Введение к работе
Актуальность темы. Клеточные эпигенетические механизмы, включающие РНК-интерференцию, метилирование ДНК и модификации гистонов, участвуют в наследуемой регуляции экспрессии генов без изменения последовательностей ДНК. Исследования последних лет показали, что нарушение эпигенетической регуляции ряда генов приводит ко многим серьезным патологиям, включая онкологические заболевания, анемию, задержки умственного развития и др. Понимание причин возникновения таких заболеваний и поиск методов их лечения основаны на исследованиях биохимических механизмов эпигенетической регуляции, выявлению ферментов, ответственных за реактивацию, и разработке новых методов эпигенетической терапии (Egger G. et al, 2004).
Кроме патологий, вызываемых нарушениями экспрессии клеточных генов, существует ряд инфекционных заболеваний, лечение которых тесно связано с эпигенетической регуляцией. Особенностью ретровирусных инфекций является наличие латентного резервуара инфицированных клеток, препятствующего элиминированию вируса из организма и полному излечению от ретровирусной инфекции. Исследование механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов необходимо для поиска новых подходов по реактивации инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Используемые в настоящее время методы лечения ретровирусных инфекций основаны на высоко активной антиретровирусной терапии с применением комбинаций различных препаратов, ингибиторов вирусных белков и ферментов. Недостатками такого лечения являются: 1) сохранение в организме резервуара инфицированных клеток (несущих способную к реактивации латентную форму ретровируса); 2) длительная антивирусная терапия осложняется возможностью появления мутантных форм вируса, устойчивых к большинству используемых лекарственных препаратов. Наиболее перспективным направлением в лечении ретровирусных инфекций является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией инфицированных клеток, несущих эпигенетически-молчащий интегрированный провирус, и составляющих вирусный резервуар. Такой подход позволяет элиминировать вирус из организма, за счет предотвращения ретровирусной репликации и удаления резервуара инфицированных клеток, в том числе несущих латентный ретровирус (Geeraert L. et al, 2008).
Помимо проблемы латентных ретровирусных инфекций, изучение механизмов эпигенетического молчания ретровирусных генов является исключительно важным для генной терапии с применением векторов на основе ретровирусов. Поддержание продолжительной экспрессии «терапевтического» гена, доставленного ретровирусным вектором и
интегрированного в геном клетки-мишени, невозможно без понимания основных клеточных механизмов эпигенетической регуляции.
Целью настоящей работы являлось создание модели, на основе клеточной линии HeLa, несущей интегрированный ретровирусный вектор, и последующее изучение механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов.
В задачи настоящего исследования входило:
Получить субпопуляцию клеток HeLa, несущих транскрипционно-молчащий интегрированный вектор на основе вируса саркомы птиц, кодирующий репортерный GFP ген. Оценить возможность использования данной клеточной линии для изучения механизмов эпигенетического контроля ретровирусов.
Проверить возможность использования методов РНК-интерференции для изучения эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов. Оценить эффективность и специфичность нокдауна генов-мишеней посредством трансфекции клеток миРНК.
Создать систему скрининга библиотек миРНК с высокой пропускной способностью для поиска клеточных генов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания.
Осуществить скрининг библиотеки миРНК, содержащей потенциальные эпигенетические регуляторы, для определения клеточных генов, участвующих в поддержание эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов.
На основе полученных данных создать модель эпигенетической регуляции экспрессии генов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Исследования последних лет показали, что нарушения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов приводит к различным патологиям и заболеваниям, и кроме того затрудняет лечение ряда инфекционных заболеваний вызываемых ретровирусами. Поиск новых подходов для лечения этих заболеваний осложняется за счет отсутствия достаточных знаний о механизмах клеточного эпигенетического контроля и причинах, вызывающих его нарушения, а так же возможных методах эпигенетической терапии.
На сегодняшний день для лечения ретровирусных инфекций, таких как вирус иммунодефицита человека, наиболее перспективными методами является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией резервуара инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Для реактивации латентных форм ретровирусов применяются ингибиторы
гистоновых деацетилаз и ДІЖ метилтрансфераз. Данные препараты имеют высокую активность, но также и высокую токсичность для клеток, что не позволяет им пройти клинические испытания и быть использованными в антиретровирусной терапии. Таким образом, исследование механизмов эпигенетического контроля ретровирусных генов совместно с поиском новых групп соединений, способных к реактивации латентных ретровирусов и обладающих низкой токсичностью, являются особенно актуальным.
Положения, выносимые на защиту:
Выделенная из клеточной линии HeLa, субпопуляция клеток HeLa ТИ, несущая транскрипционно-молчащий интегрированный ретровирусный вектор на основе вируса саркомы птиц, содержащий GFP репортерный ген под контролем различных промоторов, может быть использована как модель для изучения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов.
Методы РНК-интерференции могут быть применены для поиска и определения клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. Продукты экспрессии генов HDAC1, DAXX и НР1у, участвуют в поддержании эпигенетического молчания. Нокдаун этих генов приводит к реактивации ретровирусного репортерного гена.
Клеточные гены SETDB1, CHAF1A, TRIM24, TRIM33, RAD21, PBRM1, ZMYND8, MBD1, MBD3, DNMT3a, RING1, РНС2, FBXL11, Suv420H2, JMJD2A, выявленные в ходе скрининга библиотеки миРНК, участвуют в эпигенетическом контроле экспрессии генов. На основе полученных данных предложена модель эпигенетического контроля ретровирусов.
Апробация работы и публикации. Результаты работ были представлены на международных конференциях: «33rd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2008), «Международная Студенческая Конференция XXXVIII» (Новосибирск, Россия. 2008), «12th Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2007), «32nd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2007), «її"1 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2006). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 31 рисунок, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а так же списка литературы (240 источников).
