Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Краткая характеристика генома хлоропластов 7
1.1.1. Структура и функции хлоропластной ДНК (хпДНК) 7
1.1.2. Эндосимбиотическое происхождение хлоропластов 8
1.1.3. Перенос хлоропластных генов в ядро в процессе эволюции 9
1.2. Взаимодействие ядерных и хлоропластных геномов 12
1.3. Координация экспрессии генов и межорганелльная передача сигналов 17
1.3.1. Антероградные механизмы (передача сигналов от ядра к органеллам) 17
1.3.2. Координация экспрессии генов хлоропластов и митохондрий 19
1.3.3. Общая картина регуляции транскрипции ядерных генов белков хлоропластов 20
1.4. Ретроградные сигналы (передача сигналов от хлоропластов к ядру) 23
1.4.1. Роль синтеза белка в пластидах в экспрессии ряда ядерных генов 26
1.4.2. Влияние мутаций, вызывающих нарушения фото-синтеза или передачи пластидного сигнала, на экспрессию ядерных генов хлоропластов 27
1.4.3. Регуляция экспрессии ядерных генов редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи 29
1.4.4. Регуляция транскрипции ядерных генов тетрапирролами 34
1.4.4.1. Сигнальная роль тетрапирролов у высших растений 34
1.4.4.2. Сигнальная роль тетрапирролов у зеленых водорослей 36
1.4.4.3. Mg-протопорфирин IX и его монометиловый эфир как регуляторы экспрессии ядерных генов 38
1.4.4.4. Мишени тетрапиррольных сигналов 40
1.4.4.5. Транспорт тетрапирролов 41
1.5. Стрессовые белки хлоропластов 44
1.5.1. Белки светового стресса пластид Elip 44
1.5.2. Низкомолекулярные белки теплового стресса 51
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 53
2.1. Растения и условия выращивания. Обработка растений ингибиторами 53
2.2. Условия теплового и светового стрессов 53
2.3. Определение содержания порфиринов 54
2.4. Выделение РНК 54
2.4.1. Электрофорез в агарозном геле 55
2.5. Выделение геномной ДНК 55
2.6. Нозерн - гибридизация зондов, меченных [a- P]dATP, с тотальной РНК ячменя 56
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сопряженная реакция обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 57
2.8. Выделение пластид и фракционирование хлоропластов 59
2.9. Выделение суммарных белков клетки 59
2.10. Электрофорез и иммуноблоттинг 60
2.11. Пептидные карты, полученные с помощью ограниченного протеолиза белков 60
2.12. Обработка хлоропластов трипсином 60
2.13. Измерение фотохимической активности ФСП 61
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Влияние фотодеструкции хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне мРНК у NF- обработанных растений 62
3.2. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у NF-обработанных растений 68
3.3. Влияние пластидных сигналов разных классов на регуляцию экспрессии ядерного гена пластидиого белка ЕНр 77
3.3.1. Сигнальная роль интермедиатов биосинтеза тетрапирролов 77
3.3.2. Влияние синтеза белка в пластидах на экспрессию гена ЕНр 84
3.3.3. Регуляция экспрессии гена ЕНр редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи 85
Заключение 90
Выводы 98
Список литературы 100
Список сокращений 114
- Перенос хлоропластных генов в ядро в процессе эволюции
- Сигнальная роль тетрапирролов у зеленых водорослей
- Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у NF-обработанных растений
- Регуляция экспрессии гена ЕНр редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи
Введение к работе
Хлоропласта содержат около 3500 различных белков, только небольшая часть которых кодируется пластидным геномом. Большинство белков пластид кодируется ядром. Координация экспрессии генов хлоропластных белков, кодируемых двумя клеточными геномами, достигается путем обмена информацией между ними, в котором участвуют специфические регуляторные сигналы, идущие как от ядра к пластидам, так и от пластид к ядру. Ключевая роль в этих процессах принадлежит клеточному ядру. Сигналы, посылаемые ядром в различные компартменты клетки (ядерные или антероградные сигналы) изучены значительно лучше, чем сигналы, генерируемые хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы).
Предположение осуществовании «пластидного сигнала», который регулирует экспрессию ядерных генов хлоропластных белков, было высказано впервые в середине 80-х годов (Вбгпег, 1986; Oelmuller, Mohr, 1986). В последние годы интерес к исследованию пластидных сигналов сильно возрос. Было установлено, что пластидными сигналами, «запускающими» синтез кодируемых ядром пластидных белков, могут являться продукты синтеза белка в пластидах, активные формы кислорода (синглетный кислород и перекись водорода), редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза, а также интермедиаты биосинтеза тетрапирролов. Было доказано, что пластидные сигналы регулируют экспрессию ряда генов фотосинтеза (Pfannschmidt, 2003). Однако данные о передаче сигналов от хлоропластов к ядру по-прежнему немногочисленны. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, только начинается. Не идентифицированы ни механизмы, позволяющие пластидному сигналу проходить через оболочку органелл, ни молекулы-мессенджеры, локализованные в цитоплазме/ядре.
В связи с изложенным, большой интерес представляет исследование роли пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков хлоропластов, поскольку эти белки играют важную роль в защите растений от стрессовых факторов окружающей среды (интенсивный свет, экстремальные температуры, засуха и др). В хлоропластах высших растений идентифицированы мультигенное семейство стрессовых белков ЕПр, локализованных в тилакоидах, и стрессовый белок теплового шока Hsp32, локализованный в строме хлоропластов. Действие пластидных сигналов на транскрипцию ядерных генов стрессовых белков хлоропластов практически не изучено.
Белки семейства Elip (ранние индуцируемые светом белки) синтезируются в растениях на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, а также в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Adamska et al., 2001). У высших растений белки, относящиеся к мультигенному семейству Elip, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane, Kloppstech, 2000).
Белки теплового стресса образуются у растений в условиях повышенной температуры окружающей среды. Низкомолекулярный белок Hsp32 играет существенную роль в устойчивости к тепловому стрессу и в процессах развития растений (Kruse et al., 1993).
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Перенос хлоропластных генов в ядро в процессе эволюции
В процессе эволюции часть своих генов пластиды передали ядру. Продукты этих генов они реимпортируют с помощью транзитных пептидов и механизма импорта белка, в результате чего белки остаются в органеллах, а соответствующие гены концентрируются в хромосомах клеточного ядра. Наличие всего двух окружающих мембран позволяет цитоплазматическим предшественникам белков проникать в эти органеллы. При этом происходит отщепление транзитных пептидов и освобождение процессированных полипептидов в строму. Аналогичные процессы характерны для митохондрий - клеточных органелл также эндосимбиотического происхождения. Четкие доказательства эндосимбиотического переноса генов были получены в последнее десятилетие (Martin, Herrmann, 1998). Пластиды содержат значительно больше белков, чем кодирует их ДНК. Из несоответствия между числом генов в хпДНК и числом белков, необходимых для функционирования пластид, следует, что эти органеллы импортируют огромное количество белков.
Сколько ядерных генов растений произошли от цианобактерий? Сравнительный филогенетический анализ геномов Arabidopsis thaliana и трех видов цианобактерий {Synechocystis РСС6803, Prochlorococcus marinus и Nostoc punctiforme) показал, что из 24 990 белков, кодируемых ядерным геномом Arabidopsis, 4500 белков (18%) кодируются генами, гомологичными цианобактериальным. Эти белки относятся ко всем функциональным классам и большинство из них поступает из клеточного ядра в различные компартменты клетки, но, главным образом, не в хлоропласты. Более того, в хлоропласты из ядра поступает множество белков нецианобактериального происхождения. Иными словами, нет строгой корреляции между происхождением гена и компартментализацией белка. Гены, полученные ядром от предка пластид, в ходе эволюции приобрели новые функции, которые часто не являются типичными для цианобактерий (например, устойчивость к патогенам, секреция белков и др.) (Martin et al., 2002). Гены 117 белков, кодируемых ядерным геномом Arabidopsis, еще встречаются в геномах хлоропластов высших растений и водорослей. У разных видов растений идентифицированы 44 хлоропластных гена, имеющих гомологов в ядре, по крайней мере, одного вида высших растений, что служит доказательством эндосимбиотического переноса генов в ядро у растений (Martin et al., 1998). Перенос генов - продолжающийся процесс. Не исключено, что через миллионы лет геномы клеточных органелл будут содержать еще меньше генов или их геном будет полностью ассимилирован ядерным геномом клетки. У амитохондриальных протистов обнаружены гидрогеносомы -органеллы, окруженные двойной мембраной, продуцирующие АТР. Они являются потомками тех же симбионтов, как митохондрии, однако лишены собственного генома. В этих органеллах процесс эндосимбиотического переноса генов завершился.
Предполагают, что первыми в ядро были перенесены гены белков с регуляторными функциями, а последними - гены структурных и ферментативных белков (Martin, Herrmann, 1998). Примерами могут служить субъединичные белки хлоропластов. Так, у-СЕ хлоропластной АТР-азы (atpC) выполняет в АТР-азном комплексе регуляторную роль. Гены структурных СЕ (atpA, atpB, atpE, atpFn atpH) обнаружены во всех секвенированных до сих пор хлоропластных геномах высших растений, в то же время регуляторная СЕ - atpC - у всех изученных растений кодируется ядром (atpC). Считают, что это был первый ген данного комплекса, который был перенесен в ядро. Тот же феномен наблюдается в случае хлоропластной АТР-зависимой протеазы - С1р. У изученных высших растений каталитическая СЕ - ClpP - кодируется хпДНК, в то время как регуляторная СЕ -ClpC - ядром. Каталитическая СЕ РБФК - rbcL - кодируется геномом пластид, а регуляторная СЕ - rbcS - ядерным геномом клетки. Это подтверждается также данными о том, что гены о факторов кора кодируемой пластидами РНК-полимеразы, участвующей в транскрипции пластидных генов, являются ядерными. Эти данные считают подтверждением общего явления: регуляторные гены сконцентрированы в ядре клетки (Martin, Herrmann, 1998).
Исследования структуры и функции хлоропластных геномов, начатые около полувека назад, были ускорены благодаря развитию таких методов, как клонирование генов и секвенирование ДНК, вошедших в практику молекулярно-биологических исследований в конце 70-х гг. Первоначальные усилия исследователей были направлены на анализ полной структуры хпДНК высших растений. Последовавший затем анализ хпДНК водорослей, особенно не относящихся к группе зеленых водорослей, позволил выявить ряд интересных особенностей эволюции хпДНК.
Организация геномов пластид подтверждает, что все пластиды произошли от одного вида цианобактерий. Однако детали эндосимбиотических событий остаются неясными. Разнообразные молекулярные маркеры, используемые в дополнение к большому числу морфологических и биохимических маркеров, позволяют воссоздать эволюционную картину происхождения пластид, детализировать этапы древней истории этих органелл. Очень перспективным подходом для решения таких задач является секвенирование геномов пластид фотосинтезирующих эукариот, в частности разных групп водорослей, которые сохранили больше черт цианобактериального генома, чем геномы пластид высших растений. Сравнительные исследования состава и особенностей структуры генов, кластеров генов, порядка их расположения, размера межгенных спейсеров и т.д. позволяют уточнять филогенетические связи между фотосинтезирующими организмами, реконструировать эволюционные события, приведшие к современным линиям водорослей и высших растений, более точно устанавливать время дивергенции видов.
Перенос генов из клеточных органелл в ядро включает участие отредактированного РНК-интермедиата. Как известно, в митохондриях и хлоропластах обнаружено пост-транскрипционное редактирование РНК (Одинцова, Юрина, 2000). Транспорт генов из органелл в ядро в типичных случаях подразумевает возвращение генного продукта к месту его функционирования и поэтому должен включать дупликацию органелльного гена, превращение ядерной копии гена в функционально активную, приобретение ядерного промотора и других регуляторних элементов, имеющих отношение к экспрессии, а также транзитной последовательности, направляющей генный продукт в определенный компартмент клетки. Предполагают, что в эволюции процесс переноса генов, направленный у всех эукариот от клеточных органелл к ядру, мог быть «запущен» механически и спонтанными мутациями (Palmer et al., 2000). У разных филогенетических групп в ядро были перенесены разные гены органелл. В результате геномы органелл современных организмов имеют различный, но перекрывающийся состав генов (Одинцова, Юрина, 2005). Таким образом, эукариотизм привел к перемещению и утрате значительного числа оргапелльных генов и к установлению ядерного доминирования в регуляции всех клеточных процессов (Herrmann, 1997; Blanchard, Lynch, 2000).
Сигнальная роль тетрапирролов у зеленых водорослей
Длительное время считали, что ядерные гены регулируются на уровне транскрипции, а гены хлоропластов - на пост-транскрипционном уровне. Оказалось, однако, что это слишком упрощенное представление. Экспрессия генов в живых организмах представляет собой сложный процесс, находящийся под контролем различных эндогенных и экзогенных факторов. Многоступенчатый процесс экспрессии начинается с транскрипции гена или оперона в пре-мРНК, которая затем процессируется в молекулу зрелой мРНК (путем сплайсинга и редактирования). Пул мРНК зависит от ее стабильности к деградации. Чтобы получить функционально активный полипептид, мРНК должна присоединиться к полисомам, затем должна начаться трансляция, пройти элонгация и правильно завершиться терминация. Обнаружено, что большинство стадий экспрессии гена строго регулируется ядром и хлоропластами.
Ядерные гены фотосинтеза подвергаются действию редокс-сигналов хлоропластов (рис.2), которые, таким образом, представляют собой новый класс пластидных сигналов (Oelmuller, 1989; Taylor, 1989; Golschmidt-Clermont, 1998). Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что редокс-регуляция генов фотосинтеза осуществляется на разных стадиях их экспрессии, что позволяет предположить наличие в клетке сложной сигнальной сети.
Анализ каждой стадии экспрессии (транскрипции, пула транскриптов, трансляции мРНК редокс-регулируемых генов и др.) у разных организмов позволит получить полную картину редокс-регуляции и понять молекулярную основу сети редокс-сигналов хлоропластов.
Изменения редокс-состояния компонентов фотосинтетической электрон-транспортной цепи, индуцированные окружающими условиями, действуют как сигналы, регулирующие экспрессию генов в хлоропластах (Pfannschmidt et al., 1999) и ряда генов в ядре. Таким образом, фотосинтез содержит важную информацию, необходимую для регуляции экспрессии ядерных генов, которая не воспринимается цитоплазматическими фоторецепторами. Хлоропласт сам служит сенсором изменений качества и количества света и таким образом может индуцировать физиологические реакции адаптации растений.
Все ядерные гены, контролируемые редокс-состоянием электрон-транспортной цепи хлоропластов, кодируют компоненты, либо непосредственно участвующие в фотосинтезе (рис. 2), либо связанные с такими функциями хлоропластов, как чувствительность к свету при развитии или защите от стресса. Поскольку хлоропласты участвуют во многих метаболических процессах клетки, существует, вероятно, множество других генов с редокс-зависимой экспрессией.
Первым примером редокс-регуляции экспрессии ядерных генов фотосинтеза явилась активация транскрипции гена LHCB1 в клетках зеленой водоросли Dunaliella, росших в условиях высокой интенсивности света, и помещенных в условия низкой освещенности (Escoubas et al., 1995). Этот механизм передачи сигнала был выяснен с помощью соединений, в разных местах ингибирующих электронный транспорт от ФСИ к комплексу цитохром b(Jf . Обработка клеток DCMU - специфическим ингибитором ФСП, привела к повышенной транскрипции гена LHC даже в условиях высокой освещенности. Напротив, частичное ингибирование окисления пластохинонов 2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-я-бензохиноном (DBMIB) приводило к снижению транскрипции при низкой интенсивности света. Эти результаты свидетельствуют о регуляторной роли редокс-равновесия пластидного пула пластохинонов (рис. 2).
Первоначально эту регуляторную систему рассматривали в качестве общего механизма адаптации фотосинтетического аппарата к изменениям интенсивности освещения и различным формам стресса, вызванным условиями окружающей среды. Однако у высших растений редокс-состояние пула пластохинонов выполняет, по-видимому, и некоторую регуляторную роль по отношению к ядерным генам. Пока показано только, что гены пластоцианина (PetE) и цитоплазматической аскорбат-пероксидазы табака, а также ген ELIP2 Arabidopsis реагируют на изменения его редокс-состояния (Yabuta et al., 2004). Транскрипция других изученных ядерных генов (генов, кодирующих компоненты ФСІ или нитратредуктазу), также связанных с фотосинтетическим транспортом электронов, вероятно не контролируется редокс-состоянием пластохинонов пластид. Скорее она контролируется разными редокс-системами (Beck, 2005). Исследования с DCMU и DBMIB, также как анализ мутантов с измененным цитохромным комплексом, показали, что редокс-сигналы, участвующие в регуляции вышеуказанных генов, возникают в электрон-транспортной цепи после комплекса be/f. Другим подобным примером является экспрессия гена LHCII, изученная у озимой ржи при разных световых и температурных режимах. В этом случае за редокс-изменениями в хлоропластах следили по фосфорилированию белка LHCII. Наблюдали корреляцию между фосфорилированием LHCII и уровнем мРНК гена LHCII. При этом никакой корреляции с редокс-состоянием пула пластохинонов не было (Pursiheimo et al., 2001). Эти данные подтверждают предположение о том, что редокс-сенсор находится в электрон-транспортной цепи после пула пластохинонов, играющих важную роль в регуляции ядерных генов (рис. 2). Они указывают также на различия в механизмах регуляции ядерных генов у зеленых водорослей и высших растений. Кроме регуляции транскрипции, редокс-сигналы хлоропластов могут контролировать экспрессию ядерных генов (Fed-l, PetE), регулируя стабильность мРНК (Sullivan, Gray, 2002). Механизм(ы), с помощью которого редокс-состояние тилакоидной мембраны передает сигнал ядру, мало понятен. Если сенсором служит пул пластохинонов, в передаче сигнала может участвовать каскад реакций фосфорилирования (Кулаева, Кузнецов, 2004). Опыты с ингибиторами протеин-фосфатаз позволили предположить, что в передаче сигнала могут участвовать фосфорилированные интермедиаты, т.к. добавление таких ингибиторов к культурам клеток водорослей препятствовало увеличению экспрессии гена LHC при низких интенсивностях света (Durnfold, Falkowski, 1997). Однако до сих пор не обнаружены молекулы-мессенджеры электрон-транспортной цепи после пластохинонов (Beck, 2005).
Пути передачи редокс-сигналов от хлоропластов к ядру неизвестны. Тем не менее, очевидна роль этих сигналов во внутриклеточных взаимодействиях. Они "сообщают" ядру о функциональном состоянии хлоропластов. В ядре эти редокс-сигналы (которые могут различаться у разных хлоропластов) интегрируются и преобразуются в единый сигнал, определяющий общую ответную реакцию ядра (например, через направленную экспрессию определенных генов). Продукты генов, локализованные в цитозоле, используются для нужд всей клетки, в то время как продукты генов, локализованные в хлоропластах, используются только пластидами, при этом каждый хлоропласт регулирует количество продукта, необходимое для его функционирования (например, путем регуляции импорта или сборки) (Pfannschmidt et al., 2005).
Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у NF-обработанных растений
С помощью вестерн-блот анализа клеточных экстрактов NF-обработанных и контрольных проростков ячменя определяли содержание пластидных белков ЕИр, Hsp32, Lhcbl и RbcS. Как видно из рис. 9, содержание белков Lhcbl и RbcS понижено у NF-обработанных проростков по сравнению с контрольными растениями. Наличие этих белков в хлоропластах фотоповрежденных проростков, вероятно, обусловлено белками, синтезированными до фотодеструкции (Susek et al., 1993). Содержание белков светового и теплового стрессов незначительно отличалось у NF-обработанных и контрольных растений. Однако у обработанных NF проростков ячменя обнаружено накопление дополнительных, более высокомолекулярных, белков как в случае белка теплового шока Hsp32, так и белка светового стресса ЕИр (рис. 9). Как видно из рис., при совместном действии фотоокислительного стресса, вызванного NF, и теплового стресса кроме зрелого Hsp32, обнаруживается дополнительный белок с молекулярной массой 36 кДа. В случае ЕИр кроме зрелого белка 13 кДа - белок с молекулярной массой 17 кДа (рис. 10).
Дополнительные белки обнаруживаются уже при 2-х часовом освещении проростков, причем их содержание возрастает при увеличении экспозиции на свету. Для количественной оценки накопления стрессовых белков в условиях интенсивного освещения растений была построена диаграмма (рис. 10). Как видно из диаграммы, в растениях, подвергнутых только тепловому стрессу, накапливается зрелый белок
Hsp32 (заштрихованные прямоугольники); его содержание возрастает с увеличением продолжительности освещения до 12 ч. Следовое количество белка с молекулярной массой 36 кДа также обнаруживается в этих препаратах, но содержание этого белка не изменяется в течение освещения. Иная картина наблюдалась в растениях, подвергнутых совместному действию теплового шока и окислительного стресса. Содержание дополнительного белка 36 кДа увеличивалось линейно вплоть до 24 ч экспозиции проростков на свету, тогда как содержание Hsp32 выходило на плато на ранних стадиях освещения (черные и серые прямоугольники, соответственно).
Разница в молекулярной массе основного и дополнительного белковых компонентов, а также тот факт, что оба белка дают иммунологическую реакцию с антителами к Hsp32 (рис. 9) позволила предположить, что более высокомолекулярный белок является предшественником Hsp32. Для того чтобы проверить это предположение, дополнительно были проведены пептидное картирование белков и опыты по действию удаления NF на накопление белка 36 кДа. С помощью метода пептидных карт было проведено сравнение основного и дополнительного белковых компонентов Hsp32 (рис. И). Для этого суммарные белки проростков, подвергнутых тепловому шоку или совместному действию теплового шока и NF и затем перенесенных на интенсивный свет на 24 ч, фракционировали при помощи электрофореза в ПААГ. Из неокрашенных гелей первого направления (использовали гели, подобные тем, блоты которых приведены на рис. 9) вырезали зону, содержащую белки с молекулярной массой 18-50 кДа, как описано в методах, помещали на верх геля второго направления, на который наслаивали раствор химотрипсииа. После электрофореза во втором направлении белки и образовавшиеся пептиды детектировали с помощью вестерн-блоттинга, используя антитела к Hsp32. На рис. 11 представлены результаты опытов по расщеплению белка Hsp32 и белка 36 кДа химотрипсином. В присутствии NF на электрофореграммах продуктов расщепления белка 36 кДа обнаружено четыре основных компонента. Три из них совпадают по электрофоретической подвижности с основными компонентами HSP32 из растений, не обработанных NF (рис. 11, двусторонние стрелки). Четвертое пятно с более высокой молекулярной массой представляет собой нерасщепленный до конца белок 36 кДа (рис. 11, пунктирная стрелка). Таким образом, получены сходные пептидные карты для зрелого белка Hsp32 и белка с молекулярной массой 36 кДа. 73
Это указывает на высокую степень гомологии между этими белками и доказывает наличие взаимосвязи предшественник-продукт. На основании этих результатов можно заключить, что в присутствии NF происходит накопление, по-видимому, предшественника Hsp32. Сходные результаты были получены при обработке этих белков протеазой V8.
Другой возможностью показать связь предшественник-продукт для Hsp32 и белка 36 кДа является доказательство того, что при удалении NF содержание дополнительного белка (предположительно предшественника) уменьшается. Эта возможность была исследована. Как следует из рис. 12, через 16 ч после удаления NF с помощью двукратной отмывки корней растений водой, содержание белка 36 кДа резко уменьшается. Тот факт, что обнаруживаются следовые количества этого белка, объясняется видимо неполной отмывкой корней от вермикулита, содержащего NF. Эти данные подтверждают, что белок 36 кДа является предшественником Hsp32.
На рис. 13 представлено действие NF на содержание вероятного предшественника другого стрессового белка пластид - ЕНр (13 кДа), кодируемого ядром и локализованного в тилакоидных мембранах. В этом случае также наблюдается накопление более высокомолекулярного белка с молекулярной массой 17 кДа. Процесс накопления дополнительных белковых компонентов в присутствии NF является обратимым. Эти белки практически исчезают при отмывке корней растений от NF. Наличие нескольких минорных белковых иммунодетектируемых зон, наблюдаемых на рис. 13, объясняется тем, что в растениях имеется семейство белков Elip.
На основании различий по молекулярной массе, иммунологического сходства, пептидного картирования, а также опытов по удалению NF нами был сделан вывод, что более высокомолекулярные белки, чем белки Hsp32 и ЕНр, соответственно, являются их предшественниками.
Регуляция экспрессии гена ЕНр редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи
Регуляция процессов жизнедеятельности растительной клетки мало изучена. Очевидно, однако, что координация экспрессии трех геномов эукариотической клетки: ядерного, пластидного и митохондриального, дистигается с помощью специфических сигналов. Ключевую роль при этом играет клеточное ядро.
Клеточные сигналы двунаправленны: они поступают от ядра к органеллам и от органелл к ядру. Существует также обмен сигналами между разными типами органелл (Raghavendra, Padmasree, 2003; Leister, 2005). Биогенез и функционирование органелл контролируются ядром с помощью множества сигналов. Существуют различные уровни контроля функций органелл ядром: 1. регуляция содержания транскриптов ядерных генов хлоропластных белков. Этот механизм касается контроля содержания многих белков хлоропластов (Kleffman et al., 2004); 2. регуляция пост-трансляционного поступления белков в хлоропласта и митохондрии с участием комплексов Tic/Toc и Tim/Tom, соответственно. Известны различные изоформы этих транслоконов с разной субстратной специфичностью, которые, вероятно, и создают тканеспецифичные протеомы пластид и митохондрий (Leister et al., 2004). Кроме того, импорт белков в хлоропласта, по-видимому, зависит от редокс-состояния органелл (Kuchler et al., 2002; Leister, 2005); 3. регуляция транскрипции, редактирования транскриптов, созревания мРНК и процессинга, а также трансляции кодируемых органеллами белков. В этих процессах участвуют ядерные факторы, обеспечивая ядерный контроль экспрессии органелльных генов. Согласно имеющимся данным регуляция экспрессии генов пластома и хондриома протекает, в основном, на пост-транскрипционном уровне (Leister, 2005); 4. пост-трансляционные процессы, такие как сборка белковых комплексов тилакоидных мембран или внутренней оболочки митохондрий. Эти процессы осуществляются при участии кодируемых ядром факторов сборки; 5. образование органелл (например, при делении) строго контролируется белками, кодируемыми ядром (Osteryoung, Nunnari, 2003).
Взаимодействие между ядром и органеллами включает антероградный (от ядра к органеллам) и ретроградный (от органелл к ядру) контроль. Антероградные механизмы координации экспрессии генов в хлоропластах и митохондриях являются рецепторами эндогенных и внешних сигналов, воспринимаемых ядром. Ретроградные механизмы регулируют экспрессию ядерных генов органелл в соответствии с их метаболической активностью и состоянием дифференцировки.
В настоящее время с помощью ингибиторного анализа и исследования мутантов обнаружены пять возможных путей передачи сигналов от хлоропластов к ядру (пять классов пластидных сигналов). Один из этих путей зависит от продукта (-ов) пластидного синтеза белков; второй - связан с синглетными формами кислорода; в третьем пути участвует перекись водорода, генерируемая хлоропластами; четвертый сигнальный путь контролируется редокс-состоянием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и в пятом - участвуют интермедиаты (и возможно белки) биосинтеза тетрапирролов (Beck, 2005). Эти пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с ядром.
В нашей работе мы попытались оценить участие трех из этих классов пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов стрессовых хлоропластных белков (ЕНр и Hsp32). Была исследована роль промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов, продуктов синтеза белков пластид и редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза в регуляции экспрессии этих генов у ячменя.
На первом этапе исследований была изучена экспрессия генов ЕНр и Hsp32 в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, что позволяет обнаружить действие пластидного сигнала. Маркерными генами служили ядерные гены белков фотосинтеза (Lhcb, RbcS), для которых доказана регуляция экспрессии с помощью пластидного сигнала. Показано, что в результате обработки растений NF, ингибитором фитоиндесатуразы, происходит фотодеструкция пластид: в них отсутствуют фотосинтетическая активность, тилакоидные мембраны и рибосомы. Однако ДНК и оболочка органелл повреждаются сравнительно мало. При сравнении экспрессии четырех ядерных генов - генов стрессовых белков пластид ЕНр и Hsp32 и генов белков фотосинтеза Lhcb и RbcS, в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, было обнаружено, что транскрипция генов белков фотосинтеза наиболее чувствительна к пластидному сигналу. На экспрессию ядерного гена хлоропластного белка теплового шока Hsp32 пластидный сигнал не оказывает действия: его транскрипция практически не отличается у NF-обработанных и контрольных растений. Поэтому можно говорить о том, что Hsp32 является геном, экспрессия которого относительно нечувствительна к пластидному сигналу. Уровень транскрипции гена Elip снижен у фотоповрежденных растений. Это указывает на то, что дифференцированные хлоропласты контролируют экспрессию данного гена. Наши результаты о регуляции экспрессии гена Elip согласуются также с представлением о том, что экспрессия ядерных генов регулируется функциональным состоянием пластид скорее непрерывно, чем дискретно по принципу «open-shut gate». Возможно, что различная чувствительность транскрипции изученных четырех генов к фотодеструкции хлоропластов отражает различия в регуляторных элементах промоторов соответствующих генов. Таким образом, хлоропласты принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip.
Обнаружено, что при фотодеструкции в хлоропластах ячменя кроме зрелых форм белков Elip и Hsp32 наблюдается накопление их предшественников. В этих условиях не обнаруживаются предшественники хлоропластных белков периферической антенны ФСІІ (Lhcbl) и СЕ рибулозобисфосфаткарбоксилазы (RbcS). Как показали результаты нашей работы, это может объясняться тем, что транскрипция генов стрессовых белков продолжается, а транскрипция генов белков фотосинтеза заблокирована. При окислительном стрессе, вызванном недостатком каротиноидов, частично нарушается импорт белков в хлоропласты, при этом предшественники белков накапливаются в оболочке пластид. Такой вывод следует из опытов по обработке изолированных пластид экзогенными протеазами (трипсином). По-видимому, N-конец стрессового белка находится в оболочке пластид, в то время как С-конец экспонирован снаружи и поэтому подвержен действию протеаз. У NF-обработанных и контрольных растений предшественники стрессовых белков связываются с сайтами транслокации оболочки хлоропластов, но у NF-обработанных растений реакция переноса частично нарушена.
Чтобы обнаружить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса Elip и содержанием тетрапирролов - предполагаемых сигнальных молекул, биосинтез которых локализован у высших растений в хлоропластах, использовали 2,2 -дипиридил. Этот ингибитор является хелатором железа, блокирует железосодержащий фермент оксидазу монометилового эфира Mg-протопорфирина IX, что приводит к повышению внутриклеточного содержания Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира. Дипиридил широко используется при изучении регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков. Обнаружено, что повышение содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Ме коррелирует с понижением экспрессии гена Elip .
