоцитарного фактора роста кальцитриолом в клетках LNCaP рака предстательной железыНазарова Надежда Юрьевна

Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L.Селиванова, Наталия Владимировна

Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птицПолешко Андрей Сергеевич

Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфаМогиленко, Денис Александрович

Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвичаМаланин, Сергей Юрьевич

Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышейМихайлова Ольга Николаевна

Сигнальная регуляция экспрессии генов защитных белков растений при холодовом стрессеГималов Фуат Рамазанович

Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP и HSP32 у проростков ячменяПогульская Елена Николаевна

Изоцитратлиаза из сои : очистка, каталитические характеристики, идентификация генов icl1 и icl2 и регуляция их экспрессииЧан Тхи Хоанг Куен