Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из главных направлений развития биохимии является изучение механизмов регуляции метаболических процессов, осуществляемых в живых организмах. Среди множества проблем данной области науки важное место занимает изучение ферментативных систем, их роли и механизмов действия при передаче и реализации генетической информации организма (Пинейру де Корвалью и др., 1991).
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) - фермент, имеющий практически универсальное распространение среди живых организмов. СДГ занимает ключевое положение в регуляции аэробного дыхания. Несмотря на то, что сукцинатдегидрогеназа из объектов различного происхождения хорошо изучена, исследование функционирования данного фермента из растений представляет особую значимость.
В последнее время усилился интерес к выявлению роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии генов. Данные о влиянии метилирования промоторов на инактивацию активности сукцинатдегидрогеназы человека и животных весьма многочисленны (Astuti et al., 2004; Cervera et al., 2009). Также в последнее время произошел значительный прорыв в понимании процесса метилирования ДНК у растений, особенно у Arabidopsis thaliana (Ванюшин, 2006), однако работ, посвященных выяснению механизмов эпигенетической регуляции функционирования генов, обеспечивающих энергетический метаболизм (в том числе и сукцинатдегидрогеназных генов) в растительных организмах, нами обнаружено не было.
Не до конца изученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение регуляции экспрессии генов субъединиц А и В изоферментов СДГ в растениях Arabidopsis thaliana и Zea mays.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ активности и изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в разных органах исследуемых растений;
-
Определить уровень транскрипции генов субъединиц А и В СДГ в онтогенезе арабидопсиса и кукурузы методом ПЦР в реальном времени, на основании результатов исследования установить генетическую детерминацию форм фермента;
-
Проанализировать нуклеотидный состав промоторов генов, кодирующих субъединицы А и В СДГ на наличие CpG-островков и разработать праймеры для метил-специфичной ПЦР;
-
Изучить роль метилирования промоторов генов sdh1-1 и sdh1-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы на уровень экспрессии этих генов при прорастании семян кукурузы и смене типов питания;
-
Определить действие красной (X = 640-680 нм и X =710-750 нм) и синей (X = 465-470 нм) части спектра на функционирование исследуемого фермента в листьях растений;
-
Выявить роль катионов кальция в трансдукции рецепторного сигнала фитохромной и криптохромной систем.
Научная новизна и значимость работы. Анализ нуклеотидного состава промоторов показал, что гены sdh1-1 и sdh1-2 кукурузы и гены sdhl- 2, sdh2-1 и sdh2-2 арабидопсиса имеют в составе промоторов CpG-островки, что обуславливает регуляцию работы данных генов за счет изменения степени их метилирования. Впервые обнаружена корреляция между уровнем транскрипции генов sdh1-1 и sdh1-2 и степенью метилирования их промоторов. При прорастании семян повышался уровень метилирования
промоторов генов sdh1-1 и sdh1-2, что играет важную роль в регуляции экспрессии исследуемых генов в тканях растений.
Показано, что экспрессия гена sdh1-2 в зеленых листьях Z.mays и A.thaliana находится под контролем фитохромной системы, при этом выявлена важная роль кальция как мессенджера фитохромного сигнала.
Полученные результаты расширяют и углубляют знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности.
Практическая значимость.
Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов сукцинатдегидрогеназных генов, впервые проведенный в работе, позволил синтезировать метил-специфичные праймеры, что открывает новые перспективы для их использования в научно-исследовательских лабораториях при изучении эпигенетического контроля за функциональным состоянием ферментных систем.
Полученные результаты по механизмам трансдукции фитохромного и криптохромного сигналов при различных условиях освещения открывают возможности для создания светильников на основе светодиодов, которые обладают оптимальными спектральными характеристиками и могут быть внедрены в практику выращивания растений в светокультуре.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Положения, выносимые на защиту.
1. В щитках и листьях кукурузы присутствуют конститутивные и индуцибельные формы сукцинатдегидрогеназы, что связано с ее
полифункциональностью (помимо участия фермента в функционировании ЦТК и комплекса II в ЭТЦ, СДГ осуществляет утилизацию сукцината в глюконеогенезе и обеспечивает каталитическое превращение сукцината в оксалоацетат - предшественник аспартата).
-
-
В геномах кукурузы и арабидопсиса субъединицы А и В сукцинатдегидрогеназы кодируются несколькими генами, характеризующимися дифференциальной экспрессией в разные периоды развития растения, то есть имеет место чёткая регуляция экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы при прорастании растений и их физиологическом переходе от органотрофного к автотрофному типу питания.
-
Метилирование CG-динуклеотидов промоторов генов сукцинатдегидрогеназного ферментного комплекса является механизмом регуляции экспрессии исследуемого фермента в прорастающих семенах кукурузы.
-
Функционирование сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях растений контролируется фитохромной системой, при этом катионы кальция, выступая в качестве вторичного мессенджера, обеспечивают трансдукцию фитохромного сигнала.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 12-ой, 13-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2008, 2009, 2010); Международной научной конференции «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва, 2010, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011); Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010г.); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва 2010); МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010г.); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011г.); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2009, 2010, 2011, 2012).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях - 7 статьях и 10 тезисах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (195 источников). Иллюстрационный материал включает 43 рисунка и 3 таблицы.
Похожие диссертации на Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L.
-
